應用液相色譜-高分辨離子軌道阱質譜法檢測人干血點中的睪酮酯

楊 聲，閆 寬，何根業(yè)，溫 超

（國家體育總局反興奮劑中心 興奮劑檢測實驗室，北京 100029）

睪酮是人體內分泌腺產生的內源性激素，在有機化學上屬于甾體激素的一種，能夠促進人體蛋白質的合成、提高肌肉力量和質量、促進骨髓造血、保持成年男性的雄性體征，對生殖系統(tǒng)也具有重要作用?；瘜W、制藥行業(yè)已發(fā)展出一大類蛋白合成雄性類固醇藥物（Anabolic Androgen Steroid，AAS）。AAS也是運動員和體育健身愛好者容易濫用的物質，早在1976年就被國際奧林匹克委員會（International Olympic Committee，IOC）和世界反興奮劑機構（World Anti-Doping Agency，WADA）禁用。在運動員被判興奮劑陽性的藥物中，AAS的陽性率高居首位，例如，WADA（2018）公布的統(tǒng)計數據表明，全球實驗室共檢測344 177例樣品，其中AAS（S1類）的陽性例數占全部禁用物質的43%，位居第一。因此，針對該類藥物的研究一直是反興奮劑領域的重要內容之一。

檢測AAS的主要方式是尿檢，即通過收集運動員的尿樣進行分析檢測。從尿樣中檢測AAS等甾體類藥物的主要技術是氣相色譜質譜聯(lián)用法（GC-MS），該方法至今已有近 50年的歷史（Halket，1993；Horning，1968；Shackleton，1986；Shackleton et al.，1968）。2011年起，世界各國反興奮劑實驗室陸續(xù)開始對GC-MS技術進行升級換代，采用氣相色譜-串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）技術檢測甾體類藥物（Eenoo et al.，2011），GC-MS/MS的靈敏度比GC-MS提高了一個數量級，可達到1 ng/mL的水平。

自2000年悉尼奧運會開始，采集血液樣本作為興奮劑的檢測方法相繼建立，例如，從血液中檢測促紅細胞生成素在興奮劑檢測中發(fā)揮著重要作用。2004年的雅典奧運會上，血液中檢測生長激素的方法首次在奧運會上使用。伴隨著科技的發(fā)展，越來越多的新技術應用到反興奮劑領域。2011年，德國實驗室率先采用干血點技術結合液質-高分辨聯(lián)用法檢測興奮劑藥物，該方法可以對多種睪酮的制劑藥物進檢測（Thomas et al.，2011，2012）。2019年3月，隨著WADA干血點國際合作項目的啟動，中國反興奮劑中心與IOC、WADA、美國反興奮劑機構（USADA）、德國科隆興奮劑檢測實驗室、日本東京興奮劑檢測實驗室等多個國際體育組織合作，成立了指導委員會和專家組，有力地推動了該技術在實際檢測中的應用。經過近兩年的研究，我國率先建立了干血點檢測方法，并通過ISO-17025質量管理體系的認可，將在2022年北京冬奧會、冬殘奧會上對各國運動員使用。

1 研究對象與方法

1.1 受試者招募與血液樣品采集

招募6名健康成年男性志愿者為研究對象，年齡24～40歲，體質量63～72 kg。對受試者一次肌肉注射0.25 g的十一酸睪酮注射液。在肌肉注射之前，留取受試者空白血液和尿液樣品，注射后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h留取血液樣本，之后每3天采集一次靜脈血。人體試驗的倫理申請已經國家體育總局反興奮劑中心倫理委員會批準（編號：201906），且受試者均已簽署知情同意書。

1.2 樣品處理方法

干血點樣品的制備：從靜脈血樣中吸取20 μL血液，滴到Whatman DMPK-C型濾紙卡上，每張濾紙卡滴4個血點，室溫下干燥2 h后制成備用。

樣品處理方法參考文獻并進行了一定改良（Forsdahl et al.，2013，Tretzel et al.，2014）。具體步驟為：剪取一片20 μL干血點樣品于玻璃試管中，加入50 μL D3-睪酮內標溶液（2 ng/mL）、1 mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液（pH值9.5）和1 mL甲醇溶液，用震蕩器混勻，然后加入4 mL叔丁基甲醚進行液液萃取，搖床震蕩10 min后進行離心，轉速4 000 rpm，離心4 min。取出上層有機相轉移至新試管中，使用55℃氮氣流吹干。用100 μL的甲氧胺溶液（10 mM）進行衍生化反應，80℃反應30 min，將樣品離心后（4 000 rpm，4 min）轉移至樣品瓶中，取10 μL進樣。

1.3 試劑

醋酸睪酮酯（CAS 1045-69-8）、丙酸睪酮酯（CAS 57-85-2）、苯甲酸睪酮酯（CAS 2088-71-3）、環(huán)戊丙酸睪酮酯（CAS 58-20-8）、苯丙酸睪酮酯（CAS 1255-49-8）、庚酸睪酮酯（CAS 315-37-7）、癸酸睪酮酯（CAS 5721-91-5）、十一酸睪酮酯（CAS 5949-44-0）均購自Sigma-aldrich公司。甲醇、叔丁基甲醚、甲酸均為HPLC級、氘代D3-睪酮購自Sigma-aldrich公司。甲酸銨為HPLC級試劑，購自Fluka公司。碳酸氫鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉購自國藥試劑公司。純水使用國產純水機制備（北京愛思泰克科技公司），純水電阻值大于18.0 MW。

1.4 儀器和參數設置

液相色譜-高分辨離子軌道阱質譜儀（Thermo Dionex Ultimate 3000 LC/Q Exactive Plus）和液相色譜柱[Thermo hypersil GOLDTM（100× 2.1 mm，1.9 μm）]均來自美國賽默飛公司。流動相A為水相，含10 mM甲酸銨（0.05%甲酸）水溶液。流動相B為有機相，為色譜級純度的甲醇（0.1%甲酸）。流速為0.25 mL/min。

流動相梯度：0～2 min，65%溶劑B；2～9.5 min，65%～100% 溶劑 B；9.5～13 min，100% 溶劑 B；13～15 min，100%～65%溶劑B。柱溫箱溫度為35℃。離子化模式為正離子采集。干燥氣流量為8 L/min（450℃）。離子傳輸管溫度為300℃，分辨率為17 500。質量偏差5 ppm以下。掃描模式為Full scan（50～750 m/z）和PRM模式。

2 實驗結果

衍生化前，幾種睪酮酯的分子離子的精確質量不同，但去掉甾環(huán)上17位上的側鏈后，都是一樣的睪酮分子，8種睪酮制劑的分子結構見圖1。睪酮的酯型藥物經過離子源在正模式采集下，分子發(fā)生裂解，分子離子為[M＋H]＋，同時二級質譜可獲得一些特征碎片離子，如97.064 8、109.064 8、253.194 7、289.215 5的碎片離子。這些碎片都是睪酮的甾環(huán)碎裂后形成的特征碎片。醋酸睪酮酯的特征碎片和質譜圖見圖2。

圖1 8種睪酮酯的分子結構Figure 1.The Molecular Structure of Eight Testosterone Esters

圖2 醋酸睪酮酯的質譜圖Figure 2.The Mass Spectrum of Testosterone Acetate

衍生化后，分子在A環(huán)的3位氧原子被甲氧胺的氮原子取代，形成肟的結構，再經過ESI離子源的裂解，原來m/z為97.064 8的離子成為了m/z為126.091 2的離子，而m/z為109.064 8的則轉變成m/z為138.091 0的特征離子碎片（圖3）。

圖3 衍生化后醋酸睪酮酯形成的E/Z型肟的質譜圖Figure 3.The Mass Spectrum of E/Z Isomers of Testosterone Acetate Oxime

2.1 檢測限

配制8種睪酮酯的對照品標準溶液1 mg/mL，逐級按10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL、0.25 ng/mL、0.125 ng/mL的濃度梯度進行稀釋，然后添加到空白全血中，按樣品提取方法進行處理，經液相色譜-高分辨離子軌道阱質譜儀分析后，根據特征離子的色譜圖信噪比＞3估計檢測限。本研究中，十一酸睪酮酯的檢測限為0.3 ng/mL，其他7種睪酮酯的檢測限為0.1 ng/mL，與文獻報道結果接近（Forsdahl et al.，2015）。

2.2 提取回收率

取睪酮酯的標準品溶液，分別稀釋成10 ng/mL、5 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL的濃度，一份添加50 μL內標溶液（D3-T）到10個空白全血中提取后備用；另一份添加50 μL內標溶液后，直接使用初始流動相復溶，分別進樣后計算提取回收率。結果顯示，各濃度的回收率在50%～86%。

2.3 日內和日間精密度

實驗的日內精密度經測定小于15%。日間精密度連續(xù)測定3天，日間精密度為12%～25%。說明樣品會隨著時間的推移而部分降解，因此，在實驗過程中樣品制備完畢后應及時進行檢測。

2.4 應用于人體試驗后血液樣品的檢測情況

采用本實驗建立的方法對受試者服用睪酮十一酸酯0.25 g后，取干血點樣本20 μL（1個血點）進行檢測，結果可以檢測到睪酮十一酸酯的原型藥物，并且在停用藥物后7～14天仍能被檢測到。實驗結果可以作為使用了外源性睪酮類興奮劑的直接證據。

3 討論

3.1 干血點技術的特點

干血點是一種血樣的保存方式的統(tǒng)稱，是將外周血液標本（新生兒的腳跟、成人指尖或者耳垂等部位采集到的少量血液）保存到濾紙片上，干燥后用于臨床疾病篩查、藥理研究、藥物代謝研究的方法統(tǒng)稱。該技術起源于20世紀60年代，由美國微生物學家Robert Guthrie于1963年為篩查新生兒遺傳病——苯丙酮尿癥所創(chuàng)立（Scriver，1998）。它的特點是取樣創(chuàng)傷小，采取血液樣本，只需干燥，對樣品的保存溫度沒有特殊要求，但低溫（-20℃）干燥環(huán)境將延長樣品的保存期限。對樣品采集人員的性別也沒有要求，而且對運動員的隱私也進行了最大程度上的保護，因此是運動員容易接受的一種采樣方式。

3.2 干血點技術的難點

睪酮根據來源可分為內源性睪酮和外源性睪酮，內源性睪酮即人體細胞分泌的睪酮，外源性睪酮即人工制藥合成的睪酮制劑。當外源性睪酮進入人體后，如何與自身的睪酮進行區(qū)分充滿難度。首先，如何發(fā)現(xiàn)體內的睪酮增多就是一個難題。睪酮的分泌與種族、年齡、性別、遺傳等因素有關，并且存在個體差異，有學者建立了部分人群血清睪酮正常值的參考范圍，但反興奮劑檢測多采用尿檢，測定的是尿樣中的睪酮，血清中的值只能作為參考。常規(guī)的檢測方法是通過測定一系列內源性睪酮代謝物的濃度和比值，如5α-雄烷二醇、5β-雄烷二醇、雄酮、本膽烷醇酮等，與已經建立的人群參考值進行比較，找出濃度指標、代謝物之間濃度比值異常的可疑樣本后，再借助同位素比質譜技術進行確證，才能準確區(qū)分內源性和外源性睪酮。

同位素比質譜技術可以測定睪酮分子中的碳原子的同位素比值（13C/12C），從分子的同位素構成上顯示出差異（Becchi et al.，1994），它的原理是用于人工合成睪酮的化學原料的碳元素與人體通過食物攝入的含碳化合物存在差異。但該方法也存在一些不足，例如，檢測靈敏度不如干血點法，其次，如果采用植物甾醇提取的原料來合成睪酮，就很難發(fā)現(xiàn)碳元素分布上的差異。

血漿中存在一種酯酶，可以將進入體內的睪酮制劑水解，轉變成跟人體分泌的睪酮一樣的形式，因此難以被檢測到。干血點技術是一種直接檢測睪酮酯的方法，其優(yōu)勢在于巧妙地通過使血液脫水后干燥，降低了血漿中的酯酶活性，甚至使酯酶失去活性，使得微量的樣品中仍然有完整的睪酮制劑分子，一旦被檢測到，可以肯定其使用了外源性睪酮制劑。

3.3 干血點技術可檢測的藥物種類

干血點是一種血樣的保存方式，因此不僅睪酮類興奮劑可以通過該方法進行檢測，其他種類的興奮劑，如刺激劑甲基麻黃堿（Kojima et al.，2016）、麻醉劑（Verplaetse et al.，2015）、鎮(zhèn)痛劑曲馬多（Luginbühl et al.，2020）、糖皮質激素、小肽類（Lange et al.，2020）、促紅細胞生成素（EPO）和生長激素（GH）等可用干血點技術進行檢測（荊京等2021；Yuan et al.，2021）。然而，由于現(xiàn)行的 WADA 規(guī)定中，僅對尿樣中特定刺激劑的結果判定有閾值方面的要求，對于干血點的濃度閾值如何判定還在討論中。未來隨著研究的不斷深入與完善，系統(tǒng)的干血點技術體系將逐漸建立。

3.4 睪酮酯衍生化后形成的E/Z型肟的結構推測

睪酮酯分子中含有羰基與甲氧胺在甲醇溶液中可以發(fā)生反應，生成的產物在有機化學上叫做肟。由于構型上存在E/Z異構體，根據WADA的要求（WADA，2021），需要做進一步的鑒定。通過一系列的實驗觀察，發(fā)現(xiàn)采用不同溫度、日光照射、甚至室溫條件下放置，均能形成E/Z型的睪酮酯的肟產物，區(qū)別只是產率不同。本研究中的色譜分離條件，比文獻中的分離度更優(yōu)。例如，有研究雖然提到反應形成了E/Z型異構體，但沒有進一步對異構體進行鑒定；而且文獻中采用的液相分離條件也無法實現(xiàn)基線分離（Gray et al.，2011）。因此，建議采用羥胺試劑而非甲氧胺進行衍生化，使色譜分離時的E/Z兩個異構體在色譜圖上呈現(xiàn)一個合并的“單峰”形式（Forsdahl et al.，2013）。也有文獻中顯示出不完全的分離效果，色譜峰呈現(xiàn)肩峰特征（Tretzel et al.，2014）。有研究報道，實現(xiàn)了睪酮酯的基線分離，但內標物質氘代睪酮的肟卻仍然是一個單峰（Gray et al.，2011），說明還有改進的余地。而本研究可以做到氘代睪酮肟的E/Z異構體的分離，雖然它的17位上只是一個羥基，沒有長的側鏈，色譜圖上仍可顯示出雙峰特征。

根據有機化學中立體化學與光化學反應的有關理論（邢其毅等，1983），在反應生成的機理上，熱力學上容易生成的結構較多為E型，而Z型由于空間構型上不利于形成而占比較少。因此做出以下推斷，Hypersil GOLDTM色譜柱采用水-甲醇為流動相時，色譜圖上保留時間早、豐度較小的色譜峰為Z型睪酮酯的肟產物，保留時間晚、豐度較大的色譜峰為E型睪酮酯的肟產物（圖4、圖5）。由于本研究是從色譜-質譜技術上進行結構推斷的異構體，其可靠性還有待其他波譜學技術的驗證。

圖4 8種睪酮酯的提取離子色譜圖Figure 4.The Extracted Ion Chromatogram of Eight Testosterone Esters

圖5 衍生化后睪酮酯肟的E/Z構型Figure 5.E/Z Configuration of Testosterone Ester Oxime

4 結論

本實驗方法不僅適用于血液樣品的檢測，也適用于保存在濾紙片上的干血點樣品的檢測。該檢測方法靈敏、快速。使用了十一酸睪酮的受試者的血液樣本，在停用后7～14天仍可檢出十一酸睪酮酯的原型，因此，為控制睪酮類藥物制劑的濫用提供了可靠的檢測方法。本研究采用液相色譜技術實現(xiàn)了8種睪酮酯的肟化產物的同分異構體的基線分離，并首次對E和Z型異構體進行了結構推測，可以滿足WADA的相關要求。干血點技術作為常規(guī)尿檢、血檢的重要補充手段，使得對外源性睪酮酯的檢測又多了一項新技術。