溫陽散纖湯對博來霉素誘導的小鼠肺間質(zhì)纖維化的保護作用

朱曉龍，邱念念，狐啟貴

（貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸科，貴州 貴陽 550001）

特發(fā)性間質(zhì)肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種由多種原因引發(fā)的以兩肺彌漫性間質(zhì)纖維化為特征的疾病，導致患者彌散功能降低，最終心肺功能衰竭致死[1]。IPF發(fā)病率呈上升趨勢，且致死率高，無有效根治措施，成為全球共同關注的醫(yī)學熱點問題。祖國醫(yī)學將IPF歸為“肺痹”“肺痿”范疇，認為其為本虛標實之證，痰濁、瘀血為其病理因素[2-3]。有研究顯示，以溫陽為主治療IPF療效顯著[4]，本研究探討溫陽散纖湯對博來霉素誘導的小鼠肺間質(zhì)纖維化的保護作用，旨在為臨床治療特發(fā)性間質(zhì)肺纖維化提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 105 只C57BL/6 小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑與儀器 溫陽散纖湯（廣東一方制藥有限公司，批號：0139573621629）；鹽酸博來霉素（北京索萊寶科技有限公司，批號：801G023）；甲基潑尼松龍（MACKLIN，批號：C10125981）；顯微鏡(CX41，OLYMPUS)。

1.3 動物造模、分組及給藥[5]75只小鼠制作成實驗模型：小鼠4%水合氯醛麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，頸部剃毛并用碘氟消毒后，沿頸部正中做1 cm切口，鈍性分離氣管前組織暴露氣管，然后迅速向小鼠氣管內(nèi)注入5 mg/kg博來霉素0.2～0.3 mL，注射后使小鼠直立并左右旋轉(zhuǎn)，以使博來霉素在肺組織內(nèi)均勻分布，最后在無菌條件下縫合皮膚。另取15只小鼠以同樣方法向氣管內(nèi)注入0.3 mL 0.9%氯化鈉溶液溶液，為假手術(shù)組。將造模成功小鼠隨機分為5 組，即模型組，“溫陽散纖湯”低、中、高劑量組，陽性組，另外設正常對照組（無任何外界刺激處理），每組15 只。溫陽散纖湯組在造模后第2天，每天以5.663、11.325、22.650 g生藥/kg小鼠體質(zhì)量灌胃，陽性組以甲強龍15 mg/kg小鼠體重腹腔注射，每天1次，共4周。正常對照組、假手術(shù)組及模型組灌以等體積的0.9%氯化鈉溶液，每天1 次，共4 周。實驗結(jié)束后取小鼠左肺組織用于HE染色實驗。

1.4 HE 染色 取出組織流水沖洗數(shù)小時，經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置15 min（至透明為止）。石蠟包埋，切片。將石蠟切片進行烤片，然后脫蠟，水化。將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返藍液返藍15 s，流水沖洗，伊紅染色，流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 模型建造并分組取樣 C57BL/6肺間質(zhì)纖維化小鼠模型構(gòu)建成，見圖1。

圖1 小鼠造模圖Figure 1 Model drawing of mice

2.2 HE 染色檢測各組小鼠肺組織病理變化 正常組小鼠肺間隔正常，無炎癥因子浸潤；假手術(shù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)與正常組類似；模型組小鼠肺間隔增寬，肺泡結(jié)構(gòu)被破壞、肺泡炎癥明顯，大片炎癥細胞浸潤；溫陽散纖湯低、中、高劑量組小鼠肺間隔厚度有所改善，炎癥反應減弱，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整；陽性組小鼠結(jié)構(gòu)肺間隔厚度正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整度較好，炎性細胞浸潤程度低，見圖2。

3 討論

圖2 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）Figure 2 Pathological changes of lung tissue in each group(He staining,×200)

中醫(yī)藥能有效改善IPF 患者臨床癥狀，降低患者死亡率，并提高患者生存質(zhì)量。溫陽散纖湯是本研究的臨床經(jīng)驗方，以補骨脂、熟地黃、黃精、淫羊藿、黃芪、麥冬為主方，具有補益肺腎，扶正固本，養(yǎng)陰生津之功效，再佐以川芎丹、參當、歸地龍，兼具活血化瘀通脈之療效，諸藥合用，共奏益肺活血、納氣平喘，扶正祛邪之功效。以往研究顯示，此方劑中單藥對肺纖維化具有顯著改善作用，如黃芪甲苷可通過降低VEGF、VEGFR2 基因表達水平，發(fā)揮抗肺纖維化作用[6]。黃芪糖蛋白抑制小鼠肺纖維化的發(fā)展，其作用機制可能與降低肺組織中TGF-β1表達有關[7]。地龍可通過與靶蛋白TGF-β1結(jié)合從而抑制α-SMA 的表達以延緩肺纖維化進程[8]。地龍通過抑制NF-κB 活性，下調(diào)TGF-β1 表達，抑制膠原合成進而抑制博來霉素誘導的大鼠IPF[9]。丹參酮ⅡA通過iNOS通路調(diào)控下游炎性因子釋放，從而緩解小鼠肺纖維化[10]。提示復方中藥對于IPF小鼠具有改善作用。

IPF主要經(jīng)歷3個階段：早期機體啟動炎癥/免疫反應階段，多種致病因素損害肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞；中期階段，多種炎癥細胞浸潤并釋放大量炎癥因子，加重組織損傷，并引發(fā)肺間質(zhì)增生；晚期階段，大量成纖維細胞生成、膠原聚集、細胞外基質(zhì)代謝紊亂并以反饋形式加重炎癥反應，導致肺泡正常結(jié)構(gòu)功能被異常的修復重建。

綜上所述，抑制肺組織炎癥反應對于肺纖維化的改善具有重要意義，溫陽散纖湯能顯著抑制肺組織炎癥反應，進而改善IPF小鼠肺組織結(jié)構(gòu)與功能。