鈦鉭生物梯度材料在成骨過(guò)程中對(duì)堿性磷酸酶的影響

姜銘坤，何亞茹，吳文慧

（1.華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；2.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 唐山 063000）

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高和醫(yī)療科技的高速發(fā)展，生物材料領(lǐng)域受到廣泛重視。鈦及鈦合金材料具有力學(xué)性能良好、彈性模量低、易加工、抗腐蝕和生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于人工骨、人工關(guān)節(jié)、骨釘、牙種植體等硬組織替代材料和心臟瓣膜、血管支架等血管材料[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，材料植入體內(nèi)后，會(huì)與骨組織結(jié)合[2]。由于鈦表面存在氧化層，限制其與骨組織間形成理想的結(jié)合而具有生物惰性，影響植入體在體內(nèi)的長(zhǎng)期性；同時(shí)，復(fù)雜的人體內(nèi)環(huán)境會(huì)腐蝕金屬材料從而導(dǎo)致有毒元素釋放[3]，生物相容性降低。因此，可在保留其原有優(yōu)點(diǎn)的前提下，對(duì)鈦及鈦合金進(jìn)行表面改性，有利于提高其多種性能，如生物相容性、抗菌性等，改善植入體的功效，延長(zhǎng)植入體的使用壽命。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是從哺乳動(dòng)物的骨髓基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種可分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的細(xì)胞亞群，研究其成骨方向的分化有重要意義。目前，BMSCs成骨分化的檢測(cè)指標(biāo)有多種，其中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤(pán)等組織中的一種酶，在成骨過(guò)程中成骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)時(shí)會(huì)分泌大量的ALP，是觀察成骨情況最直觀、有效的檢測(cè)指標(biāo)之一[4]?；诖耍狙芯窟x取光滑鈦片、經(jīng)酸蝕水熱處理的鈦片、經(jīng)酸蝕水熱處理后等離子噴涂鉭的鈦片作為研究對(duì)象，旨在探討鈦鉭生物梯度材料在成骨過(guò)程中對(duì)堿性磷酸酶的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取光滑鈦片（光滑純鈦組）、經(jīng)酸蝕水熱處理的鈦片（酸蝕水熱組）、經(jīng)酸蝕水熱處理后等離子噴涂鉭的鈦片（鉭噴涂組）作為研究對(duì)象，其中鉭噴涂組作為實(shí)驗(yàn)組，光滑純鈦組、酸蝕水熱組作為對(duì)照組，上述材料均由華北理工大學(xué)材料學(xué)院提供。

1.2 主要試劑和儀器 SD 大鼠第三代BMSCs（華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供），磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司），ALP 試劑盒（南京建成），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma，美國(guó)），低速離心機(jī)（SC—3610，安徽），平底24、96 孔培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)），酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.3 方法 將3 組鈦片置于24 孔板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種密度為2×104/孔。培養(yǎng)3、5、7 d 后，收集上清液，12 000 r/min離心15 min，取上清液并采用ALP試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。①標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：試劑盒中的酶標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用雙蒸水稀釋?zhuān)謩e稀釋 50 倍、20 倍、10 倍、5 倍、2.5 倍、5/3倍和1.25 倍，每孔5 μL。加入緩沖液、基質(zhì)液及顯色劑250 μL，反應(yīng)15 min后使用酶標(biāo)儀在520 nm下檢測(cè)OD值，繪制ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)備用。②測(cè)定各組ALP活性：實(shí)驗(yàn)組于96孔板中每孔加入30 μL上清液，并加入緩沖液、基質(zhì)液和顯色劑共250 μL；空白組加入30 μL 雙蒸水，并加入緩沖液、基質(zhì)液和顯色劑共250 μL。反應(yīng)30 min 后酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)520 nm下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算ALP的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“”表示，采用單因素方差分析，組間比較采用F檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

第3 天，鉭噴涂組與酸蝕水熱組ALP 水平均明顯高于光滑純鈦組；第5 天，鉭噴涂組ALP 水平高于酸蝕水熱組；第7天，酸蝕水熱組與鉭噴涂組ALP 水平差異縮小，但鉭噴涂組仍高于酸蝕水熱組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 試件表面細(xì)胞ALP活性（金氏單位/100 mL）Table 1 Surface cell ALP activity(Kim's unit/100 mL)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞分化[5]。實(shí)驗(yàn)研究表明，BMSCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，復(fù)合以適當(dāng)?shù)牟牧夏墚愇怀晒?、修?fù)骨缺損，且不存在免疫排斥反應(yīng)，是具有廣闊應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[6]。目前，BMSCs 成骨分化的檢測(cè)指標(biāo)有多種，其分化形成的成骨細(xì)胞分泌一種糖蛋白，即堿性磷酸酶是早期礦化的標(biāo)志，通過(guò)檢測(cè)ALP 的活性，可反映不同鈦片材料對(duì)成骨分化的影響。

純鈦應(yīng)用于口腔種植體時(shí)，具有良好的生物相容性、抗腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在生物活性較低、骨整合周期長(zhǎng)等不足。因此，人們對(duì)其進(jìn)行改性處理，為提高純鈦表面的生物活性，縮短骨整合周期[7]。上述方法涉及物理、化學(xué)、生物化學(xué)等幾大學(xué)科，具體有噴涂、大顆粒噴砂酸蝕（SLA）、等離子噴涂、濺射、離子注入、激光處理、紫外線(xiàn)處理、酸蝕處理、堿熱處理、陽(yáng)極氧化法、生物活性因子或仿生劑等內(nèi)容，從微米水平的研究，逐步深入到納米、微納米級(jí)別。

本研究采用3組鈦片，其中酸蝕水熱處理組結(jié)合酸蝕處理和堿熱處理兩種方法。首先，使用HF和HNO3 兩種酸性溶液1∶1 混合雙重酸蝕的方法，形成微納結(jié)構(gòu)，具有微觀的粗糙面，即可增加細(xì)胞與材料表面的接觸面積，又可提高細(xì)胞材料表面的穩(wěn)定性。然后，對(duì)鈦片進(jìn)行堿熱處理，浸入仿生體液（SBF）。Lenka Joná?ová 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NaOH 處理的鈦片再浸入SBF 后，可在表面形成碳酸氫鹽-磷灰石層（HCA），但不均勻，而經(jīng)酸蝕處理的純鈦片可形成均勻的微觀粗糙面，促進(jìn)HCA形成，再經(jīng)過(guò)堿化處理，磷灰石晶核形成均勻，沉積的HCA 厚度會(huì)隨著時(shí)間而增加[9]。結(jié)合兩種處理方法的鈦片表面，兼有微米級(jí)孔和納米級(jí)結(jié)構(gòu)，具有更高的粗糙度，促進(jìn)骨生成作用較強(qiáng)[10]。

等離子噴涂是一種材料表面強(qiáng)化、表面改性的技術(shù)，可使基體表面獲得耐磨、耐蝕、耐高溫氧化、電絕緣、隔熱、防輻射、減磨和密封等性能。當(dāng)其應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域時(shí)，可在人造骨骼表面噴涂一層10 μm 左右涂層，作為強(qiáng)化人造骨骼，加強(qiáng)親和力的方法。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可作為涂層制備方法，用于種植體的表面改性[11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)等離子噴涂羥基磷灰石（HA）進(jìn)行較多的研究報(bào)道和臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有無(wú)毒無(wú)害、耐腐蝕、耐磨耗、力學(xué)性能優(yōu)良等特點(diǎn)，也存在包括涂層表面不均勻，涂層內(nèi)含有雜質(zhì)，涂層易出現(xiàn)裂隙，涂層密度不夠，界面被腐蝕后易脫落等問(wèn)題[12]。

金屬鉭（Ta）具有機(jī)械性能良好、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已成為重要的現(xiàn)代功能性材料，被稱(chēng)為“貴族金屬”。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，鉭金屬因耐腐蝕性和生物相容性的特點(diǎn)，引起了醫(yī)療和材料工作者的關(guān)注，在醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如外科手術(shù)材料、顱骨修補(bǔ)、血管縫合等。特別是鉭涂層，可提高金屬鈦的骨整合性能，增加細(xì)胞的粘附能力從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，使金屬鈦獲得更高的表面能和更好的潤(rùn)濕性，改善細(xì)胞與植入材料間的相互作用。

綜上所述，3組不同處理鈦片表面的ALP水平存在差異，鉭噴涂組高于酸蝕水熱組、光滑純鈦組，說(shuō)明鈦鉭生物梯度材料有利于成骨，能提高ALP活性。這種新型鈦片處理方法存在哪些不足、需要如何改進(jìn)、能否推廣使用，有待于今后進(jìn)一步研究。