R2A培養(yǎng)基的應(yīng)用及有效期的驗(yàn)證

馬樂(lè)，張博，劉元崢，苗靜，高志國(guó)，薄曉菲

（北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 100176）

R2A瓊脂培養(yǎng)基是一種檢測(cè)飲用水中微生物總數(shù)的培養(yǎng)基，具有低濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用較低的培養(yǎng)溫度和較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間來(lái)刺激受損和耐氯微生物的生長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基等營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，適合培養(yǎng)快速生長(zhǎng)的微生物，但可能會(huì)抑制部分生長(zhǎng)緩慢或受損的微生物。與這些培養(yǎng)基相比，R2A瓊脂培養(yǎng)基更有利于水中受損和耐氯微生物的生長(zhǎng)[1]。本文通過(guò)對(duì)R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿有效期的驗(yàn)證，證明該培養(yǎng)基平皿在規(guī)定時(shí)間和貯存條件下，產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性適合生產(chǎn)所需。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所。注射用水，磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 6.86）、硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 9.18）、氯化鈉、過(guò)濾器與濾膜由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基干粉、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基干粉由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。R2A瓊脂培養(yǎng)基干粉由美國(guó)BD公司提供。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基干粉由北京奧博星公司提供。

XG1.G型脈動(dòng)真空蒸汽滅菌柜，山東新華有限公司；PHS-3D pH計(jì)，上海三信有限公司；ES-122P電子天平，北京湘平有限公司；masterclave 60培養(yǎng)基制備器、APSone90培養(yǎng)基分裝機(jī)，購(gòu)自于法國(guó)梅里埃生物公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基平皿的制備

（1）R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿。取18.5 g R2A瓊脂培養(yǎng)基干粉和1 000 mL注射用水置于培養(yǎng)基制備器中，執(zhí)行121 ℃高壓滅菌15 min的程序，待降溫至42 ℃后在潔凈度以C+A的環(huán)境下（且符合該級(jí)別環(huán)境要求），連接培養(yǎng)基分裝器分裝平皿，測(cè)得培養(yǎng)基pH值在7.2±0.2的合格范圍內(nèi)待用。

（2）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿。取30 g 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基干粉加熱溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值7.2±0.2，在潔凈度以C+A的環(huán)境下（且符合該級(jí)別環(huán)境要求）傾倒平皿，經(jīng)無(wú)菌驗(yàn)證及pH測(cè)定合格后待用[2]。

（3）玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿。稱取玫瑰紅鈉培養(yǎng)基干粉，加熱溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值6.0±0.2，將培養(yǎng)基置于潔凈度以C+A的環(huán)境下（且符合該級(jí)別環(huán)境要求）傾倒平皿，經(jīng)無(wú)菌驗(yàn)證及pH測(cè)定合格后待用。

（4）0.9%氯化鈉溶液。將9 g NaCl溶于1 000 mL注射用水，攪拌溶解后除菌過(guò)濾，121 ℃高壓滅菌40 min后待用。

（5）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿。稱取沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基干粉，加熱溶解于注射用水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值5.6±0.2，置于潔凈度以C+A的環(huán)境下（且符合該級(jí)別環(huán)境要求）傾倒平皿，經(jīng)無(wú)菌驗(yàn)證及pH測(cè)定合格后待用[2-3]。

1.2.2 菌懸液制備與菌種接種

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；將白色念球菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h。以上菌種均需進(jìn)行兩代傳菌后，用0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 CFU的菌懸液備用。將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，進(jìn)行兩代傳菌后的新鮮培養(yǎng)物加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將胞子洗脫；然后，吸出胞子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含胞子數(shù)小于100 CFU的胞子懸液[3]。

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌制備成的菌懸液接種在R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，置30～35 ℃溫房培養(yǎng)48 h后對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將白色念球菌與黑曲霉制備成的菌懸液接種在R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上，置23～28 ℃溫房培養(yǎng)72 h后對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每種菌各接種10個(gè)平皿計(jì)數(shù)。因黑曲霉菌落為片狀，無(wú)法在培養(yǎng)皿中計(jì)數(shù)，故用培養(yǎng)基平皿接種黑曲霉后的生長(zhǎng)狀態(tài)照片來(lái)說(shuō)明情況。

1.2.3 薄膜過(guò)濾法對(duì)工藝用水微生物的限度檢查

在理化指標(biāo)上，注射用水（＜10 CFU/100 mL）對(duì)微生物要求要高于純化水（＜100 CFU/mL），故本次實(shí)驗(yàn)選取注射用水進(jìn)行微生物限度檢查，取已高壓蒸汽滅菌的0.25 μm孔徑的濾膜（直徑47 mm）、過(guò)濾器，將濾膜放在網(wǎng)盤(pán)上，組裝好濾器。將200 mL注射用水經(jīng)濾器過(guò)濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于R2A、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上各5塊，置于30～35 ℃培養(yǎng)房中倒置培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)濾膜上的菌落數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)為逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平皿不計(jì)數(shù)），計(jì)算菌落檢出率并制表分析。

1.2.4 對(duì)R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿進(jìn)行培養(yǎng)基有效期的驗(yàn)證

連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)批次的R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿，命名為 201703S001、201703S002、201703S003，每批次分別在0 d、30 d、60 d、90 d、100 d各取樣50塊進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。如遇節(jié)假日，取樣可在計(jì)劃時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的±2 d施行。整個(gè)存放時(shí)間內(nèi)，R2A瓊脂培養(yǎng)基存放環(huán)境的溫度應(yīng)控制在18～25 ℃。檢定項(xiàng)目為培養(yǎng)基pH值、外觀、適用性（靈敏度）和無(wú)菌性檢查。平皿質(zhì)量合格體現(xiàn)在4個(gè)參數(shù)上。（1）適用性：要求備檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不少于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%；（2）pH值：滅菌后的pH值為7.2±0.2；（3）平皿外觀：無(wú)破裂，無(wú)裂紋，無(wú)明顯氣泡，無(wú)瓊脂凝塊；（4）無(wú)菌性：無(wú)染菌，無(wú)微生物生長(zhǎng)。如在第100 d時(shí)樣品檢定時(shí)能達(dá)到以上的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，則將R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿的有效期規(guī)定為90 d。

適用性檢查：接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，經(jīng)兩代傳菌后，將上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液制成100 CFU/mL的菌懸液，備用。將兩種菌種稀釋好的菌懸液0.1 mL接種于實(shí)驗(yàn)組的待檢培養(yǎng)基平皿和對(duì)照組的R2A瓊脂培養(yǎng)基上，然后用L-棒涂抹均勻，放置于30～35 ℃培養(yǎng)房中培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。

pH值的測(cè)定：對(duì)操作間溫度及pH計(jì)進(jìn)行兩點(diǎn)法校正后，用純化水充分洗滌電極，吸盡水分，將pH電極頭插入樣品中，顯示值穩(wěn)定后讀取pH值。

回收率計(jì)算：根據(jù)公式（1）計(jì)算回收率。

平皿外觀與無(wú)菌性觀察：將所生產(chǎn)平皿按比例（50∶1）進(jìn)行留樣外觀及無(wú)菌性檢查，放于20～25 ℃培養(yǎng)房中倒置培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌落生長(zhǎng)，平皿外觀無(wú)菌性的結(jié)果由所拍攝的平皿樣品照片來(lái)表示。

1.3 重復(fù)性

用以上方法進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)適用性檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 適用性檢查

由表1可知，R2A培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在接種銅綠假單胞菌與大腸埃希菌的3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有顯著差異（P≤0.05），接種在R2A培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均數(shù)高于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，說(shuō)明R2A培養(yǎng)基在接種銅綠假單胞菌與大腸埃希菌的菌落長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；R2A培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基接種金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明R2A培養(yǎng)基接種金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的菌落長(zhǎng)勢(shì)等同于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。綜上所述，R2A培養(yǎng)基接種細(xì)菌微生物的效果均強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

表1 R2A瓊脂培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基P值比較

由表2可知，R2A培養(yǎng)基與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基在接種白色念球菌后3次結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）[4]，說(shuō)明R2A培養(yǎng)基在接種真菌微生物效果與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基相同。

由圖1可知，黑曲霉接種在玫瑰紅鈉瓊脂和R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿上，在室溫23～28 ℃培養(yǎng)72 h，菌落開(kāi)始為白色，柔軟有光澤，逐漸形成絨毛狀或絮狀絲狀菌落，培養(yǎng)7 d后菌落直徑可達(dá)2～3 cm，出現(xiàn)黑心，形成黑色的分生孢子頭。雖然黑曲霉在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)（形態(tài)和色澤）優(yōu)于R2A瓊脂培養(yǎng)基，但這兩種培養(yǎng)基作為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，更側(cè)重于是否可以檢測(cè)出霉菌的數(shù)量，長(zhǎng)勢(shì)不是本次試驗(yàn)的目的。所以R2A瓊脂培養(yǎng)可替代玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)用于霉菌微生物的適用性檢查。

圖1 黑曲霉在玫瑰紅鈉、R2A瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

綜上所述，R2A瓊脂培養(yǎng)基可替代營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的適用性檢查。

2.2 注射用水樣品微生物限度檢查

對(duì)注射用水微生物限度檢測(cè)結(jié)果用柱狀圖方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出如圖2所示結(jié)果：在3次平行試驗(yàn)中，R2A瓊脂培養(yǎng)基在注射用水微生物限度檢測(cè)中檢出率均大于營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，說(shuō)明R2A瓊脂培養(yǎng)基能夠替代營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)用于注射用水微生物限度檢查[5]。

圖2 平行3次實(shí)驗(yàn)注射用水檢查平均數(shù)

2.3 靈敏度檢查

從圖3可看出，3批R2A培養(yǎng)基平皿中枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的回收率均超過(guò)70%。表3數(shù)據(jù)表明，這3批次被檢培養(yǎng)基滅菌后pH值均在合格范圍（7.2±0.2）內(nèi)[3]。

表3 R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿參數(shù)比較

圖3 枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌回收率

2.4 外觀與無(wú)菌性觀察

由圖4可知，平皿在制備后于18～25 ℃的常溫庫(kù)中培養(yǎng)100 d，外觀上無(wú)破裂，無(wú)裂紋，無(wú)明顯氣泡，無(wú)瓊脂凝塊；平皿在制備后于20～25 ℃的培養(yǎng)房中培養(yǎng)至100 d，無(wú)染菌現(xiàn)象。說(shuō)明到第100 d時(shí)，樣品所需檢定項(xiàng)目均達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所有R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿的有效期規(guī)定為90 d。

圖4 平皿外觀與無(wú)菌性情況

R2A瓊脂培養(yǎng)基可取代營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基對(duì)工藝用水菌落總數(shù)的測(cè)定，與歐盟標(biāo)準(zhǔn)接軌，符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿自制造之日至第100 d，外觀、pH值、無(wú)菌檢查、培養(yǎng)基適用性（靈敏度）檢查等項(xiàng)目結(jié)果均合格，可以滿足使用需求，依照R2A有效期驗(yàn)證方案，將R2A瓊脂培養(yǎng)基平皿有效期規(guī)定為90 d。