宰后豬肉pH值、骨架蛋白表達(dá)水平和持水性之間的關(guān)系

李華健，陳 韜，楊波若，李 霞，李燕清，王博文，卞健科，舒國濤

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

持水性會影響豬肉的加工特性、感官品質(zhì)和盈利能力，是豬肉最重要的品質(zhì)之一[1-3]。肉畜屠宰后，由于汁液流失造成的質(zhì)量損失一般在1%～10%之間[4]，過高的汁液流失易導(dǎo)致PSE（pale, soft, exudative）肉或RSE（reddish-pink,soft, exudative）肉，給肉類行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。因此，研究宰后豬肉持水性的影響因素具有直接的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實意義。

目前，國內(nèi)外學(xué)者[6-7]主要應(yīng)用相關(guān)性分析探討pH值、骨架蛋白變化與持水性的關(guān)系，其存在一定的局限性，因為相關(guān)性分析雖然能反映各變量與因變量的相關(guān)程度，但并不能完全反映出各變量對因變量的相對重要性，偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析則能對數(shù)據(jù)進(jìn)行分解和篩選，克服變量多重相關(guān)性的影響，提取對因變量解釋性最強(qiáng)的變量，從而更好地反映出變量對因變量的相對重要性[8]，彌補(bǔ)相關(guān)性分析的不足。另外，研究者普遍認(rèn)為：細(xì)胞膜骨架蛋白整聯(lián)蛋白（integrin）的降解有助于汁液流失通道的形成，增加汁液流失[9-10]。然而，肌細(xì)胞膜骨架蛋白不僅包含跨膜的整聯(lián)蛋白，還包含與膜相連的蛋白，如踝蛋白（talin）、黏著斑蛋白（vinculin）、抗肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin）等，這些蛋白通過肋小節(jié)（costameres）將肌原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)間接地聯(lián)結(jié)起來[11]。整聯(lián)蛋白-踝蛋白、黏著斑蛋白復(fù)合物是肋小節(jié)中介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的主要受體復(fù)合物，其中整聯(lián)蛋白貫穿于肌細(xì)胞膜，外聯(lián)肌細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)接踝蛋白，黏著斑蛋白和踝蛋白相互作用調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白黏著斑的形成，對細(xì)胞彼此之間的附著十分重要[12-14]。由于踝蛋白、黏著斑蛋白與整聯(lián)蛋白在細(xì)胞中的位置和功能存在不同，可能會對持水性產(chǎn)生不同的影響[7]：Kristensen等[15]的研究表明豬肉宰后成熟過程中，黏著斑蛋白的緩慢降解和踝蛋白的快速降解與持水性的增加有關(guān)；Sch?fer等[16]研究認(rèn)為黏著斑蛋白的降解與持水性無關(guān)；Bee等[6]的研究表明豬肉宰后48、72 h和120 h的踝蛋白表達(dá)水平與貯藏?fù)p失率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），宰后48 h的黏著斑蛋白表達(dá)水平與貯藏?fù)p失率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Di Luca等[17]通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)汁液流失率低的肉樣黏著斑蛋白表達(dá)量更高。由此可見，踝蛋白和黏著斑蛋白與持水性的關(guān)系依然還存有爭議。近年，Puolanne等[18]提出肉的持水機(jī)理還不清楚，肌細(xì)胞膜骨架蛋白與持水性的關(guān)系應(yīng)結(jié)合pH值、不同離子和蛋白質(zhì)變性等進(jìn)一步研究。因此，本研究主要運用相關(guān)性分析和PLSR分析探討pH值及整聯(lián)蛋白、踝蛋白、黏著斑蛋白變化與持水性之間的關(guān)系，以期為持水性的改善及預(yù)測宰后豬肉的汁液流失率提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在曲靖市某商業(yè)屠宰場，選擇6.5 月齡、飼養(yǎng)條件相同、體質(zhì)量相近（（105±5）kg）的20 頭去勢三元雜交豬（大河烏豬×約克夏×長白豬），按照GB/T 17236—2019《畜禽屠宰操作規(guī)程 生豬》[19]進(jìn)行屠宰，熱分割、胴體四分體后取13肋至最后腰椎處的背最長?。◣ぁ⒅竞凸牵?，用塑料薄膜包裹，放在0～4 ℃冷庫中，在宰后不同時間點測定相關(guān)指標(biāo)，并在各時間點取樣，用自封袋排氣封存于-80 ℃冰箱備用。根據(jù)宰后45 min的pH值經(jīng)聚類分析，將樣品分為高pH組和低pH組。

β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、N,N’-雙-亞甲基丙烯酰胺、溴酚蘭、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）（分析純）、丙烯酰胺（超級純） 美國Amresco公司；過硫酸胺（ammonium persulfate，APS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；預(yù)染Marker 美國Thermo公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、clone 8D4踝蛋白一抗 美國Sigma公司；MAB1900整聯(lián)蛋白一抗、MAB3574黏著斑蛋白一抗、AP181P二抗和0.45 μm的疏水性聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）轉(zhuǎn)印膜 美國Millipore公司；特超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒美國Everbright公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HI9025C便攜式pH計 意大利哈納公司；全自動酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；通用電泳儀電源、小型垂直電泳系統(tǒng)、槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測定

采用王娟等[20]的方法，用便攜式pH計測定宰后45 min和3、9、12、24 h豬背最長肌的pH值。每組樣品平行測量3 次取平均值。

1.3.2 汁液流失率的測定

參照Honikel[21]的方法測定汁液流失率，并稍作修改。于宰后24 h取2.5 cm厚背最長肌一片，用萬分之一天平稱質(zhì)量（m1/g）。用鐵絲鉤住肉條的一端，使肌纖維垂直向下，懸掛于塑料袋中，充氣（肉樣不能和塑料袋接觸），扎緊袋口，在4 ℃條件下吊掛24 h，取出稱質(zhì)量（m2/g）。汁液流失率按下式計算。

1.3.3 細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)水平測定

采用Western blot技術(shù)測定踝蛋白（分子質(zhì)量225 kDa）、整聯(lián)蛋白（分子質(zhì)量116 kDa）和黏著斑蛋白（分子質(zhì)量120 kDa）在不同時間點（宰后45 min和3、9、12、24 h）的降解情況。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）全肌肉蛋白樣品的制備參照Lonergan等[22]的方法并稍作修改。稱取0.8 g切碎的背最長肌肉樣，加入10 mL全肌肉蛋白提取液（10 mmol/L pH 7.0磷酸鈉、2 g/100 mL SDS），6 500 r/min勻漿30 s后在20 ℃、離心力1 500×g條件下離心20 min，取上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，用雙蒸水將質(zhì)量濃度調(diào)至6.4 mg/mL。取1 mL 6.4 mg/mL蛋白質(zhì)上清液與0.5 mL上樣緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3 g/100 mL SDS、體積分?jǐn)?shù)30%甘油、0.002 g/100 mL溴酚藍(lán)，pH 8.0）混合后加入0.1 mLβ-巰基乙醇（最終蛋白質(zhì)濃度為4 mg/mL）。50 ℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫，存放于-80 ℃冰箱備用。

SDS-PAGE：踝蛋白、整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白分別使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、10%、10%的分離膠，濃縮膠都使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的凝膠。待膠凝聚后，向電泳槽中加入電泳緩沖液（25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L EDTA和0.1 g/100 mL SDS），對準(zhǔn)膠孔注入蛋白質(zhì)樣品。整聯(lián)蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白每個泳道上樣量分別為80、80、120 μg全肌肉蛋白樣液。按照Bee等[6]的方法從左至右依次加入5 μL預(yù)染Marker、參比蛋白樣品和宰后45 min～24 h的蛋白樣品（參比蛋白樣液由宰后45 min，高pH組中汁液流失率最小的樣品制備）。設(shè)定濃縮膠電壓80 V、30 min，分離膠電壓120 V、1 h，進(jìn)行電泳。

轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白在200 mA下轉(zhuǎn)印1.5 h，踝蛋白在220 mA下轉(zhuǎn)印2 h，整個過程在0 ℃下進(jìn)行。轉(zhuǎn)印緩沖液由25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L EDTA和體積分?jǐn)?shù)15%甲醇組成。

Western blotting：轉(zhuǎn)印后，將膜置于含有5 g/100 mL BSA的TBST緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween 20，pH 7.5）中室溫封閉1 h，再置于一抗中4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成后，在室溫下用TBST緩沖液洗膜3 次（10 min/次）。將洗過的膜置于二抗中室溫孵育1 h。二抗孵育完成后在室溫下用TBST緩沖液洗膜3 次（10 min/次）。將洗凈后的膜用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，于暗室曝光。用ImageJ軟件分析完整的目標(biāo)蛋白條帶灰度值，按照Bee等[6]的方法分別以蛋白條帶上5 個時間點所測的灰度值與每塊凝膠上加載的參比樣品灰度值之比（即相對灰度值），表示完整的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。每張膜重復(fù)定量3 次求平均值。

一抗和二抗稀釋液都使用含3 g/100 mL BSA的TBST緩沖液。整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的一抗稀釋比為1∶800（V/V，下同），踝蛋白一抗稀釋比為1∶500。整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的二抗稀釋比為1∶8 000，踝蛋白的二抗稀釋比為1∶6 000。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件計算數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行Duncan’s多重比較、獨立性T檢驗和相關(guān)性分析（由于pH值數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，因此pH值與骨架蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析）。鑒于PLSR法可以解決樣本量少、變量不服從正態(tài)分布等問題[23-24]，各變量與汁液流失率的關(guān)系采用Unscrambler 9.7軟件進(jìn)行PLS1回歸分析。采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚類分析結(jié)果

圖1 宰后45 min樣品的pH值聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for pH of pork samples at 45 min postmortem

根據(jù)宰后45 min樣品pH值的大小進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)歐氏距離增至9.5時，可將20 個樣品分成高pH組（pH45min≥6.00，n＝6）和低pH組（pH45min≤5.78，n＝14）。分組后，高pH組的汁液流失率極顯著低于低pH組（P＜0.01）（圖2）。此結(jié)果與Bee[6]、Zhang Muhan[25]等的研究結(jié)果一致。王娟等[20,26]的研究也表明，與雜交豬相比，具有較高持水性的梅山豬宰后45 min的pH值明顯更高（P＜0.05）。

圖2 不同pH值組肉樣的汁液流失率Fig.2 Drip loss of pork samples with different pH values

2.2 不同組別pH值和骨架蛋白的表達(dá)水平分析結(jié)果

圖3 宰后不同pH組樣品的pH值（A）和整聯(lián)蛋白（B）、黏著斑蛋白（C）、踝蛋白（D）表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes in pH (A), and expression levels of integrin (B),vinculin (C), and talin (D) in pork samples with different pH values during postmortem aging

如圖3所示，高、低pH組之間的pH值和完整的骨架蛋白表達(dá)水平存在一定的差異。高pH組的pH值在宰后45 min和3、9、12 h都極顯著高于低pH組（P＜0.01），整聯(lián)蛋白表達(dá)水平在宰后9 h 極顯著高于低p H 組（P＜0.01），黏著斑蛋白表達(dá)水平在宰后3 h和9 h顯著高于低pH組（P＜0.05），踝蛋白表達(dá)水平在宰后3、9、12、24 h都顯著低于低pH組（P＜0.05）。

與宰后45 min相比，高pH組的pH值到宰后9 h顯著降低（P＜0.05），而低pH組到宰后3 h就顯著降低（P＜0.05），在宰后12～24 h兩組肉樣的pH值都有上升的趨勢，低pH組出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05）。整聯(lián)蛋白在高pH組中未見顯著降解（P＞0.05），而低pH組在宰后3 h較宰后45 min出現(xiàn)顯著降解（P＜0.05）。高pH組宰后24 h的黏著斑蛋白較宰后3 h出現(xiàn)顯著降解（P＜0.05），低pH組宰后12 h的黏著斑蛋白較宰后45 min出現(xiàn)顯著降解（P＜0.05）。相對于宰后45 min，高pH組的踝蛋白在宰后9 h出現(xiàn)顯著降解（P＜0.05），低pH組在宰后12 h才出現(xiàn)顯著降解（P＜0.05）。說明pH值的降低可能會影響骨架蛋白的降解。何凡等[27]對宰后羊肉品質(zhì)的研究也表明：在宰后45 min，低滴水損失組的pH值顯著高于高滴水損失組（P＜0.05），且pH值的下降會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，造成較高的汁液流失率。

2.3 pH值與骨架蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果

表1 pH值與骨架蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果Table 1 Correlation analysis between pH and expression levels of cytoskeletal proteins

如表1所示，在各時間點，整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白表達(dá)水平與pH值整體呈正相關(guān)性，踝蛋白與之相反。整聯(lián)蛋白表達(dá)水平在宰后3 h與宰后12 h的pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），在宰后9 h與宰后3、9、12 h的pH值呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與宰后24 h的pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），在宰后12 h與宰后3 h的pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），在宰后24 h與宰后3 h和9 h的pH值分別呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。黏著斑蛋白表達(dá)水平在宰后3 h與宰后3、9、12 h的pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），在宰后9 h和12 h與宰后3 h的pH值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；宰后3 h的踝蛋白表達(dá)水平與宰后9 h的pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 PLSR分析結(jié)果

圖4 pH值和整聯(lián)蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白表達(dá)水平與汁液流失率的PLS1模型分析Fig.4 Regression coefficient of the PLS1 model explaining variance in drip loss versus pH and expression levels of integrin, vinculin and talin

為探究pH值和骨架蛋白與汁液流失率的關(guān)系，將各時間點的pH值和骨架蛋白表達(dá)水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型。如圖4所示，汁液流失率與各時間點的pH值都呈顯著負(fù)相關(guān)，與宰后3、9 h和24 h的整聯(lián)蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與宰后3 h和9 h的黏著斑蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與宰后45 min～24 h 的踝蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。說明宰后豬肉中pH值的降低、整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的降解會增加汁液流失，而踝蛋白的降解有利于減少汁液流失。Brewer[2]也認(rèn)為，高持水性的肉具有較高的pH值，pH值的變化以及整聯(lián)蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白等骨架蛋白的降解會對持水性產(chǎn)生影響；Zhang Wangang等[28]的研究表明宰后1 d的整聯(lián)蛋白表達(dá)水平與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Bee等[6]的研究表明，pH值與汁液流失率呈負(fù)相關(guān)（宰后45 min和6 h的pH值與汁液流失率的相關(guān)系數(shù)分別為-0.49和-0.56），在宰后24 h，黏著斑蛋白表達(dá)水平與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān)，踝蛋白表達(dá)水平與汁液流失率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），且pH值的降低會影響踝蛋白的降解，與本研究結(jié)果一致。

對變量與汁液流失率進(jìn)行PLSR分析，可以簡單得到變量對汁液流失率的直接貢獻(xiàn)。如表2所示，分別對pH值、骨架蛋白表達(dá)水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型。結(jié)果顯示：pH值（模型1）、整聯(lián)蛋白表達(dá)水平（模型3）、黏著斑蛋白表達(dá)水平（模型4）和踝蛋白表達(dá)水平（模型5）分別占汁液流失率變異的77%、41%、44%和34%。

表2 測量參數(shù)（X變量）分別解釋汁液流失率（Y變量）方差的PLS1模型Table 2 Figures of merit of PLS1 models for each independent variable to explain variance in drip loss

為進(jìn)一步明晰pH值和3 種骨架蛋白在何時對汁液流失率的直接貢獻(xiàn)較大，將各時間點的pH值與汁液流失率建立PLS1回歸模型1，排除不顯著變量后繼續(xù)建立PLS1回歸模型2，該模型主要由宰后45 min的pH值控制，且占汁液流失率變異的66%，說明宰后45 min的pH值對汁液流失率的影響較大；將3 種骨架蛋白表達(dá)水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型6，排除不顯著變量后繼續(xù)建立PLS1回歸模型7，該模型主要由宰后9 h的整聯(lián)蛋白表達(dá)水平控制，且占汁液流失率變異的72%，說明在3 種骨架蛋白中，宰后9 h的整聯(lián)蛋白表達(dá)水平對汁液流失率的影響較大。

3 討 論

基于宰后45 min豬背最長肌的pH值對其進(jìn)行分組后，高pH組的pH值在宰后12 h內(nèi)極顯著高于低pH組（P＜0.01）（圖3A）；高pH組的汁液流失率極顯著小于低pH組（P＜0.01）（圖2）；宰后45 min～24 h的pH值與汁液流失率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖4）。說明pH值越低，豬肉的持水性越差。此結(jié)果與謝華等[29]的研究一致。魏心如等[30]通過相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)宰后24 h的pH值與壓榨損失率和滴水損失率均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），指出提高pH值有助于保持冷卻雞肉的持水性。最近Watanabe等[31]的研究也表明pH值是影響豬肉持水性最重要的因素之一，與汁液流失率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

在宰后45 min～24 h，高pH組的整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白表達(dá)水平高于低pH組，踝蛋白表達(dá)水平低于低pH組，且高pH組的整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白降解速率較低pH組慢，踝蛋白降解速率較低pH組快（圖3B～D）。pH值與整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白表達(dá)水平整體呈正相關(guān)性，與踝蛋白表達(dá)水平整體呈負(fù)相關(guān)性（表1）。說明pH值降低越快，整聯(lián)蛋白和黏著斑蛋白的降解越多，踝蛋白降解越少。Brewer[2]和Lonergan[32]等也認(rèn)為pH值會通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶的活性從而影響骨架蛋白降解。

在所研究的骨架蛋白中，9 h的整聯(lián)蛋白表達(dá)水平對汁液流失率的影響最大（表2，模型7）。這可以從Lawson[9]和Zhang Wangang[28]等的研究中得到解釋：由于整聯(lián)蛋白的特殊位置，當(dāng)整聯(lián)蛋白降解時，膜和黏附結(jié)構(gòu)被破壞，肌細(xì)胞/膜之間的相互作用減弱，形成汁液流失通道，增加汁液流失。因此，完整的整聯(lián)蛋白能起到阻止汁液流失通道開放、減少宰后豬肉汁液流失的作用。但pH值的降低比骨架蛋白降解對持水性的影響更大。因為pH值的變化會影響骨架蛋白的降解，且在圖4多變量模型中各時間點的pH值都對汁液流失率產(chǎn)生較大的負(fù)作用，并單獨解釋了汁液流失率變異的77%（表2，模型1），大于骨架蛋白對汁液流失率的貢獻(xiàn)。考慮到簡單實用性和預(yù)測準(zhǔn)確性，宰后45 min的pH值可以作為宰后豬肉汁液流失率的預(yù)測指標(biāo)。因為單獨對pH值與汁液流失率進(jìn)行PLS1回歸分析，剔除不顯著變量后只有宰后45 min的pH值對汁液流失率有顯著影響（表2，模型2）。Hamoen等[33]的研究也表明pH值是預(yù)測宰后肉品質(zhì)的可靠指標(biāo)。Sch?fer等[16]的研究表明pH值可以解釋汁液流失率變異的85%，宰后2 h內(nèi)的pH值可以用于預(yù)測汁液流失率。

綜上，宰后豬肉中pH值的高低會通過影響細(xì)胞骨架完整性，進(jìn)而影響最終產(chǎn)品的持水性。pH值的降低對豬肉持水性的影響較骨架蛋白降解影響更大，且宰后45 min的pH值可以用于預(yù)測宰后豬肉汁液流失率。