有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響

彭 朋，秦永生，王大寧，馬 剛，何瑞波，劉佰川，李應(yīng)森，何瑞波

心血管疾病是人類健康的頭號(hào)殺手，高血壓則是最常見(jiàn)的心血管疾病，可導(dǎo)致多個(gè)靶器官(心、腦、腎等)損害[1]；腎臟是最常累及的器官之一，稱為高血壓腎病[2]。持續(xù)血壓升高通過(guò)降低入球小動(dòng)脈阻力并增加出球小動(dòng)脈阻力引起腎小球毛細(xì)血管壓力升高(腎小球高壓)，進(jìn)而造成腎臟纖維化甚至腎硬化，直至腎臟完全喪失臟器功能[2]。纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和積聚的結(jié)果，研究證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)/Smad是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成的經(jīng)典信號(hào)通路，高血壓腎病腎臟發(fā)生纖維化并伴隨TGF-β1/Smad信號(hào)途徑持續(xù)激活[3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓腎病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞向具有細(xì)胞外基質(zhì)分泌能力的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT)，是腎臟纖維化形成與進(jìn)展的重要病理生理機(jī)制[3]。有證據(jù)顯示，TGF-β1/Smad能夠正向調(diào)控EMT，形成“TGF-β1/Smad-EMT-腎臟纖維化”病理過(guò)程，因此抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的EMT是防治腎臟纖維化的重要靶點(diǎn)[4]。

有規(guī)律的體力活動(dòng)對(duì)心血管疾病患者具有多種健康效應(yīng)，其中有氧運(yùn)動(dòng)是主要方式[5]。有關(guān)規(guī)律運(yùn)動(dòng)對(duì)各種原因?qū)е碌哪I臟疾病的作用鮮有關(guān)注，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)能夠改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)腎臟膠原過(guò)度沉積，其機(jī)制與減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]。本研究以SHR為模型，觀察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟纖維化的影響并探討腎小管EMT以及TGF-β1/Smad信號(hào)途徑在其間的作用機(jī)制，為高血壓腎病患者制定有針對(duì)性的運(yùn)動(dòng)處方提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 40只12周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠和SHR，體重(209±12)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對(duì)照組(WKY)；30只雄性SHR按照隨機(jī)數(shù)字表法分為高血壓安靜組(SHR sedentary，SHR-S)和高血壓運(yùn)動(dòng)組(SHR exercise，SHR-E)，每組15只。動(dòng)物分籠(5只/籠)標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。WKY和SHR-S組在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)，SHR-E組進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。由于拒跑(SHR-E組1只)、意外死亡(SHR-S組3只，SHR-E組1只)等原因，納入統(tǒng)計(jì)的最終樣本量為：WKY組(n=10)、SHR-S組(n=12)、SHR-E組(n=13)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案 所有動(dòng)物先進(jìn)行5 d跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，方案為：速度10～15 m/min，坡度0°，時(shí)間15～30 min/d。隨后參照課題組前期建立的方法[6, 7]測(cè)定大鼠運(yùn)動(dòng)能力：起始負(fù)荷5 m/min，坡度0°，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭，記錄最大跑速(maximal velocity，Vmax)。隨后SHR-E組大鼠進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為60%Vmax對(duì)應(yīng)的跑速，持續(xù)時(shí)間為60 min/次，5次/周。第2、4、6周重新測(cè)定Vmax并調(diào)整運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。

1.3 血壓水平測(cè)定 末次訓(xùn)練后72 h(避免急性運(yùn)動(dòng)的影響)，利用無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(BP-2010E，日本)檢測(cè)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)并計(jì)算平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，測(cè)量3次取均值。

1.4 組織取材 血壓水平測(cè)定后將大鼠置于代謝籠中24 h收集尿液。稱重后腹腔麻醉動(dòng)物，隨即分離左側(cè)腎臟，將其分為兩部分，一部分用于組織病理學(xué)觀察，另一部分進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.5 腎臟功能測(cè)定 尿樣于4 ℃、3000 r/min離心15 min后取上清，利用全自動(dòng)生化分析儀(AU680，美國(guó))檢測(cè)血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)含量，分光光度計(jì)(722 型，上海)測(cè)定24 h尿蛋白(urine protein，UP)含量。

1.6 腎臟病理組織學(xué)觀察 取腎臟組織經(jīng)4%甲醛溶液固定12 h后經(jīng)脫水、包埋、制作4 μm組織切片。脫臘后進(jìn)行Masson染色，中性樹(shù)膠封片。倒置相差顯微鏡(歐林巴斯IX71，日本)下每張切片選取10個(gè)視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0，美國(guó))測(cè)量結(jié)締組織面積與所測(cè)視野面積的比值作為腎臟纖維化指數(shù)(fibrosis index，F(xiàn)I)。

1.7 蛋白水平檢測(cè) 利用Western blot法檢測(cè)腎臟TGF-β1、磷酸化Smad2(p-Smad2)、p-Smad3、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-CA)表達(dá)量。腎臟組織勻漿后4 ℃、12 000 g離心10 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。取100 μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。兔抗鼠一抗[TGF-β1(1∶2000，Santa cruz公司)、p-Smad2(1∶1000，Abcam公司)、p-Smad3(1∶1000，Abcam公司)、α-SMA(1∶2000，Santa cruz公司)、E-CA(1∶2000，Santa cruz公司)]4 ℃靜置孵育過(guò)夜，二抗(1∶5000，武漢博士德生物工程有限公司)37 ℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發(fā)光成像，利用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS，美國(guó))拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與β-actin(1∶10000，Abcam公司)灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 血壓水平的變化 與WKY組比較，SHR-S組SBP、DBP和MAP均顯著性升高(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組各血壓水平降低(P<0.05，表1)。

表1 三組大鼠末次有氧運(yùn)動(dòng)后72 h血壓水平的變化

2.2 腎臟功能的變化 腎臟結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè)顯示，與WKY組比較，SHR-S組UP、BUN和SCr升高(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組UP、BUN和SCr下降(P<0.05，表2)。

表2 三組大鼠末次有氧運(yùn)動(dòng)后72 h腎臟功能的變化

2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察與纖維化指數(shù)(fibrosis index，F(xiàn)I)的變化 三組大鼠末次訓(xùn)練后72 h腎臟組織病理變化見(jiàn)圖1，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。WKY組腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)中僅有少量膠原纖維；SHR-S組腎小球萎縮，腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)增厚并存在大量膠原纖維，F(xiàn)I高于WKY組[(7.87±1.89)%vs.(0.43±0.05)%，P<0.05]；SHR-E組腎小球、腎小管病變減輕，膠原纖維明顯減少，F(xiàn)I較SHR-S組降低[(3.02±0.91)%vs.(7.87±1.89)%，P<0.05]。

圖1 三組大鼠末次有氧運(yùn)動(dòng)后72 h腎臟組織病理變化(Masson，×400)

2.4 蛋白表達(dá)量的變化 與WKY組比較，SHR-S組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)，E-CA蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，E-CA蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05，表3)。

表3 三組大鼠末次有氧運(yùn)動(dòng)后72 h蛋白表達(dá)量的變化

3 討 論

臨床研究證實(shí)，高血壓腎病表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過(guò)度沉積，腎單位逐漸減少，腎小球?yàn)V過(guò)率和腎功能進(jìn)行性下降，最終發(fā)生腎衰竭和尿毒癥[2]。本研究以SHR為模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR-S組動(dòng)物腎臟FI、UP、BUN和SCr均較WKY組升高，提示高血壓誘導(dǎo)大鼠腎臟發(fā)生纖維化，腎功能降低。規(guī)律體力活動(dòng)對(duì)多種原因引起的組織纖維化均具有改善效應(yīng)[8]。課題組前期的研究證實(shí)，8周有氧運(yùn)動(dòng)可改善高血壓大鼠心肌纖維化，但運(yùn)動(dòng)對(duì)腎臟纖維化的影響鮮有關(guān)注[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，SHR-E組腎臟FI、UP、BUN和SCr較WKY組顯著性下降，這與以游泳運(yùn)動(dòng)[9]、力量訓(xùn)練[10]為干預(yù)方式的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明不同運(yùn)動(dòng)方式均可減輕腎臟膠原沉積并改善腎臟功能，提示運(yùn)動(dòng)療法作為高血壓腎病的輔助治療手段，患者應(yīng)長(zhǎng)期堅(jiān)持。

TGF-β1是促進(jìn)組織纖維化最重要的調(diào)控因子[11]。在受到炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等致病因素作用后，腎臟可誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，與相應(yīng)膜受體結(jié)合磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子Smad2和Smad3進(jìn)而使其活化，活化(磷酸化)的Smad2/3與 Smad4結(jié)合為三聚體并進(jìn)入胞核內(nèi)，通過(guò)誘導(dǎo)促纖維化因子如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因表達(dá)而刺激成纖維細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致腎臟纖維化[11]。近年來(lái)的研究指出，TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路介導(dǎo)的腎小管EMT是腎臟間質(zhì)纖維化的重要病理生理機(jī)制，通常表現(xiàn)為細(xì)胞抗凋亡及遷移能力增強(qiáng)，且可大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)[12-14]。在EMT進(jìn)程中，腎小管上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞黏附特性，即表皮黏附分子E-CA表達(dá)減少，同時(shí)重新表達(dá) α-SMA等間充質(zhì)細(xì)胞表型。

在本研究中，與WKY組比較，SHR-S組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)量上調(diào)，E-CA蛋白表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明高血壓大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)通路持續(xù)激活并誘導(dǎo)腎小管發(fā)生EMT。臨床研究證實(shí)，抑制腎小管EMT能夠延緩腎臟疾病的進(jìn)展并維持腎臟正常形態(tài)和功能[14, 15]。在本研究中，經(jīng)過(guò)跑臺(tái)訓(xùn)練后，與SHR-S組比較，SHR-E組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達(dá)量下調(diào)，E-CA蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示有氧運(yùn)動(dòng)能夠顯著降低TGF-β1/Smad信號(hào)活性并抑制該信號(hào)途徑誘導(dǎo)的腎小管EMT，因此TGF-β1/Smad-EMT可能是運(yùn)動(dòng)改善SHR腎臟纖維化的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，大鼠發(fā)生高血壓時(shí)腎臟TGF-β1/Smad信號(hào)途徑持續(xù)激活并誘導(dǎo)腎小管EMT和腎臟纖維化，腎功能進(jìn)行性下降；有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)途徑(下調(diào)其活性)抑制高血壓腎病大鼠腎小管EMT，進(jìn)而改善腎臟纖維化并提高腎功能。