HPLC法同時(shí)測定參龍通絡(luò)丸中三七皂苷R1和人參皂苷Rf的含量

楊媛媛，欒 濤，孫玉坤，郭兆剛

參龍通絡(luò)丸為我院院內(nèi)制劑，它是根據(jù)中醫(yī)方劑經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝精制而成的中成藥，全方主要由人參片、丹參、黃芪、三七粉、凈山楂、川芎等13味草藥組成，具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床用于卒中(腦梗死、腦出血后遺癥等)，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語不清、手足麻木、面色晄白、氣短乏力等，也可用于缺血性腦血管病的預(yù)防。目前，對(duì)該藥的質(zhì)量檢查方法為薄層色譜法檢測川芎與赤芍成分，或顯微鏡下觀察地龍、山楂、黃芪的纖維特征，以上檢測方法存在重現(xiàn)性和精密度不高的缺點(diǎn)。由于復(fù)方制劑的干擾因素較多，很難精確有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。人參與三七均為本藥的主要成分，兩味藥材同為五加科人參屬，含有相同的單體皂苷類化合物[1-3]。研究表明，人參皂苷Rf為人參中含有的特征性指標(biāo)成分，三七皂苷R1為三七中含有的特征性指標(biāo)成分[4-6]。為尋求更準(zhǔn)確、高效的藥品質(zhì)量控制方法，本實(shí)驗(yàn)選取人參皂苷Rf、三七皂苷R1作為指標(biāo)項(xiàng)，采用HPLC法同時(shí)測定參龍通絡(luò)丸中這兩種成分的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 島津LC-20A液相色譜儀、Prominence SPD-20A UV-VIS紫外可見檢測器、Prominence SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AB型8梯度系統(tǒng)高壓混合器、CTO-10AC柱溫箱；UPT-30UV實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(北京三達(dá)水科技有限公司)；PR223ZH電子天平(上海眾淵實(shí)業(yè)有限公司)；HGZN-270型電熱恒溫干燥箱(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司)；KQ3200DE超聲波儀(上海儀天科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 參龍通絡(luò)丸(沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院制劑室制劑，批號(hào)分別為：20200602、20200605、20200615、20200618、20200620、20200702)；三七皂苷R1與人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為111719-201915、110745-201908，純度均≥98%)；乙腈、甲醇均為色譜純(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，純度均≥99.99%)；其他試劑均為分析純標(biāo)準(zhǔn)；水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Hypersil Hypersil BDS C18色譜柱(5 μm，4 mm×250 mm)；乙腈-水為流動(dòng)相；流速1.0 ml/min；檢測波長203 nm；柱溫35 ℃；樣品單次進(jìn)樣量10 μl；梯度洗脫流程按表1進(jìn)行。

表1 梯度洗脫流程

2.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液的制備 取無需干燥的三七皂苷R1、人參皂苷Rf標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定并記錄質(zhì)量，置于100 ml的容量瓶中，加甲醇溶液搖勻溶解并定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，濃度分別為三七皂苷R165.3 μg/ml、人參皂苷Rf 201.9 μg/ml，通過0.45 μm微孔濾膜除掉顆粒雜質(zhì)，收集濾液作為儲(chǔ)備液待用。

2.3 供試品溶液的制備 隨機(jī)抽取本院在售的參龍通絡(luò)丸一瓶，倒出約40粒，于瓷質(zhì)研缽中碾碎并在烘箱中烘干，再次放置研缽中仔細(xì)研磨使之成粉末狀，將研磨后的藥粉精密稱取1.0 g放入50 ml量瓶中，加入甲醇溶液40 ml密封搖勻，置于超聲波提取器(頻率40 kHz，功率680 W)處理60 min，將處理后的容量瓶放置室溫，精密加入甲醇溶液定容至容量瓶刻度，搖勻并過濾，接續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 嚴(yán)格按照參龍通絡(luò)丸的各成分配比及制劑流程，制作不含人參和三七兩種成分的陰性樣品適量，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.5 專屬性考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照品溶液各10 μl，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行色譜測定，見圖1。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品和供試品中三七皂苷R1、人參皂苷Rf分離度均>1.5，較為理想，兩個(gè)目標(biāo)峰保留時(shí)間分別為17.1 min和46.3 min，陰性對(duì)照品的相應(yīng)位置沒有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰，說明本方法具有較好的專屬性。

圖1 參龍通絡(luò)丸中三七皂苷R1與人參皂苷Rf檢測的液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取2、6、10、14、16、20 μl上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，按上文確定的色譜條件分別進(jìn)行檢測并詳細(xì)記錄峰面積數(shù)據(jù)，對(duì)進(jìn)樣量(ng)X與峰值面積積分值進(jìn)行線性回歸處理，得線性回歸方程。同時(shí)按梯度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的濃度進(jìn)行稀釋，在信噪比(S/N)分別為3∶1、10∶1時(shí)確定檢測線和定量限，見表2。結(jié)果表明三七皂苷R1與人參皂苷Rf的進(jìn)樣量分別為0.198～9.535 μg、0.957～38.392 μg時(shí)具有較好的線性關(guān)系，能夠滿足含量測定需要。

表2 參龍通絡(luò)丸兩種成分檢測樣品線性回歸及相關(guān)系數(shù)

2.7 精密度試驗(yàn) 取上述制得的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μl，詳細(xì)記錄峰值面積，經(jīng)計(jì)算得三七皂苷R1與人參皂苷Rf的RSD值分別為1.21%、1.63%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)中的設(shè)備精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20200602院內(nèi)在售制劑參龍通絡(luò)丸適量，按上述供試品溶液制備方法制備溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，于0、2、5、8、12、15、20、24 h分別重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μl檢測，根據(jù)測得的峰面積分別計(jì)算出三七皂苷R1的RSD值0.96%，人參皂苷Rf的RSD值1.25%。表明參龍通絡(luò)丸供試品溶液至少在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20200602院內(nèi)在售制劑參龍通絡(luò)丸適量，在上述供試品溶液制備條件下制得的溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，依次進(jìn)樣各10 μl并詳細(xì)記錄峰值面積。根據(jù)測得的峰面積分別計(jì)算出三七皂苷R1平均質(zhì)量為0.816 mg/g，RSD值為1.04%，人參皂苷Rf平均質(zhì)量為2.582 mg/g，RSD值為1.63%。結(jié)果提示本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已測含量的院內(nèi)在售制劑參龍通絡(luò)丸適量(批號(hào)：20200602)，經(jīng)過碾碎、烘干、研成細(xì)粉后，每份取0.5 g，共取6份，精密稱定，分別置于50 ml具塞三角燒瓶中，分別加入含量為三七皂苷R121.7 μg/ml、人參皂苷Rf 50.3 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液5 ml，按照上述供試品溶液制備方法制備溶液及“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，每次進(jìn)樣10 μl并記錄峰面積值，計(jì)算三七皂苷R1和人參皂苷Rf的平均加樣回收率分別為99.10%、98.76%，RSD為1.57、2.13。

2.11 含量測定 分別取6個(gè)不同批次我院在售的參龍通絡(luò)丸適量，參照上述“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液及“2.1”項(xiàng)色譜條件，以10 μl進(jìn)樣量注入色譜儀中，將測得的峰面積代入“2.6”項(xiàng)中的線性回歸方程，分別計(jì)算兩種待測成分含量值，見表3。

表3 參龍通絡(luò)丸兩種成分檢測樣品含量測定結(jié)果 (n=6)

3 討 論

3.1 提取方式的考察 參龍通絡(luò)丸所含的成分多而復(fù)雜，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-11]，對(duì)人參和三七化學(xué)成分的提取一般選用超聲波輔助提取法或索氏提取法，這兩種提取方法效果比較接近，最終選擇操作比較簡單、方便的超聲波輔助提取法。超聲提取最佳時(shí)間為40 min，通過對(duì)不同濃度的甲醇水及甲醇溶液作為提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑較為合適，提取效率較高。

3.2 色譜條件的考察 根據(jù)文獻(xiàn)[12-15]報(bào)道，在檢測波長的選擇中，應(yīng)用203 nm檢測波長檢測時(shí)，兩種待測成分可出現(xiàn)最佳信號(hào)強(qiáng)度和辨識(shí)度，故本實(shí)驗(yàn)選擇的檢測波長為203 nm；在對(duì)流動(dòng)相的選擇中，分別考察了乙腈-水、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸和甲醇-乙酸溶液，結(jié)果采用乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)可達(dá)到目標(biāo)成分最佳出峰時(shí)間與分離度，還可有效降低拖尾因子，故流動(dòng)相選擇乙腈-水；預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，借鑒了以往發(fā)表的相關(guān)資料，選擇柱溫在28～38 ℃范圍內(nèi)、流速在0.8～1.5 ml/min范圍內(nèi)進(jìn)行考察，當(dāng)柱溫為35 ℃、流速為1.0 ml/min時(shí)，結(jié)合上述流動(dòng)相條件，可使樣品溶液中的目標(biāo)成分達(dá)到合適的出峰時(shí)間與較好分離度。

本文建立了采用HPLC法同時(shí)測定參龍通絡(luò)丸中三七皂苷R1和人參皂苷Rf兩種成分的方法，具有操作簡便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，在參龍通絡(luò)丸以往質(zhì)量控制方法的基礎(chǔ)上，可為其增加新的質(zhì)控手段提供參考依據(jù)。