伏立諾他對(duì)嚴(yán)重燙傷大鼠心臟的保護(hù)作用

孟祥熙，溫海玲，鄭金光，胡 森

突發(fā)事故和災(zāi)害時(shí)，短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)大量創(chuàng)傷、燒傷休克傷員，由于環(huán)境特殊、交通破壞、護(hù)送延遲、液體供不應(yīng)求等原因使常規(guī)靜脈液體復(fù)蘇難以實(shí)施，傷員得不到及時(shí)救治，死亡率及并發(fā)癥發(fā)生率明顯增高。如果能給予抗休克維持藥物，提高機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷、休克的耐受能力，保護(hù)重要臟器的功能，就能為后續(xù)治療爭(zhēng)取時(shí)間，提高生存率，減少并發(fā)癥。在嚴(yán)重?zé)齻?，體液大量丟失，有效循環(huán)血量銳減，心臟供血減少，早期就會(huì)出現(xiàn)心肌損傷，心肌細(xì)胞水腫、間質(zhì)充血、心肌壞死，心肌損傷的早期防治對(duì)減輕心肌缺血缺氧損害，減少并發(fā)癥、提高生存率有重要意義[1，2]。伏立諾他(SAHA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，以往研究證實(shí)，SAHA能提高失血性休克或燙傷大鼠生存率，保護(hù)主要臟器功能[3-7]，但具體機(jī)制仍不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察伏立諾他對(duì)50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心肌酶指標(biāo)、心肌含水率、心肌細(xì)胞凋亡率、caspase-3活性的影響及心肌組織病理學(xué)變化，為SAHA在嚴(yán)重?zé)齻缙诒Ｗo(hù)心臟功能方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，60～70日齡，體重240～260 g，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，購(gòu)進(jìn)后，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周以上，室溫維持在22～25 ℃，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、自由飲水。

1.2 藥品和試劑 辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、戊巴比妥鈉購(gòu)自SIGMA公司，Caspase-3 Assay Kit購(gòu)自Abcam公司，TUNEL檢測(cè)陽性對(duì)照制備試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 儀器 自動(dòng)生化分析儀(7170型)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(5900)，日本Kubota公司；KD-BM生物組織包埋機(jī)，浙江科迪儀器設(shè)備公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯有限公司；多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Dynex公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模型制備及分組 48只雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛發(fā)，將大鼠放置在預(yù)制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時(shí)保護(hù)剩余皮膚。隨機(jī)分為3組：(1)假燙組，采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，浸泡后腹腔內(nèi)注射0.25 ml生理鹽水；(2)燙傷組，于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s燙傷后，腹腔內(nèi)注射0.25 ml生理鹽水；(3)SAHA組，燙傷后腹腔給予SAHA治療(7.5 mg/kg，溶于0.25 ml生理鹽水)。每組根據(jù)燙傷3、6 h兩個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，又分為兩個(gè)亞組(n=8)。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè) 燙傷后3、6 h抽取腹主動(dòng)脈血，胸正中線剖開取心肌組織。(1)抽取腹主動(dòng)脈血標(biāo)本，離心后取血漿，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。(2)心肌組織含水率，采用干/濕重法檢測(cè)大鼠心肌組織含水率。取適量心肌組織，用濾紙將組織表面液體吸干，電子天平準(zhǔn)確稱重(濕重)，將樣本放入電烤箱中80 ℃烘烤72 h，電子天平稱重烘干后的樣本并記錄數(shù)值(干重)。含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。(3)心肌細(xì)胞凋亡率，TUNEL方法檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞，其原理是熒光素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3′-OH末端，在熒光顯微鏡下熒光增強(qiáng)。隨機(jī)選取心肌組織區(qū)域中5個(gè)非重疊400高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100 %。(4)Caspase-3活性，Caspase-3可以催化底物DEVD-p-NA產(chǎn)生黃色的p-NA，從而可以通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)caspase-3的活性；按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，混勻，405 nm，讀取各管OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及光密度值計(jì)算樣品中caspase-3活性。

2 結(jié) 果

2.1 血漿內(nèi)CK-MB水平 與假燙組[(585.6±46.1)U/L]比較，燙傷組傷后3、6 h血漿內(nèi)CK-MB水平[(2552.9±145.3)U/L，(5418.7±292.9)U/L]明顯升高(均P<0.05),組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；SAHA治療后，血漿內(nèi) CK-MB水平[(1642.4±157.2)U/L，(3475.3±187.5)U/L]較燙傷組明顯降低(均P<0.05)。

2.2 心肌組織含水率 燙傷后3、6 h，燙傷組心肌組織含水率[(77.65±1.75)%，(80.23±1.82)%]較假燙組[(70.12±1.99)%]明顯升高(均P<0.05),而SAHA組傷后心肌組織含水率[(72.31±1.95)%，(75.21±2.00)%]顯著低于燙傷組(均P<0.05)。

2.3 心肌組織TUNEL染色結(jié)果 正常心肌纖維排列整齊，肌纖維之間距離緊密，燙傷后, 心肌纖維出現(xiàn)扭曲、紊亂、斷裂，肌間質(zhì)水腫、增寬，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，傷后時(shí)間越長(zhǎng)，心肌損傷越重；而給予SAHA處理后，心肌損傷較燙傷組明顯減輕, 肌纖維排列較整齊,間質(zhì)水腫減輕，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，說明SAHA能在一定程度保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)完整，保護(hù)心臟功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡(圖1)。

圖1 各組心肌組織TUNEL染色(×400)

2.4 心肌細(xì)胞凋亡率 燙傷后3、6 h，燙傷組心肌細(xì)胞凋亡率[(16.1±0.8)%，21.5±1.2)%]明顯高于假燙組[(0.5±0.1)%]，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；隨傷后時(shí)間增加，心肌細(xì)胞凋亡率也隨之升高，而給予SAHA處理后，心肌細(xì)胞凋亡率[(11.6±0.6)%，(15.1±0.9)%]較燙傷組明顯降低(均P<0.05)。

2.5 心肌組織caspase-3活性 與假燙組[(0.435±0.041)μmol/mg]比較，燙傷組傷后3.6 h心肌組織內(nèi)caspase-3活性[(0.716±0.052)μmol/mg，(0.912±0.063)μmol/mg]明顯升高(均P<0.05)，而SAHA組caspase-3活性[(0.557±0.052)μmol/mg，(0.535±0.034)μmol/mg]顯著低于燙傷組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 討 論

嚴(yán)重?zé)齻?失血性休克后，心肌早期就出現(xiàn)缺血缺氧性損傷，心臟功能減退，進(jìn)而誘發(fā)或加重休克。早期心肌損傷的防治對(duì)休克的治療和減少并發(fā)癥具有重要意義。對(duì)不能及時(shí)得到系統(tǒng)治療的嚴(yán)重?zé)齻?失血性休克患者，如果在早期給予抗休克維持藥物，保護(hù)休克狀態(tài)下的心肌組織及心臟功能，對(duì)后續(xù)治療意義重大。

以往研究證實(shí)，在嚴(yán)重?zé)齻缙诰鸵殉霈F(xiàn)心肌損傷[2]，由于燒傷部位血管通透性增加，血漿大量滲出至體外或第三間隙，有效循環(huán)血量銳減，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血缺氧、能量代謝障礙、炎性反應(yīng)、心肌細(xì)胞水腫、心肌結(jié)構(gòu)受損及心功能下降等一系列反應(yīng)，加重休克甚至死亡。

SAHA作為一種組蛋白去乙?；敢种苿?，以往研究證實(shí)組蛋白去乙?；敢种苿┚哂性黾咏M蛋白的乙酰化水平，維持乙?；瘎?dòng)態(tài)平衡，具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、染色體重建、影響細(xì)胞分化、細(xì)胞保護(hù)、抗氧化、抗炎等作用[8-11]。燒傷后在心肌中，缺血、缺氧通過組蛋白H3/H4去乙酰化誘導(dǎo)組蛋白去乙?；磻?yīng)，組蛋白去乙?；敢种苿┠芙档蜋C(jī)體對(duì)缺血、缺氧性損傷的反應(yīng)，在某種程度上阻斷了缺血缺氧誘導(dǎo)的基因程序的激活[12]。本實(shí)驗(yàn)通過建立50%三度燙傷大鼠模型，觀察SAHA對(duì)心臟功能的影響，大鼠在致死性燙傷傷后，燙傷組CK-MB水平顯著升高，心肌組織含水率明顯增加，心肌水腫，心肌結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂，組織間隙水腫加重，而給予SAHA處理后，CK-MB水平較燙傷組明顯降低，心肌細(xì)胞水腫減輕，心肌纖維排列紊亂情況明顯好轉(zhuǎn)，說明SAHA能在一定程度上保護(hù)心肌功能，減輕心肌細(xì)胞水腫，保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)完整。

在缺血、缺氧誘導(dǎo)心肌損傷過程中，早期出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，影響心臟功能。沈帆等[13]證實(shí)，SAHA通過抑制氧化應(yīng)激改善間歇性低氧小鼠的心肌損傷。Nagata等[14]證實(shí)，SAHA通過誘導(dǎo)心肌內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)，改善心臟功能，延緩心肌梗死后心力衰竭的發(fā)展。Yang等[15]證實(shí)，在小鼠缺血再灌注損傷模型中，SAHA可預(yù)防缺血再灌注引起的心肌內(nèi)線粒體功能障礙和丟失，并減少缺血前后心肌ROS的產(chǎn)生，保護(hù)心臟功能。Caspase-3活性增加表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，是細(xì)胞凋亡的重要檢測(cè)指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，燙傷后心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，隨傷后時(shí)間增加，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量持續(xù)增加，而caspase-3活性也顯著升高，而給予SAHA治療后，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，caspase-3活性明顯降低。本研究表明， SAHA能保護(hù)致死性燙傷大鼠心臟功能，可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、caspase-3活性有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過SAHA對(duì)50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心臟功能的影響研究，證實(shí)SAHA能保護(hù)致死性燙傷大鼠心臟功能，降低CK-MB水平，減輕心肌組織水腫，其作用機(jī)制可能與降低心肌組織內(nèi)caspase-3活性、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。