IGFBP-4對A549細(xì)胞免疫原性細(xì)胞死亡的作用及其機制

藍秀，李偉文，孫蕾，黎媛，趙嘉璐

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 呼吸科，浙江 麗水 323000

據(jù)報道，肺癌年發(fā)病例數(shù)高達182萬以上，每年約有160萬例肺癌患者死亡[1]，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病總數(shù)的85%，且以中晚期肺癌為主，5年存活率也小于15%[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)多種藥物不僅能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，還能促進瀕死細(xì)胞釋放免疫原性，促使細(xì)胞發(fā)生免疫原性凋亡，即為免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD）。探索有效刺激的方法和途徑已是腫瘤免疫治療的熱點話題[4-6]。IGFBP-4是細(xì)胞內(nèi)最小的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（insulin-like grouth factor binding protein，IGFBPs），可分泌至細(xì)胞外，發(fā)揮生物學(xué)功能，研究表明肺癌組織中IGFBP-4低表達促使細(xì)胞增殖、遷移，IGFBP-4缺乏是肺癌不良預(yù)后的重要原因[7-8]，然而，IGFBP-4對ICD的影響及機制仍未明確。本研究重點關(guān)注外源性IGFBP-4對ICD的影響，并初步探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 重組人IGFBP-4 蛋白（批號：804-GB-025，純度≥97%），購自美國R&D Systems公司，N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC，批號：ST1546）、ROS檢測試劑盒（批號：S0033）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法，批號：S0101）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號：S0131）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。p38 siRNA質(zhì)粒（sc-29433）、磷酸化（p）-p38抗體（sc-166182）、p38抗體（sc-81621）、Actin抗體（sc-8432）購自圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司。Calreticulin抗體購自英國Abcam公司，高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）ELISA試劑盒購自Arigo Biolaboratories公司（中國臺灣），A549肺癌細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：用10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)，將A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，置入37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合大于80%時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組：將A549細(xì)胞分為對照組、IGFBP-4 組、IGFBP-4+NAC組和IGFBP4+si-p38組。IGFBP-4組細(xì)胞予50 ng/mL IGFBP-4處理；IGFBP-4+NAC組細(xì)胞予5 μmol/L NAC預(yù)處理12 h后，再用50 ng/mL的IGFBP-4處理。IGFBP-4+si-p38組用p38 siRNA質(zhì)粒預(yù)處理12 h后，再用50 ng/mL的IGFBP-4處理。對照組用等量的PBS處理。

1.2.3 MTT法檢測IGFBP-4對細(xì)胞生長存活的影響：將2×103個/mL的A549細(xì)胞接種于96孔板，每孔 200 μL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)后，按照分組方法加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出96孔板，加入20 μL MTT，37 ℃溫箱反應(yīng)1～2 h，再加入二甲基亞砜（DMSO）120 μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在492 nm波長處檢測A值。計算細(xì)胞存活率=（濃度A值-空白孔A 值/對照組A值-空白孔A值）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin， CRT）表達：將1×105個/mL的A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)后，按照分組方法加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，并用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞5×106個/mL。取500 μL細(xì)胞懸液加入適量的兔抗人CRT多克隆抗體（按1:1 000比例稀釋），在室溫條件下，孵育30 min；經(jīng)PBS洗滌3次后，加入適量的PE標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體，在室溫條件下，孵育1 h，再次用PBS洗滌后上機檢測。

1.2.5 ELISA法檢測培養(yǎng)基中HMGB1釋放：將1× 105個/mL的A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)后，按照分組方法加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，離心去除細(xì)胞、顆粒等雜質(zhì)后，根據(jù)HMGB1 ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測HMGB1的釋放量。

1.2.6 酶標(biāo)儀技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA的含量：將1×105個/mL的A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔200 μL， 置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)后，按照分組方法加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，并用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞5×106個/mL。根據(jù)總SOD活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒說明書進行操作后上機檢測，設(shè)置吸收波長為450 nm。

1.2.7 二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-CA）法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量：將1×105個/mL的A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)后，按照分組方法加藥后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，并用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞5×106個/mL。按照ROS試劑盒檢測方法，取終濃度為10 μmol/L的DCFH-CA重懸細(xì)胞，置入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，以無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3 次后，轉(zhuǎn)至流式細(xì)胞儀，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長檢測。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達：按照分組條件處理細(xì)胞后，用120～150 μL RIPA裂解液冰上裂解10～15 min，并收集細(xì)胞裂解液。取20 mg總蛋白用4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠置于伯樂電泳儀（Bio-Rad）電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF，3%脫脂牛奶室溫封閉30～60 min。加入一抗4 ℃孵育過夜后，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1～2 h，用ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，用Image J軟件測量各個條帶的灰度值。計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示，用單因素方差分析進行顯著性檢驗，組間兩兩比較采用SNKq檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGFBP-4抑制細(xì)胞增殖 與對照組比較，IGFBP-4 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 IGFBP-4抑制細(xì)胞增殖

2.2 IGFBP-4抑制A549細(xì)胞p-p38和p38的表達 與對照組比較，IGFBP-4組p-p38和p38表達顯著升高（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組p-p38和p38表達顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

2.3 IGFBP-4誘發(fā)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激 與對照組比較，IGFBP-4組ROS、MDA顯著升高，SOD顯著下降（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組ROS、MDA顯著降低，SOD顯著增高 （P＜0.05）。見圖3。

2.4 IGFBP-4誘發(fā)A549細(xì)胞發(fā)生ICD 與對照組比較，IGFBP-4組HMGB1、CRT顯著升高（P＜0.05）；與IGFBP-4組比較，IGFBP-4+NAC組和IGFBP-4+si-p38組HMGB1、CRT顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

IGFBP-4是分子量最小的IGFBPs家族成員，能分泌到細(xì)胞外，與IGF競爭結(jié)合IGF受體，即激活I(lǐng)GF依賴途徑，抑制IGF的生物學(xué)功能。研究表明IGFBP-4可通過非IGF依賴途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長[7-9]。 前期研究證實IGFBP-4顯著下調(diào)A549細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達，抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲[8]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IGFBP-4處理后A549細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA的含量增加，SOD水平降低，用氧自由基清除劑NAC處理后，細(xì)胞存活率較IGFBP-4組明顯升高，說明IGFBP-4通過誘發(fā)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞存活。

ICD是指細(xì)胞接受化療藥物、消融、放射等外部因素刺激后，瀕臨死亡的腫瘤細(xì)胞功能改變，并釋放CRT、HMGB1等信號分子，激活抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程[6]。本研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-4處理后，A549細(xì)胞膜上的CRT和HMGB1含量顯著增加，提示IGFBP-4能夠誘發(fā)A549細(xì)胞ICD的發(fā)生，而用NAC處理后，CRT和HMGB1含量顯著下降，提示A549細(xì)胞發(fā)生ICD與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)。

圖2 IGFBP-4抑制細(xì)胞p-p38和p38的表達

圖4 IGFBP-4促進A549細(xì)胞分泌HMGB1、CRT表達

p38是MAPK信號通路關(guān)鍵激酶，p38激活能促進其下游分子表達，調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活和死 亡[10-12]。p38還能介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達，參與炎癥反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)藥物誘發(fā)p38 MAPK通路活 化，能夠刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生ICD，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-4處理后，細(xì)胞內(nèi)p38和p-p38表達顯著增加，提示IGFBP-4激活了p38 MAPK信號通路。利用si-RNA降低A549細(xì)胞內(nèi)源性p38的表達后，本研究發(fā)現(xiàn)si-p38顯著下調(diào)CRT和HMGB1表達，增加細(xì)胞的存活性，提示IGFBP-4通過p38促使A549細(xì)胞發(fā)生ICD，這與既往研究[14]結(jié)果類似。本研究還發(fā)現(xiàn)si-p38 能顯著降低IGFBP-4 誘導(dǎo)的ROS、MDA含量增高，增加SOD的含量，提示p38還與IGFBP-4誘導(dǎo)ROS升高有關(guān)。

綜上所述，IGFBP-4能夠激活p38 MAPK信號通路，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，促使細(xì)胞發(fā)生ICD，抑制A549肺癌細(xì)胞增殖，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。