靜原雞AK1基因序列分析及真核表達載體的構(gòu)建

張 娟，虎紅紅，鄧占釗，母 童，顧亞玲，辛國省

(1寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川750021；2彭陽縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 彭陽756599；3寧夏大學生命科學學院/寧夏飼料工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川750021)

靜原雞主要分布于寧夏彭陽縣和甘肅靜寧縣，2006年被農(nóng)業(yè)部認定為地方優(yōu)良品種，已被列入國家級畜禽遺傳資源保護名錄[1]，根據(jù)羽色的不同，分為白羽、麻羽和黑羽3個群體。由于長期處于氣候高寒濕潤、地形起伏、牧草及昆蟲眾多的生活環(huán)境和優(yōu)越的地理位置，靜原雞具有耐粗飼、抗逆性強、氨基酸含量豐富、肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)和滋補價值高等特點，尤其多不飽和脂肪酸(二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸)含量較高[2]，符合現(xiàn)今人們對高品質(zhì)雞肉的要求，屬雞肉中優(yōu)選的綠色食品[3]。

腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)是一種普遍存在于動植物體內(nèi)的單體酶，對生物的生長和維持至關(guān)重要[4]，主要調(diào)節(jié)腺嘌呤核苷酸代謝，催化反應(yīng)：ATP+AMP?2ADP，在維持細胞能量平衡中起著不可或缺的作用[5]。在哺乳動物中，有幾種AK 亞型具有組織特異性分布和獨特的亞細胞定位[6]，其中AK1蛋白被認為是骨骼肌細胞質(zhì)中的主要AK亞型[7]。豬心臟中胞質(zhì)酶AK1蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)被Schulz等[8]和Sachsenheimer 等[9]準確測定。有研究表明，AK1基因缺失的小鼠盡管肌肉形成正常，但由于ADP的異常積累會導(dǎo)致骨骼肌松弛延遲[10]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)AK1蛋白磷酸化可能是質(zhì)膜線粒體和KATP 通道之間傳遞信號所必需的[11]。目前關(guān)于AK1基因的研究集中在與溶血性貧血相關(guān)的罕見遺傳疾病中，國內(nèi)外將AK1作為肌苷酸影響基因及有關(guān)AK1基因結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測的研究鮮有報道。

本研究通過對寧夏優(yōu)良地方品種靜原雞AK1基因CDS區(qū)序列進行擴增、克隆、構(gòu)建其真核表達載體，運用生物信息學分析方法預(yù)測其理化性質(zhì)、親水性/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點、亞細胞定位、磷酸化位點、B細胞抗原表位、基因共表達、Cp G島、蛋白的空間結(jié)構(gòu)等，為后續(xù)深入研究AK1基因蛋白水平、代謝水平和細胞功能研究等的調(diào)控機理和表達模式提供科學依據(jù)，并為我國地方品種雞的分子育種技術(shù)平臺奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

隨機屠宰寧夏彭陽縣朝那雞繁育中心180日齡靜原雞公、母各15只(飼養(yǎng)管理條件相同)，采集腿肌、胸肌于液氮罐中，帶回實驗室于?80℃保存?zhèn)溆?。試劑：Trizo，Hifair?Ⅱ1st Strand c DNA Synthesis Super Mix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒(上海翊圣生物公司)，DNA loading buffer(百泰克)，核酸染料(索萊寶)，p MD18-T、DH5α、質(zhì)粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒(天根)，T 4連接酶(NEB)，EcoRⅠ、BamHⅠ(寶生物有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄 通過傳統(tǒng)Trizo(Invitrogen,USA)法提取靜原雞腿肌、胸肌的總RNA，并對其RNA 的純度、完整性、濃度進行檢測。采用Hifair?Ⅱ1st Strand c DNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒合成cDNA 后，于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AK1基因的引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 上已公布的原雞AK1基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 靜原雞AK1基因CDS區(qū)引物序列Table1 Primer sequencefor CDSregion in AK1 gene of Jingyuan chicken

1.2.3AK1基因CDS區(qū)擴增、克隆及測序PCR擴增總體系為20μL：cDNA 樣品1μL，上、下游引物各0.5μL，TaqPCR Master Mix 11μL，ddH2O 7μL。AK1基因CDS區(qū)PCR 擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火40 s，72℃延伸45 s，共31個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物通過10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對目的片段進行回收。

將回收純化好的目的片段與pMD18-T 載體4 ℃下連接并過夜。將連接好的帶有pMD18-T 載體的目的片段轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，冰浴3 min，加入無抗液體LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床150 r/min 振蕩培養(yǎng)45 min，涂布于含氨芐抗性的LB平板培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)12～16 h，隨機挑取5個單菌落放入含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基220 r/min 震蕩培養(yǎng)8 h，菌液PCR 擴增。收集菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.4A K 1載體的構(gòu)建 引物設(shè)計合成見“1.2.2”，擴增回收同“1.2.3”，選擇p EGFPN1真核表達載體進行質(zhì)粒提取。利用EcoRⅠ、BamHⅠ對AK1基因與pEGFP-N1質(zhì)粒進行雙酶切，雙酶切體系為50μL，具體加入量分別為：11μL dd H2O，5μL 10×Buff er，2μLEcoRⅠ，2μLBamHⅠ，30μL 重組質(zhì)粒(目的片段)。37℃酶切6 h 后使用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收pEGFP-N1載體片段和AK1目的片段，AK1基因與pEGFP-N1載體的酶切回收片段經(jīng)過T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化。AK1-pEGFP-N1載體進行雙酶切鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.5AK1基因生物信息學分析 采用BioEdit 軟件對AK1基因的核苷酸序列進行比對，分析堿基組成、氨基酸數(shù)目及組成；相對分子質(zhì)量和等電點運用在線網(wǎng)站expasy 的protparam 程序(http://web.ex pasy.org/protparam/)進行分析；蛋白質(zhì)親水性運用在線網(wǎng)站expasy 的protscale程序(https://web.ex pasy.org/protscale/)進行分析；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)運用在線網(wǎng)站swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)進行預(yù)測；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域運用在線網(wǎng)站

TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行預(yù)測；磷酸化位點運用在線網(wǎng)站NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行預(yù)測；B細胞抗原表位運用在線網(wǎng)站immuneepitope的bcell程序(http://tools.immuneepitope.org/main/bcell/)進行分析；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)運用在線網(wǎng)站psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進行預(yù)測；基因共表達和GO功能注釋分析通過在線網(wǎng)站string(https://string-db.org/)進行分析；CpG 島運用在線網(wǎng)站novopro(http://www.novopro.cn/tools/cpg_islands.html)進行預(yù)測；基因的亞細胞定位通過在線網(wǎng)站psort Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取

靜原雞胸肌、腿肌總RNA 通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，可清晰看到3個條帶，無明顯降解。核酸蛋白儀檢測RNA 的D260nm/D280nm在1.8～2.2之間，完整性較好(RIN≥6.5)，可用于后續(xù)試驗。

圖1 靜原雞不同組織總RNA 提取Fig.1 Total RNA extr action fr om differ ent tissues of Jingyuan chicken

2.2 AK1 基因CDS區(qū)擴增及克隆

PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)凝膠成像儀檢測發(fā)現(xiàn)擴增片段條帶整齊明亮且無引物二聚體等雜帶，表明引物特異性較好，擴增條件合適。CDS區(qū)擴增產(chǎn)物條帶長度大小約為741 bp，與預(yù)期目的片段長度大小相符(圖2)，可以進行回收純化；回收后產(chǎn)物連接pMD18-T載體進行克隆，菌液PCR 鑒定片段大小與預(yù)期目的片段一致。

2.3 AK1 基因加酶切位點擴增

AK1基因CDS區(qū)加酶切位點擴增產(chǎn)物條帶長度大小約為759 bp，與預(yù)期目的片段長度大小相符(圖3)，可以進行回收純化及菌液擴增。

圖2 靜原雞AK1 基因PCR 擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification of AK1 gene in Jingyuan chicken

圖3 靜原雞AK1 基因加酶切位點PCR 擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification of AK1 gene with restriction site in Jingyuan chicken

2.4 AK1-pEGFP-N1載體的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒AK 1-p EGFP-N 1經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ37℃雙酶切6 h 后，經(jīng)10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測得到4 033和759 bp的2個片段(圖4)，一個為質(zhì)粒pEGFP-N1本身的片段，為4033 bp，一個為目的基因AK1的片段，約為759 bp，酶切結(jié)果說明AK1基因與pEGFP-N1載體正確重組。將菌液通過甘油保存后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖4 靜原雞AK1-p EGFP-N1載體酶切電泳圖Fig.4 Restrictive enzyme digestion and electrophoresis of AK1-p EGFP-N1 vector in Jingyuan chicken

2.5 AK1基因CDS區(qū)生物信息學分析

2.5.1AK1基因編碼區(qū)堿基組成分析 測序后對靜原雞AK1基因序列進行校正、拼接，AK1基因CDS區(qū)全長585 bp，共編碼194個氨基酸(圖5)。核苷酸組成分析(圖6)發(fā)現(xiàn)AK1基因CDS區(qū)鳥嘌呤(G)核苷酸數(shù)量占比最多(33.68%)，胸腺嘧啶(T)核苷酸占比最少(16.41%)，腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)數(shù)目相當，且G+C含量(60.00%)高于A+T含量(40.00%)。編碼區(qū)DNA 單鏈和雙鏈相對分子質(zhì)量分別為177991和356652。

圖5 AK1 基因編碼區(qū)全長序列與對應(yīng)的氨基酸序列Fig.5 Thefull length coding sequence of AK1 geneand corresponding amino acid sequence

圖6 AK1基因CDS區(qū)核苷酸組成Fig.6 Nucleotidecomposition in CDSregion of AK1 gene

2.5.2AK1基因編碼氨基酸序列及蛋白的理化分析 靜原雞AK1基因編碼蛋白質(zhì)的各種氨基酸中賴氨酸(Lys)數(shù)目占比最多(11.3%)，天冬酰胺(Asn)和半胱氨酸(Cys)數(shù)目占比最少(1.0%)(表2)。氨基

表2 AK1基因編碼蛋白的氨基酸組成Table 2 The composition of amino acid coded by AK1 gene

酸殘基中正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為32個，負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為29個。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，靜原雞AK1蛋白的原子組成為C962H1566N262O291S7，相對分子質(zhì)量為21683，理論等電點為8.68，不穩(wěn)定指數(shù)為21.56，脂肪指數(shù)為85.88。

2.5.3AK1基因編碼蛋白的親水性/疏水性 使用在線分析網(wǎng)站對靜原雞AK1基因編碼蛋白對水分子的親和力進行研究的結(jié)果(圖7)表明，第15位纈氨酸(Val)疏水性最強(最高分數(shù)1.933)，第105位谷氨酸(Glu)親水性最強(最低分數(shù)?2.589)，總體親水性均值小于0(?0.469)，說明該蛋白具有較強的親水區(qū)域。

圖7 靜原雞AK1蛋白的疏水性/親水性分析Fig.7 Hydrophobic/hydrophilic analysis for AK1 protein in Jingyuan chicken

2.5.4AK1基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和CpG島預(yù)測 采用在線軟件TMHMM-2.0的預(yù)測結(jié)果表明靜原雞AK1基因的編碼蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白。CpG 島預(yù)測顯示，AK1基因編碼蛋白存在2個CpG 島。

2.5.5AK1基因編碼蛋白的磷酸化位點 靜原雞AK1蛋白可能存在7個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，分別位于氨基酸序列上第20、39、50、52、88、137、189位，8個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，分別位于第3、24、36、87、136、146、153、179位，3個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，分別位于第35、118、155位(圖8)。

2.5.6AK1基因編碼蛋白的B細胞抗原表位預(yù)測利用immuneepitope在線軟件預(yù)測AK1基因編碼蛋白的抗原表位(圖9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜原雞AK1蛋白存在10個B細胞抗原表位，分別位于1、17～25、38、48～56、85～88、97～111、122～124、134～147、155～158、176～181位氨基酸殘基。

圖8 靜原雞AK1蛋白磷酸化位點Fig.8 Thephosphorylation sites of AK1 protein in Jingyuan chicken

圖9 AK1蛋白B 抗原表位預(yù)測Fig.9 Prediction of B epitope of AK1 protein

2.5.7AK1基因編碼蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖10)顯示，靜原雞AK1蛋白含有8.76%的伸展鏈，46.91%的α–螺旋，44.33%的無規(guī)則卷曲。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果仍以α–螺旋和無規(guī)則卷曲為主(相似性為86.39%)(圖11)。

2.5.8AK1基因共表達分析 通過string數(shù)據(jù)庫對AK1基因進行共表達分析，發(fā)現(xiàn)在原雞中AK1和AMPD1、PKM2存在共表達，共表達系數(shù)分別為0.116和0.063。PKM2與AMPD1共表達系數(shù)為0.067，AMPD1與AMPD3共表達系數(shù)為0.082。在其他有機體中AK1與AMPD3、AMPD1、NTPCR、PNPT1、CD39L1、PKM2、APRT、ADSL、ADK和TPK1均存在共表達。

圖10 靜原雞AK1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)Fig.10 The secondary structure of AK 1 protein in Jingyuan chicken

圖11 靜原雞AK1蛋白質(zhì)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)Fig.11 The predicted tertiary structure of AK1 protein in Jingyuan chicken

2.5.9AK1基因編碼蛋白亞細胞定位 通過在線工具psortⅡ預(yù)測AK1基因編碼產(chǎn)物的亞細胞定位，其分布在細胞質(zhì)的可能性為52.2%，分布在細胞骨架的可能性為17.4%，分布在細胞核中的可能性為13.0%，分布在線粒體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的可能性分別為8.7%、4.3%、4.3%。由此推斷，AK1基因編碼產(chǎn)物主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮生物學作用。

2.5.10AK1基因的GO富集分析 通過string數(shù)據(jù)庫對AK1基因進行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)AK1基因參與4個分子功能GO條目，參與11個生物學過程GO條目，參與1個細胞組分GO條目(表3)。

表3 AK1基因的GO注釋分析Table 3 GO annotation analysis of AK1 gene

3 討論與結(jié)論

隨著生命科學的發(fā)展，為揭示復(fù)雜的基因組信息結(jié)構(gòu)及遺傳語言的根本規(guī)律就出現(xiàn)了生物信息學，生物信息學為大數(shù)據(jù)“插上翅膀”，不僅給生命科學、農(nóng)學、遺傳學、細胞生物學和生物醫(yī)學帶來巨大的推動力且具有誘人的前景，它已經(jīng)滲透到人類基因組研究的各個層面，如基因組、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、疾病潛在靶點基因預(yù)測以及系統(tǒng)發(fā)育分析的研究[12-13]。

腺苷酸激酶(AK)普遍存在于生物體，催化腺嘌呤核苷酸的相互轉(zhuǎn)化：Mg2++ATP+AMP=Mg2++2ADP，在不同哺乳動物組織中已經(jīng)鑒定出6種1型AK 同工酶(AK1)[14]，它們的主要功能是維持細胞的能量穩(wěn)態(tài)，處理與細胞能量利用相關(guān)的代謝信號，并為核酸合成提供核苷酸[15-16]。AK1是一種小型胞質(zhì)酶，在骨骼肌、紅細胞和腦等高周轉(zhuǎn)率細胞中表達，其活性依賴于Mg2+或Mn2+離子，在沒有AK1的情況下腺嘌呤核苷酸大量減少[17]。雞AK1基因約為6000堿基對，由7個外顯子組成，Suminami等[18]在雞AK1和牛線粒體腺苷酸激酶(AK2)之間的點陣圖發(fā)現(xiàn)，AK1基因可能是通過缺失1個或多個外顯子從AK2基因進化而來的。有研究表明雞AK1的一級結(jié)構(gòu)與豬AK1的一級結(jié)構(gòu)有85%的相似性，因此，提出豬AK1的二級和三級結(jié)構(gòu)[19]也將適用于雞AK1，而且發(fā)現(xiàn)AK1外顯子4相對應(yīng)的區(qū)域與AK2A構(gòu)象的相似性最高，已知該區(qū)域有助于ATP結(jié)合和催化功能[20]。本研究發(fā)現(xiàn)靜原雞AK1基因CDS區(qū)共編碼194個氨基酸，理論等電點為8.68(＞7)，不穩(wěn)定指數(shù)為21.56(＜40)，脂肪指數(shù)為85.88，推斷該蛋白是堿性穩(wěn)定蛋白[21]，蛋白的穩(wěn)定性會直接影響生物的生命活動和細胞周期，因此，AK 1蛋白具有穩(wěn)定的細胞周期和生命活動。AK1蛋白總體親水性均值為?0.469(＜0)，說明該蛋白是可溶性蛋白。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AK1蛋白不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，說明該蛋白不是一個膜蛋白，不能通過膜受體來發(fā)揮作用，對其進行純化可能較為簡單。磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)AK1蛋白存在8個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點、7個絲氨酸(Ser)磷酸化位點和3個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，這些位點可以調(diào)節(jié)一些細胞的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該蛋白可能需要通過翻譯后的磷酸化和去磷酸化影響細胞生長、分化以及基因表達[22]，這與Carrasco等[11]發(fā)現(xiàn)AK1磷酸化可能是在質(zhì)膜線粒體和KATP通道之間傳遞信號所必需的的研究結(jié)果一致。蛋白二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)AK 1蛋白以α–螺旋和無規(guī)則卷曲為主，且二級結(jié)構(gòu)為混合模型[23]，因此可能通過影響蛋白質(zhì)肽鏈中配體和受體結(jié)合的活性[24]，進而影響蛋白的功能。趙驍?shù)萚25]等研究發(fā)現(xiàn)如果β–轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲在蛋白中占比居多，則會出現(xiàn)抗原表位較多的現(xiàn)象，因此，AK1蛋白抗原表位預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有10個B細胞抗原表位?；蚬脖磉_分析發(fā)現(xiàn)，在原雞中AK1和AMPD1、PKM2存在共表達，而AMPD1和PKM2都是肌苷酸(Inosinc acid,IMP)從頭合成途徑的關(guān)鍵基因，因此AK1可能存在與AMPD1與PKM2相似的功能，可將AK1基因作為與IMP相關(guān)的功能基因進行研究。Cp G 島常位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，靜原雞AK1基因存在2個CpG 島，這為后期AK1基因轉(zhuǎn)錄區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)的研究十分重要。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)AK1蛋白位于細胞質(zhì)中，與基因進行GO細胞組分分析和Choo等[26]研究結(jié)果一致，由此推斷該蛋白主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮生物學作用。

綜上，本研究通過生物信息分析對前期轉(zhuǎn)錄組篩選的靜原雞不同部位與IMP相關(guān)的關(guān)鍵差異基因AK1進行分析并通過分子生物學的方法構(gòu)建其真核表達載體AK1-pEGFP-N1。

靜原雞AK1基因CDS區(qū)全長585 bp，AK1蛋白含有194個氨基酸，是具有較強的親水區(qū)域的非跨膜蛋白，AK1蛋白可能存在7個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，8個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，3個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，并且具有10個B細胞抗原表位，2個CpG 島，預(yù)測其在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，與AMPD1、PKM2、ADSL存在共表達，AK1蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均以α–螺旋和無規(guī)則卷曲為主(相似性為86.39%)。