油用牡丹籽中牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的提取分離及含量測定

靳文娟 陳田甜 陳文普 謝娟平 杜燕 王賽

摘要?以超聲輔助的水酶法/水代法提取工藝為基礎(chǔ)，利用牡丹籽油和牡丹籽粗蛋白的乳化作用和牡丹籽粗多糖的水溶性，初步分離牡丹籽油和牡丹籽粗多糖。采用冷凍解凍破乳法得到了牡丹籽油和少量牡丹籽粗蛋白;牡丹籽粗多糖的水溶液利用D101大孔樹脂層析和DEAE-52纖維素柱層析聯(lián)用，脫色純化分離，得到偏中性和酸性的牡丹籽多糖。實現(xiàn)了牡丹籽油、牡丹籽粗多糖和少量牡丹籽粗蛋白的提取分離，并分別采用氣相色譜法、苯酚硫酸法、凱氏定氮法測定了其含量。結(jié)果表明：綜合提取工藝操作簡單、成本低，得到的牡丹籽油亞麻酸和亞油酸的含量分別為199～216、178～182 g/kg;牡丹籽粗多糖得率為100.1～123.4 g/kg，牡丹籽粗蛋白得率為65.8～66.2 g/kg。

關(guān)鍵詞?牡丹籽油;牡丹籽粗多糖;提取分離;含量測定

中圖分類號?TS229?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0146-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.039

Abstract?Used the emulsification of peony seed oil and crude protein and the water solubility of the crude polysaccharide of peony seed to preliminarily separate the crude polysaccharide and oil in the peony seed which was based on the ultrasonic assisted aqueous enzymatic/aqueous extraction process.Peony seed oil and a small amount of crude protein of peony seed were obtained by freeze-thaw demulsification method.The aqueous solution of the crude polysaccharide of peony seed was decolorized and separated by D101 macroporous resin chromatography and DEAE-52 cellulose column chromatography.And then obtained the neutral and acid polysaccharide of peony seed.The extraction and separation of peony seed oil，peony seed crude polysaccharide and a small amount of peony seed crude protein were realized，and their contents were determined by gas chromatography，phenol sulfuric acid and Kjeldahl method respectively.The results showed that the comprehensive extraction process was simple and low-cost，the contents of linoleic acid and linoleic acid in peony seed oil were 199-216 g/kg crude oil and 178-182 g/kg crude oil，respectively; the yields of crude polysaccharide and crude protein were 100.1-123.4 g/kg and 65.8-66.2 g/kg，respectively.

Key words?Peony seed oil;Peony seed crude polysaccharide;Extraction and separation;Content determination

油用牡丹是一種新興的木本油料作物，在我國已廣泛種植，近年來，在牡丹籽油市場需求的拉動下，油用牡丹的種植面積也在逐年擴大，牡丹主產(chǎn)區(qū)的種植面積有望在 5～10 年超過20萬hm2[1]，而每公頃油用牡丹約可產(chǎn)出3 750 kg牡丹籽，高產(chǎn)量促進了牡丹籽綜合開發(fā)利用研究。目前，牡丹籽除用于提取牡丹籽油[2-3]外，提取剩余物牡丹籽粕的加工利用也逐漸被重視，有研究報道[4]牡丹籽粕含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，按含量高低依次為粗脂肪、粗蛋白、可溶性多糖、纖維、氨基酸、微量元素等。牡丹籽多糖作為一種植物多糖，具有多種生理活性，應(yīng)用前景廣泛[5-7]。文獻報道中多以牡丹籽油提取后的牡丹籽粕為原料，提取牡丹籽多糖，但常用的牡丹籽油提取工藝，如溶劑浸提法、壓榨法等，未考慮對其他活性成分的影響，其提取純化過程可能會造成其他營養(yǎng)物質(zhì)變質(zhì)損失。水酶法和水代法具有操作條件溫和、無有機溶劑污染、高效綠色的特性，為牡丹籽油和牡丹籽多糖等營養(yǎng)成分同時提取提供了基礎(chǔ)。

該研究以牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的綜合提取為目的，以超聲輔助的水酶法和水代法為基礎(chǔ)，設(shè)計了提取路線。該研究設(shè)計的提取工藝，綜合考慮了牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的特性，以水為溶劑，利用各物質(zhì)不同的溶解特性，設(shè)計提取分離工藝，成本低、易于操作，為牡丹籽油、牡丹籽多糖的同時提取分離提供了綠色簡單的工藝路線，以期為促進油用牡丹籽的綜合開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?試劑與儀器

油用牡丹籽購于安康市旬陽縣江森源實業(yè)有限公司;亞麻酸甲酯標準品、亞油酸甲酯標準品、中性蛋白酶購于北京索來寶生物科技有限公司;濃鹽酸、濃硫酸、硼酸、氫苯酚、氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸銅、硫酸鉀、無水乙醇、石油醚（30-60）、無水甲醇均為分析純，購于天津百世化工有限公司;D101大孔吸附樹脂、DEAE-52纖維素購于北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

CM-0406型離心機，上海醫(yī)療器械有限公司;WR-50微型粉碎機，天冠儀器儀表有限公司;KH2200E型超聲波清洗器（超聲頻率40 kHz，超聲功率80 W，加熱功率600 W），昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器設(shè)備有限公司;SP-1900型雙光束紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;UPT-K1600自動凱氏定氮儀，北京優(yōu)譜通用科技有限公司;GC5890N型氣相色譜儀，南京科捷分析儀器有限公司。

1.2?方法

牡丹籽油、粗蛋白、粗多糖綜合提取工藝流程見圖1。

1.2.1?牡丹籽油和牡丹籽蛋白的提取分離。

1.2.1.1?牡丹籽的炒制與粉碎。將牡丹籽半破殼（用剪刀剪一條縫），與1.5倍體積的砂石混合，鐵鍋小火炒制10 min后，篩分去除砂石，牡丹籽去殼，粉碎過65號篩（250 μm）備用[8]。

1.2.1.2?水酶法和水代法提牡丹籽油。

牡丹籽油的提取分別采用水酶法和水代法。水酶法[9-10]提取工藝條件：取20 g炒制過的牡丹籽粉末，以料液比1∶25加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH=7，加入0.2 g中性蛋白酶，機械攪拌800 r/min ，超聲輔助溫度45 ℃、提取時間60 min，提取2次后，升溫到65 ℃滅活中性蛋白酶。

水代法[11-12]工藝條件：取20 g炒制過的牡丹籽粉末，以料液比1∶25加入蒸餾水，機械攪拌800 r/min，超聲輔助溫度45 ℃、提取時間60 min，提取2次合并濾液。

1.2.1.3?乳液層的破乳分離。

采用破乳效果好且操作簡單的冷凍解凍破乳法[13]：提取完成后，渾濁液4 000 r/min離心10 min，可分為3層，收集上層，水包油的白色乳液狀，冷凍過夜后，室溫下解凍，4 000 r/min離心10 min，分層，膠頭滴管吸取上層油層，即為牡丹籽油，收集下層沉淀。重復(fù)冷凍—解凍—分離操作3次，合并提取物。

1.2.2?牡丹籽多糖的提取及純化。D101大孔樹脂和DEAE-52纖維素預(yù)處理[14-15]后裝柱。

將牡丹籽油提取后離心過的中層水相，濃縮至10 mL后上樣至D101大孔吸附樹脂層析柱，用蒸餾水和5%的乙醇溶液洗脫，流速1 mL/min，收集洗脫液。洗脫液減壓濃縮至20 mL后上樣至DEAE-52纖維柱，分別用蒸餾水，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液依次洗脫，洗脫液分別減壓濃縮至20 mL，用苯酚硫酸法測定其多糖含量。

1.3?含量測定

1.3.1?牡丹籽油脂肪酸甲酯含量及蛋白質(zhì)含量的測定。乳液層破乳后所得牡丹籽油的中亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯含量用氣相色譜測定[16];白色沉淀中蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定[17]。

不同方法提取得到的牡丹籽油樣品的預(yù)處理：取400 μL油樣于10 mL磨口試管中，加入400 μL乙醚-石油醚（1∶1）混合液，30 ℃下振蕩搖勻，再加入200 μL 的KOH-CH3OH溶液（0.4 mol / L），搖蕩使油脂全部轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，靜置15 min后加入少許蒸餾水，靜置分層后取上層液，過0.45 μm有機濾膜后，用氣相色譜分析脂肪酸含量。氣相色譜條件：ZNOWAX毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;載氣為高純度的氮氣;升溫程序為以 10 ℃/min 升溫至 120 ℃，保持 2 min，再以8 ℃/min 升溫到 240 ℃，保持 10 min;載氣流速 1.6 mL/min;分流比 40∶1;進樣量 1 μL。

1.3.2?多糖含量的測定。葡萄糖標準曲線的繪制：分別移取 0.1、0.2、0.4、0.6、1.2、1.6 、2.0 mL 的葡萄糖標準液（1 mg/mL）至 10 mL 容量瓶中，用去離子水定容。分別移取不同濃度系列葡萄糖溶液 2 mL 至棕色試劑瓶中，加入1.0 mL 苯酚溶液（6% ）和5 mL硫酸混合均勻，室溫靜置20 min后，用紫外分光光度計在 490 nm下測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[18]：取0.2 mL的多糖提取液（柱層析洗脫液）加入1.8 mL蒸餾水后，再分別加入1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸溶液，混合均勻，室溫靜置20 min后，用紫外分光光度計檢測其在490 nm（葡萄糖的最大吸收波長）處的吸光度。再根據(jù)葡萄糖標準曲線計算出多糖含量。

2?結(jié)果與分析

2.1?破乳后牡丹籽油得率和粗蛋白含量

提取工藝分別采用超聲輔助的水酶法和水代法。結(jié)合參考文獻[9]中對水酶法提取工藝中不同酶制劑的研究結(jié)果，選擇提取率僅次于堿性蛋白酶的中性蛋白酶，不僅可促進蛋白質(zhì)水解釋放油脂，而且在中性條件下不影響牡丹籽多糖的性質(zhì)。水代法和水酶法提取液中，上層乳液層經(jīng)多次冷凍-解凍破乳后，可釋放出牡丹籽油，同時得到少量粗蛋白。由表1可知，水酶法比單純的水代法牡丹籽油的得率高16.34%[牡丹籽油得率=牡丹籽油的質(zhì)量/牡丹籽粉末的質(zhì)量（20.00 g）]。由于蛋白質(zhì)具有乳化性，易和油形成水包油的乳液，所以破乳分離牡丹籽油后，得到的白色沉淀中含有牡丹籽粗蛋白，凱氏定氮法測得水酶法和水代法得到的白色沉淀中，牡丹籽粗蛋白的含量分別為65.8、66.2 g/kg，測得原料（炒制的牡丹籽粉末）中牡丹籽粗蛋白的含量為165 g/kg。

以亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯為標品，采用單點校正法測得的水酶法和水代法提取的牡丹籽油中亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯的含量如表2、3所示，水酶法提取的牡丹籽油的總質(zhì)量為2.478 g，其中亞油酸的含量為182 g/kg、亞麻酸的含量為216 g/kg;水代法提取的牡丹籽油的總質(zhì)量為2.129 g，其中亞油酸的含量為178 g/kg、亞麻酸的含量為199 g/kg。

2.2?牡丹籽多糖含量

超聲輔助的水酶法和水代法提取液中，褐色的中間層富含水溶性的牡丹籽粗多糖，為了祛除色素體高純度，特選取脫色效果較好的D101大孔樹脂脫色處理，用蒸餾水和5%乙醇溶液洗脫，分別收集洗脫液，采用苯酚硫酸法依據(jù)圖2所示的葡萄糖標準曲線，測得水酶法提取液中牡丹籽粗多糖共128.0 mg，水代法提取液中牡丹籽粗多糖共156.1 mg。選用DEAE-52纖維柱進一步純化牡丹籽粗多糖，含量如表4、5所示，其中蒸餾水洗脫液中多糖含量最高，約占洗脫液中多糖總量的50%，說明牡丹籽粕的多糖中除酸性多糖外還有大量偏中性的多糖。水酶法和水代法提取液中牡丹籽粗多糖得率分別為100.1、123.4 mg/g（即100.1～123.4 g/kg）。

3?結(jié)論

該研究以牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的綜合提取為目的，設(shè)計提取路線，采用超聲輔助的水酶法和水代法，利用牡丹籽粗蛋白和牡丹籽油易形成白色乳液的特性和牡丹籽粗多糖的水溶性，實現(xiàn)了牡丹籽油和牡丹籽粗多糖的初步分層，用冷凍解凍破乳的方法得到了牡丹籽油和少量牡丹籽粗蛋白;采用D101大孔樹脂脫色和DEAE-52纖維素樹脂聯(lián)用，純化了牡丹籽粗多糖，得到了偏中性的蒸餾水洗脫多糖和酸性的NaCl溶液梯度洗脫多糖。就所測得的牡丹籽油得率、品質(zhì)（亞麻酸、亞油酸含量）、粗多糖提取量等參數(shù)而言，水酶法和水代法應(yīng)用于此綜合提取工藝中差別不大，相對而言，水代法操作更簡單、成本更低，適合于工業(yè)化應(yīng)用。

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