染色體分選技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

錢旺, 王秋松, 楊善,2, 徐良年,3,4*, 鄧祖湖,2,4*

染色體分選技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

錢旺1, 王秋松1, 楊善1,2, 徐良年1,3,4*, 鄧祖湖1,2,4*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心，福州 350002；2. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004; 3. 廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004; 4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

介紹了染色體分選技術(shù)的基本原理和樣品處理的基本流程，對根尖分生區(qū)采用同步化處理，制備染色體懸浮液，最后通過流式細(xì)胞儀的分析與收集獲得純度高、數(shù)量多的目標(biāo)染色體。綜述了染色體分選技術(shù)在植物學(xué)研究中的主要應(yīng)用，包括物理圖譜的構(gòu)建、DNA分子標(biāo)記的開發(fā)、以及復(fù)雜多倍體植物的基因組測序等。通過染色體分選技術(shù)的不斷完善與發(fā)展, 應(yīng)用于染色體分選的探針標(biāo)記不斷開發(fā)，以及分選后的染色體DNA純化和擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化，將為多倍體植物如甘蔗等基因組學(xué)研究提供更有效的幫助。

染色體分選；流式細(xì)胞術(shù)；基因組；多倍體植物

染色體分選技術(shù)是一種基于流式細(xì)胞儀在經(jīng)細(xì)胞周期同步化富集中期染色體的懸浮液中快速分析、分選染色體的有效手段[1]。起初，在人類基因組計(jì)劃方面研究比較多[2]，在植物方面研究很少。隨著高質(zhì)量的植物染色體懸浮液的成功制備，植物染色體分選技術(shù)的研究獲得了快速發(fā)展[3]。國外在染色體分選方面的研究報(bào)道較多，特別是捷克、美國、澳大利亞等國家, 而國內(nèi)鮮有報(bào)道。國際小麥基因組測序聯(lián)盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium, IWGSC)提出將小麥基因組分離為染色體或染色體臂組成，并構(gòu)建相應(yīng)的BAC文庫[4]。后續(xù)BAC測序和物理圖譜的構(gòu)建由IWGSC成員國分擔(dān)，我國主要是負(fù)責(zé)7DL物理圖譜構(gòu)建。通過這種“化整為零”的方法，IWGSC完成了小麥染色體的物理作圖，并使基因組測序得以完成[5]。受此鼓舞，染色體分選技術(shù)在復(fù)雜基因組植物中的應(yīng)用越來越廣泛。通過對基因組中各條染色體的分選來完成全基因組的測序，不僅解決了組裝困難的問題，而且可以進(jìn)一步研究基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化，并且可以分離出感興趣的一條或多條染色體進(jìn)行精細(xì)研究。染色體的分離使得我們可以用感興趣的基因分析染色體，例如，由于小麥基因組的高度復(fù)雜性和多倍體性阻礙了基因定位的克隆和靶標(biāo)記的開發(fā)。通過對分選得到的小麥7A、7B和7D染色體的精細(xì)研究，最終從小麥染色體臂7DS上成功克隆了俄羅斯小麥抗蚜蟲基因Dn2401并開發(fā)出11個(gè)新的與基因相關(guān)的標(biāo)記[6]。自然界中高等植物的多倍化現(xiàn)象較為普遍，對其全基因組測序和組裝還存在困難，因此采用染色體分選技術(shù)是一種不錯(cuò)的選擇。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)作為分子生物學(xué)應(yīng)用最廣、最普遍的細(xì)胞定量分析技術(shù), 具有精確、高效的優(yōu)點(diǎn)，是根據(jù)液體懸浮液細(xì)胞或其他生物大分子的理化性質(zhì)與光學(xué)參數(shù)進(jìn)行功能水平上的精確收集與分析，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)顆粒群體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分選[7]。早期流式細(xì)胞術(shù)在植物染色體分選中采用的是單色標(biāo)記，即只用一種熒光標(biāo)記物標(biāo)記懸浮液中的染色體，這樣染色體的大小可用熒光信號值的強(qiáng)弱來表示，這種熒光信號最終在計(jì)算機(jī)上表現(xiàn)為數(shù)值的大小，形態(tài)大小相近的染色體聚集在一起就形成峰或點(diǎn)，不同的染色體因自身的長短、形態(tài)而聚集成不同的峰或點(diǎn)，從而達(dá)到分選染色體的目的。但是這種分選方式要求被分選的植物染色體形態(tài)必須差異大，然而，大多數(shù)植物的染色體間形態(tài)往往差異沒那么大，因此采用單色標(biāo)記法常常難以分選到感興趣的染色體。使染色體分選技術(shù)得到迅速發(fā)展的原因是懸浮液熒光原位雜交技術(shù)與染色體分選的結(jié)合。研究人員通過設(shè)計(jì)探針，給目標(biāo)染色體標(biāo)記熒光信號，從而能夠分選感興趣的染色體進(jìn)行研究。這種利用雙色標(biāo)記進(jìn)行流式核型分析的方法在植物染色體分析中發(fā)揮了強(qiáng)大的優(yōu)勢，對完成小麥基因組測序工作發(fā)揮重要作用[5]。目前，流式細(xì)胞術(shù)在植物染色體上的應(yīng)用不僅體現(xiàn)在流式核型分析方面，也表現(xiàn)在目標(biāo)染色體物理圖譜的構(gòu)建、遺傳學(xué)標(biāo)記的開發(fā)以及染色體測序等相關(guān)研究。

1 流式細(xì)胞術(shù)染色體分選的基本原理

流式細(xì)胞術(shù)是根據(jù)細(xì)胞理化性質(zhì)，對懸浮液中的細(xì)胞群體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地分析與分選。早期其主要應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞研究，而在植物細(xì)胞學(xué)研究的應(yīng)用較晚，原因是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與動(dòng)物細(xì)胞不同, 具有細(xì)胞壁和特殊的細(xì)胞器，制備單細(xì)胞懸浮液比較困難。流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于DNA含量、檢測細(xì)胞凋亡、植物細(xì)胞周期、染色體核型和流式分子表型分析等方面研究分析[8–9]。流式細(xì)胞術(shù)分選染色體的基本原理是把經(jīng)細(xì)胞周期同步化后的根尖組織進(jìn)行酶解或進(jìn)行機(jī)械勻漿，制成染色體懸浮液，在其中加入熒光標(biāo)記探針與靶染色體進(jìn)行雜交，制成熒光染色體懸浮液。然后，將其加入到流式細(xì)胞儀中，在鞘液帶動(dòng)下高速通過光學(xué)檢測系統(tǒng)，流式細(xì)胞儀中熒光信號的相對強(qiáng)度表現(xiàn)為染色體的含量。通過流式細(xì)胞儀可以將熒光標(biāo)記的染色體信息可視化地表現(xiàn)在電腦上，結(jié)果可以用染色體分布的一維直方圖或二維散點(diǎn)圖表示(分別是柱狀圖或散點(diǎn)圖)。在一維直方圖中，不同的染色體在分布范圍內(nèi)形成不一樣的峰值，每種峰值都代表一種染色體大小的差異；而在二維散點(diǎn)圖中，不同的染色體形成不同的簇。通過染色體DNA含量和堿基對特異性熒光色素檢測到的A-T/G-C含量差異將其分開。然后，通過調(diào)節(jié)分選參數(shù)，流式細(xì)胞儀可以自動(dòng)對不同染色體峰或形成的簇進(jìn)行分類，收集分選出的單一類型染色體。

2 染色體分選樣品的處理

染色體分選技術(shù)包括細(xì)胞同步化處理，染色體懸浮液制備以及利用流式細(xì)胞儀對分選染色體的流式核型分析、分選和收集，最后得到分選出的染色體。

2.1 制備植物染色體的材料選取

植物細(xì)胞周期同步化的材料主要來源于葉肉原生質(zhì)體或根尖分生組織的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有生長迅速、便于處理等優(yōu)點(diǎn)，已在胡蘿卜()、煙草()、小麥()等植物的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中成功進(jìn)行同步化誘導(dǎo)。1984年De Laat等[10]以同步化誘導(dǎo)后的纖細(xì)單冠菊()的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，完成了植物染色體的首次流式核型分析。但是懸浮液培養(yǎng)細(xì)胞存在缺點(diǎn)，即建立一個(gè)懸浮培養(yǎng)體系耗時(shí)多，需要數(shù)月甚至數(shù)年時(shí)間，并且核型的穩(wěn)定性差，不利于遺傳研究與利用。因此研究人員嘗試通過培養(yǎng)植物葉肉原生質(zhì)體來獲得染色體，1987年Conia等[11]以矮牽牛()的葉肉原生質(zhì)體進(jìn)行同步化誘導(dǎo)，但是這種方法富集的中期指數(shù)只有10%。并且由于植物葉肉原生質(zhì)體難獲得，培養(yǎng)體系難構(gòu)建，葉肉原生質(zhì)體方法并沒有得到廣泛的運(yùn)用。1992年Dolezel等[3]成功利用蠶豆()的根尖分生組織制備了高質(zhì)量的染色體懸浮液。Halfmann等的研究表明，生長活躍的植物根尖分生組織中細(xì)胞群體分裂旺盛，并保持恒定的循環(huán)周期，易于進(jìn)行人為同步化調(diào)控處理[12]。由于植物根尖具有來源廣、易處理、可重復(fù)以及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，通過使用植物根尖材料實(shí)現(xiàn)了多種植物的中期染色體富集的研究，如小麥[13]、豌豆()[14]、棉花()[12]和甘蔗()[15]等。

2.2 細(xì)胞周期同步化富集中期染色體

根尖是制備染色體懸浮液，實(shí)現(xiàn)染色體分選的理想材料。然而，未經(jīng)處理的植物根尖材料用于制備染色體懸浮液的效果并不理想。在自然條件下生長的根尖分生組織細(xì)胞中，處于分裂期的細(xì)胞僅占整個(gè)分生區(qū)細(xì)胞的5%~8%[16]，用其制備的染色體懸浮液中包含大量細(xì)胞核以及細(xì)胞雜質(zhì)。在進(jìn)行染色體分選時(shí)，過多的核以及雜質(zhì)會(huì)干擾染色體的識別，導(dǎo)致分選效率低下、誤差大。因此，在進(jìn)行染色體懸浮液的制備前，首先進(jìn)行細(xì)胞周期同步化處理，即通過低溫、DNA合成抑制劑和微管抑制劑等理化措施對根尖分生組織細(xì)胞進(jìn)行處理，使其大部分細(xì)胞處于有絲分裂的中期，從而獲得以中期染色體為主的流式核型[17]。

植物組織中細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)主要有兩種策略：即物理法與化學(xué)法誘導(dǎo)。物理法是根據(jù)細(xì)胞的物理特征將細(xì)胞同步化，常用的有離心淘析法(centrifugal elutriation)，即利用細(xì)胞在不同時(shí)期的大小不相同的特點(diǎn)，通過離心方式對目標(biāo)階段的細(xì)胞進(jìn)行分離與收集，以獲得同步化的群體[18]。雖然這種方法操作簡單，但是需要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備特殊且昂貴，因此應(yīng)用并不廣泛?；瘜W(xué)法則在細(xì)胞的不同階段采用不同類型的化學(xué)抑制劑處理，以達(dá)到對特定細(xì)胞周期的關(guān)鍵響應(yīng)因子進(jìn)行功能抑制，使細(xì)胞分裂過程受阻停滯在某一階段，從而達(dá)到富集某一目標(biāo)時(shí)期的細(xì)胞群體的目的。在去除抑制后，細(xì)胞會(huì)繼續(xù)向下一個(gè)階段前進(jìn)。通常采用不同類型的化學(xué)抑制劑對細(xì)胞生長周期進(jìn)行人為調(diào)控，主要分為兩種，一種是DNA合成抑制劑，通過抑制周期蛋白(cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclins depen- dent kinases, CDKs)的有效表達(dá)，使細(xì)胞暫時(shí)抑制DNA的復(fù)制，停留在G1/S階段，如羥基脲(HU)、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷等均可以抑制DNA的合成，去除DNA合成抑制劑后細(xì)胞可恢復(fù)正常進(jìn)程。第二種是微管抑制劑，通過破壞有絲分裂中微管的形成，消除紡錘體的牽引力從而將細(xì)胞阻斷在中期，達(dá)到富集中期染色體的目的，如甲基胺草磷(amiprophos-methyl, APM)、氟樂靈(trifluralin)以及秋水仙堿(colchicine)等。由于不同植物的生長周期不同，為達(dá)到理想效果，對細(xì)胞的同步化處理也應(yīng)調(diào)整優(yōu)化。而為了提高細(xì)胞周期同步化效率，通常會(huì)將兩種類型的抑制劑組合使用。早在1999年，Dolezel等[13]就通過對HU和APM進(jìn)行組合，對蠶豆根尖進(jìn)行同步化處理，獲得的中期指數(shù)最高可達(dá)70%。在大麥()根尖細(xì)胞周期同步化中，Lee等[16]通過組合使用HU與氟樂靈，獲得的染色體中期指數(shù)高達(dá)76.5%。

2.3 染色體懸浮液的制備

受染色體懸浮液制備質(zhì)量的限制，植物染色體分選研究進(jìn)展緩慢。高等植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁對染色體的分離造成了一定的困難。要獲得完整的染色體，必須先去除細(xì)胞壁的束縛。有兩種方法從植物體細(xì)胞中釋放染色體：一種是酶解法，通過混合酶液(纖維素酶與果膠酶等)的酶解處理，可以去除細(xì)胞壁，但這種方法操作過程繁瑣，而且酶解后產(chǎn)生的大量細(xì)胞碎片不利于直接進(jìn)行流式分析[10]；第二種是機(jī)械破碎法，也是現(xiàn)在主流的制備染色體懸浮液的方法。將同步化處理后的根尖細(xì)胞用甲醛溶液固定，用超高轉(zhuǎn)速破碎細(xì)胞壁使染色體釋放出來，然后用50m孔徑濾膜過濾細(xì)胞碎片。機(jī)械破碎法對染色體損傷小，且懸浮液中細(xì)胞碎片含量減少，可提高分選染色體的純度[3]。進(jìn)一步的研究表明，對經(jīng)機(jī)械破碎后的染色體懸浮液采用蔗糖梯度的方法進(jìn)行純化，可以使染色體懸浮液中的細(xì)胞碎片及雜質(zhì)含量更低，染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)更完整，背景更加清晰[19]。

多種因素都會(huì)影響到制備的染色體懸浮液質(zhì)量。其中，固定液種類和固定時(shí)間對染色體形態(tài)的影響都很大。因而有不少關(guān)于對甲醛固定液濃度和固定時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化的研究，以期獲得高質(zhì)量的染色體懸浮液。如Lee等[20]對大麥根尖細(xì)胞同步化，在獲得76.5%的中期染色體指數(shù)基礎(chǔ)上，采用2%的甲醛固定20 min，機(jī)械勻漿后獲得了高質(zhì)量的細(xì)胞懸浮液；同樣地，對所獲得的70%的中期染色體指數(shù)的玉米根尖用3%的甲醛固定25 min后機(jī)械勻漿,也獲得高質(zhì)量的懸浮液[21]，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。染色體懸浮液的裂解緩沖液的選擇也很重要, 裂解緩沖液影響染色體的形態(tài)穩(wěn)定性，用裂解緩沖液可以使懸浮液中的染色體處于獨(dú)立穩(wěn)定的形態(tài)而不聚集和沉淀，利于分選染色體。常用的裂解液有LB01、MgSO4、WPB、Otto’s等[22]，不同植物適用的裂解液也可能不同。因?yàn)槿旧w懸浮液的質(zhì)量對染色體分選至關(guān)重要，因此在對一種植物進(jìn)行染色體分選前，對甲醛固定液的濃度、固定時(shí)間和裂解緩沖液進(jìn)行優(yōu)化篩選很有必要。

3 染色體分選技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

雙色熒光信號標(biāo)記的應(yīng)用使染色體分選技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展，分子標(biāo)記與目標(biāo)染色體結(jié)合可以幫助研究者實(shí)現(xiàn)分選目標(biāo)染色體的愿望。由于它能夠按照研究人員意愿分離到數(shù)量較多的純度極高的特定染色體而得到廣泛應(yīng)用。所分選的高純度染色體或片段極大地簡化了植物復(fù)雜基因組的分析, 并為物理圖譜構(gòu)建、遺傳學(xué)標(biāo)記開發(fā)以及基因定位等方面的研究提供幫助。而基于染色體技術(shù)進(jìn)行基因組學(xué)的研究分析被稱為染色體基因組學(xué)。流式分選染色體的主要用途隨著細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)方法的發(fā)展而不斷擴(kuò)大。

3.1 構(gòu)建物理圖譜

基于流式細(xì)胞儀的染色體分選技術(shù)可以分選出目標(biāo)的染色體，用來構(gòu)建染色體的BAC文庫[23]。被流式細(xì)胞術(shù)分選出來的染色體本身就包含基因組的部分獨(dú)立的DNA序列，因此研究者可以將分選出的染色體作為模板來定位基因或遺傳標(biāo)記在染色體中的位置，從而構(gòu)建分選染色體的物理圖譜和遺傳圖譜。通過這種方法研究者已將球蛋白基因繪制到豌豆的基因圖譜上[24]。之前，由于等位基因的缺失變異，這些基因難以繪制到基因圖譜中。利用分選出的在蠶豆和豌豆中相互易位的染色體, Macas[24]和Neumann[25]將大量DNA序列定位到它們的亞染色體區(qū)域。Simkova[26]用分選出的面包小麥的7D染色體分別構(gòu)建了7DL和7DS染色體的BAC文庫。對于7DS文庫，利用俄羅斯小麥蚜蟲抗性基因DnCI2401相關(guān)的標(biāo)記物篩選，獲得包含抗性基因DnCI2401的克隆片段；而7DL文庫采用與綠盲蝽抗性基因相關(guān)的探針雜交篩選，獲得包含的克隆片段。由于分選得到的面包小麥7D染色體的克隆相對于基因組的克隆數(shù)目少，所以篩選效率高，成本低。Zatloukalová等[27]對流式細(xì)胞術(shù)分選出的鷹嘴豆()染色體進(jìn)行染色體核型研究，最終將物理圖譜與遺傳圖譜整合，并開發(fā)出一套有效的細(xì)胞遺傳標(biāo)記物，其中2個(gè)分子標(biāo)記可以鑒別染色體E和H。Roberto等[28]利用染色體形態(tài)差異并結(jié)合5s與45s在染色體中的定位對蘆筍進(jìn)行染色體分選，發(fā)現(xiàn)有4種染色體(IV、V、VI和VIII)可以被區(qū)分和分選；然后，利用72個(gè)SSR標(biāo)記對流式核型上單個(gè)峰的染色體含量進(jìn)行了鑒定，其中27個(gè)被納入遺傳連鎖圖譜，并將遺傳連鎖群聯(lián)系到染色體上，同時(shí)發(fā)現(xiàn)性別決定位點(diǎn)位于LG5上，其與V峰相關(guān)，V峰代表了一個(gè)帶有5S rDNA位點(diǎn)的染色體。

3.2 DNA標(biāo)記的開發(fā)

通過分選出單個(gè)染色體可以降低模板的復(fù)雜性，有利于遺傳標(biāo)記的開發(fā)。標(biāo)記是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位、組裝物理圖譜以及圖位克隆的重要資源。在植物遺傳學(xué)中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記是SSRs、DArTs (多樣性微陣列技術(shù))、ISBPs (基于插入位點(diǎn)的多態(tài)性)和SNPs (單核苷酸多態(tài)性)。通過分選染色體構(gòu)建染色體的特異文庫，開發(fā)DNA分子標(biāo)記是一種有效的途徑。DNA標(biāo)記既可從短插入染色體特異文庫中獲得[29]，也可以從長插入染色體特異文庫中獲得[30]。DArTs標(biāo)記的開發(fā)不需要構(gòu)建染色體特異文庫，可直接從分選染色體純化后的DNA中開發(fā)得到。Wenzl等[31]從分選的小麥3B染色體和1B染色體短臂分別獲得了510和59個(gè)DArTs標(biāo)記，而該方法的效率明顯大幅提高，只篩選了2 688個(gè)小麥3B染色體的克隆就獲得了510個(gè)標(biāo)記，然而篩選整個(gè)基因組大約70 000個(gè)克隆才獲得了269個(gè)標(biāo)記。利用染色體分選技術(shù)與測序技術(shù)結(jié)合可以開發(fā)大量的染色體特異性標(biāo)記，Shatalina等[32]利用分選出的2個(gè)六倍體冬小麥Arina和Forno的3B染色體測序開發(fā)出70多個(gè)SNPs標(biāo)記。

3.3 基因組測序

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多植物的基因組序列及組成被人們破解，為基因組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。然而對于一些基因組信息龐大、富含高度冗余序列的多倍體植物來說仍然存在測序和組裝困難以及測序成本高的問題。但是染色體分選技術(shù)的出現(xiàn)使得研究人員可以將植物體復(fù)雜的基因組拆分為染色體組，通過分選單條染色體或染色體臂進(jìn)行深入研究，解決了多倍體植物測序和組裝困難的問題。國際小麥基因組測序聯(lián)盟為了測定小麥的全基因組序列，提出了染色體逐條測序的方法，利用流式分選技術(shù)對中國春小麥的21條染色體進(jìn)行分離，并構(gòu)建了相應(yīng)的BAC文庫為基因組測序提供幫助。Jin等[33]利用流式細(xì)胞術(shù)對簇毛麥染色體4VS進(jìn)行了分選，并利用Illumina平臺進(jìn)行測序獲得大約170.6 Mb的組裝序列；該序列為小麥黃花葉病毒抗性基因Wss1的定位和圖位克隆提供了有價(jià)值的信息。Akpinar等[34]報(bào)道了利用流式分選染色體技術(shù)分選出野生二粒小麥的5B染色體，然后進(jìn)行測序，通過研究蛋白編碼基因、重復(fù)元件和假定的microRNA和tRNA編碼序列，揭示其基因組的結(jié)構(gòu)、組織和功能，助力小麥的遺傳改良。Miao等[35]對六倍體小麥‘CRNIL1A’的3B染色體進(jìn)行分選并測序，報(bào)道中國春小麥3B染色體上缺失的CRNIL1A序列約為8.3 Mb，與中國春小麥基因組序列進(jìn)行比對，大約有159.3 Mb的序列不存在于‘中國春’的基因組中。把來自不同地理起源的226份普通小麥的序列與‘CRNIL1A’特異序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明部分序列只存在于特定區(qū)域的小麥基因型中, 表明具有這些序列的品種分布存在地域差異性，可能與小麥的適應(yīng)性選擇有一定關(guān)系。

現(xiàn)代甘蔗栽培品種主要由熱帶種和細(xì)莖野生種雜交而來,為異源多倍體，染色體倍性變化大(可多達(dá)16倍以上)，基因組組成復(fù)雜[36]；目前對甘蔗栽培種基因組的研究較少，2018年Garsmeur等[37]用PacBio RS II測序平臺對甘蔗R570構(gòu)建的BAC文庫進(jìn)行一一測序，由此構(gòu)建了只有基因富集區(qū)域序列的1個(gè)僅為370 Mb的簡單甘蔗基因組。2018年Zhang等[38]完成了對單倍體細(xì)莖野生種AP85-441 (4=32)的全基因組測序，但更高倍性的原種和甘蔗雜交品種等染色體水平基因組序列尚難以完成。染色體分選技術(shù)可為甘蔗基因組研究提供一種有效手段，通過對甘蔗栽培種染色體逐條分選完成全基因組的測序,為甘蔗栽培種遺傳和物理圖譜的構(gòu)建，遺傳育種的分子標(biāo)記開發(fā)提供基礎(chǔ)。目前，有研究首次報(bào)道了利用流式細(xì)胞技術(shù)制備甘蔗完整染色體懸浮液的方法[39]；并且通過對甘蔗的2熱帶種和3個(gè)雜交種材料進(jìn)行流式核型分析，發(fā)現(xiàn)甘蔗熱帶種的峰圖比雜交種峰圖更突出，且具有更多分離的峰。研究結(jié)果表明這種差異可能與雜交種具有雙基因組結(jié)構(gòu)有關(guān)。這種通過流式細(xì)胞術(shù)分選甘蔗染色體的方法將使我們能夠分離和分析目標(biāo)染色體并對其進(jìn)行測序，從而進(jìn)一步研究甘蔗基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化。我們相信染色體分選作為一種不斷完善的技術(shù)在植物基因組學(xué)研究中將有更加廣闊的應(yīng)用前景。

4 展望

4.1 染色體分選技術(shù)的開發(fā)與利用

染色體分選技術(shù)在高等植物中主要是通過利用染色體之間的較大差異來分選染色體，即通過單色熒光直接標(biāo)記染色體，根據(jù)熒光信號強(qiáng)度，對染色體形態(tài)差異明顯的峰值圖或聚集成簇的散點(diǎn)圖進(jìn)行分選[40]。這種方法只能分選1條或幾條形態(tài)差異大的染色體，并不能按照研究人員的意圖分選染色體，并且分選出來的染色體會(huì)含有少量非目標(biāo)染色體，影響研究結(jié)果。

隨著染色體分選技術(shù)的發(fā)展，通過開發(fā)特異的分子標(biāo)記結(jié)合懸浮液熒光原位雜交技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)按照人們意圖選擇想要分選的染色體[41]；這種雙色熒光采用兩種核酸染料分別對整條染色體和雜交探針位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，通過兩種不同熒光信號強(qiáng)度可以分選出任意帶有分子標(biāo)記的染色體，且這種方法分選出來的染色體純度更高。然而，有效分子標(biāo)記探針的缺乏阻礙了其進(jìn)一步發(fā)展，目前常用的標(biāo)記探針只有45S和5S[28]，因此開發(fā)更多新的染色體特異的分子標(biāo)記是提高染色體分選效率的關(guān)鍵。

染色體分選技術(shù)雖然可以一次性收集幾萬到幾十萬條單一類型的染色體，但所含的DNA含量還是太少了，還達(dá)不到三代測序所需的5~10g的數(shù)值含量，Capal等提供了一種可將分選出的染色體DNA經(jīng)純化后擴(kuò)增的方案，該方案拓展了染色體基因組學(xué)的潛力，并為染色體結(jié)構(gòu)雜合性和植物單倍型定相研究開辟了新的途徑[42]，但該方案仍存在擴(kuò)增后的組裝序列片段小的問題。

4.2 染色體分選技術(shù)在基因組學(xué)研究中的作用

基因組測序技術(shù)的應(yīng)用為評估植物基因組組成提供幫助，并有助于將基因組學(xué)方法引入到植物改良項(xiàng)目中?；蚪M測序技術(shù)在小基因組物種和有參考基因組序列的植物中應(yīng)用較為簡單。然而，對于一些沒有參考序列，基因組龐大、復(fù)雜的物種, 整個(gè)基因組的測序數(shù)據(jù)很難處理和使用。例如，普通小麥包含3個(gè)基因組(AA、BB、DD)，基因組序列數(shù)據(jù)約為17 GB, 其中重復(fù)序列高達(dá)85%[43]。對于這樣復(fù)雜基因組物種來說，全基因組測序是難以完成的。因此，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分選單條染色體或染色體臂為降低基因組的復(fù)雜性提供了一種有吸引力的方法。自然界中有很多植物和小麥一樣擁有復(fù)雜的基因組，對他們進(jìn)行基因組學(xué)研究還存在困難，而染色體分選是通過分選出單條染色體逐條完成基因組測序，簡化了測序和組裝的過程。將染色體分選技術(shù)應(yīng)用于同樣復(fù)雜的甘蔗基因組研究中也是一種可行的方案，可為甘蔗基因組測序和組裝提供新的技術(shù)支持。我們相信，隨著染色體懸浮液制備方法的優(yōu)化，流式細(xì)胞術(shù)多參數(shù)分析和分選技術(shù)的開發(fā)，染色體分選技術(shù)在高等植物中的應(yīng)用越來越廣，為高等植物的復(fù)雜基因組研究提供了另一種視野。

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Applications of Chromosome Sorted in Botany Research

QIAN Wang1, WANG Qiu-song1, YANG Shan1,2, XU Liang-nian1,3,4*, DENG Zu-hu1,2,4*

(1. National Engineering Research Center of Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002, China; 2. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources,Nanning 530004, China; 3. Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology,Nanning 530004, China; 4. Key Lab of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Fuzhou 350002, China)

The basic principle of chromosome sorting technology and the basic process of sample treatment were introduced. The chromosome suspension was prepared by synchronizing the apical meristem. And then the target chromosomes with high purity and high quantity were obtained by flow cytometry. The main applications of chromosome sorting technology in plants were reviewed, including the construction of physical maps, the development of DNA molecular markers, and genome sequence of the complex polyploid plant. With the continuous improvement and development of chromosome sorting technology, the development of probe markers for chromosome sorting and the optimization of chromosome DNA purification and amplification technology after sorted, it will provide more effective help for the genomics research of polyploid plants such as sugarcane.

Chromosome sorted; Flow cytometry; Genome; Polyploid plant

10.11926/jtsb.4262

2020–06–08

2020–08–02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31771863); 中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(CARS-170106); 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKLCUSA-a201912, SKLCUSA-b201806); 福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金(KFA17168A, KFA17525A, KFA17169A, 2018N1002)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771863), the Special Project for Modern Agriculture Technology of China (Grant No. CARS-170106), the Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources (Grant No. SKLCUSA-a201912, SKLCUSA-b201806), and the Special Project for Science and Technology Innovation of Fujian Agriculture and Forestry University (Grant No. KFA17168A, KFA17525A, KFA17169A, 2018N1002).

錢旺(1995~ )，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail: 719482561@qq.com

E-mail: dengzuhu@163.com; xuliangnian@163.com