基于無標記金納米簇的新型熒光生物傳感器在赭曲霉毒素A快速檢測中的應用

孔德莉，羅 思，彭瑞晨，劉嘉睿，文 茜

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，能夠污染許多食物，包括肉類、啤酒、谷物類等食物[1-2]。赭曲霉毒素是曲霉菌屬和青霉菌屬產生的次級代謝產物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是對人類的生活生產危害最大的真菌毒素之一[3-4]。目前，關于毒素的傳統(tǒng)檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄層色譜（thinlayer chromatograghy，TLC）法和氣相色譜（gas chromatography，GC）法等[5-7]。此類方法雖然都有較高的穩(wěn)定性和靈敏度[8]，但都需要昂貴的儀器，繁瑣的處理步驟（包括萃取、清洗和濃縮等），因而限制了它們的普及和應用[9-10]。近年來，基于適配體（aptamer，Apt）與靶標特異性結合進而構建的復合生物傳感器被廣泛地應用于食品、生物小分子和腫瘤標記物的檢測等相關領域[11-13]。而基于霉菌毒素Apt的生物傳感器主要有熒光傳感器、比色傳感器、化學發(fā)光傳感器、電化學傳感器等幾種[9,14-16]。其中熒光檢測方法是目前最常見也是最普及的檢測方法之一[17]，由于其操作簡單、微型化且不受外界環(huán)境干擾而為食品中風險因子的現場檢測提供了有效途徑[18]。

金納米簇（gold nanocluster，AuNCs）具有獨特的尺寸依賴性光物理性質，較強的抗光漂白性，良好的生物相容性，是一種新型熒光探針[19-21]；金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）由于其特殊的結構及優(yōu)良的光電效應，已成為一種優(yōu)良的比色指示劑和高效的熒光猝滅劑；而核酸Apt又較之抗體具有更好的親和力和特異性，且具有成本低，易于合成和修飾，穩(wěn)定性強等特點[22-24]，三者都在腫瘤標志物、酶、重金屬離子和霉菌毒素等生物分析檢測中有著廣泛的應用[12,25]。Wang Mengke等[26]報道了AuNCs@AuNPs Apt傳感器開發(fā)的熒光分析法已被報道用于胰蛋白酶的檢測。然而，將DNA為模板的AuNCs與以DNA修飾的AuNPs相結合構建核酸Apt生物傳感器用以檢測食品生產、加工和儲存運輸中有害因子的研究還未得到廣泛的探索。

Wen Qian等[19]開發(fā)了一種以肽定向快速（約20 min）合成AuNCs的方法，該方法是使用了輔助配體3-巰基丙酸（mercaptopropionic acid，MPA）和強還原劑NaBH4。本實驗在Wen Qian等[19]研究基礎上，以DNA Apt為模板，采用與肽模板化相同的方法直接快速合成AuNCs，以OTA的DNA Apt為模板，在5’端添加C12序列（CCC CCC CCC CCC），設計了一條包含Apt序列（OTA）的DNA鏈作為AuNCs定向快速（20 min）合成的模板，得到了OTA Apt功能化的AuNCs（OTA-AuNCs）。以無標記快速合成的核酸Apt模板AuNCs與其核酸Apt部分互補的單鏈cDNA修飾AuNPs之間構建的一種新型熒光復合納米生物傳感器用于快速檢測靶標毒素——OTA。以AuNCs這種新型納米材料作為研究介質，一方面利用AuNCs自身所特有的熒光性質，以OTA的底物核酸Apt作為識別分子，合成的無標記以核酸Apt為模板的AuNCs；另一方面，引入與此核酸Apt部分互補的cDNA標記修飾的AuNPs，利用AuNPs所具有的熒光猝滅性質，當Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感器形成時，Apt-AuNCs（能量供體）的熒光會被cDNA-AuNPs（能量受體）所猝滅；如此時加入OTA，由于Apt與靶標之間具有更強的親和力，Apt-AuNCs會優(yōu)先與毒素靶標相結合，而從Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感器中分離出來，使得整個體系的熒光強度得到恢復，由此，可根據AuNCs的熒光恢復強度定性及定量的檢測靶標毒素（OTA）。此外，該新型熒光復合生物傳感器還可以改變不同的靶標（如OTA、黃曲霉毒素B1、T-2毒素、伏馬毒素等）的底物核酸Apt進而快速合成不同模板的功能性AuNCs，準確識別各靶標毒素，達到定性及定量分析檢測多種靶標毒素的目的。該方法合成快速簡便、操作簡單、靈敏度高、選擇性強、穩(wěn)定性好且具有較低的檢測限，預期在食品安全檢測方面具有良好的應用前景，也為復雜生物領域中與食品相關各領域中的有害因子檢測提供一種新的思路和平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（純度99.95%）、MPA（純度99.0%）美國Sigma公司；檸檬酸三鈉、硼氫化鈉、氯化鈉、檸檬酸、Tris、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；OTA、T-2毒素、黃曲霉毒素B1鄭州分子科貿有限公司；實驗中所有試劑均為分析純。Apt(OTA)：CCCCCCCCCCC CGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGA CA；cDNA：TGTCCGATGCTCCCTTTACGCCACCCAC ACCCGATC-(C)3-SH。

1.2 儀器與設備

F-4600熒光可見分光光度計 日本日立公司；UV-vis紫外-可見分光光度計 日本島津公司；JEM-2100透射電子顯微鏡 日本電子公司；納米粒度和電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板AuNCs的合成

200 μL DNA溶液（5 μmol/L）以及1.0 mL氯金酸溶液（2.5 mmol/L）混合，所得溶液于磁力攪拌下加入150 μL MPA溶液（30 μmol/L），同時加入1 mol/L氫氧化鈉溶液（約10 μL）將混合物的pH值調整至5以下。將混合物持續(xù)攪拌10 min，加入150 μL冰水浴中新鮮制備的硼氫化鈉（1 mmol/L），再持續(xù)攪拌10 min，即得到DNAAuNCs[19]。反應完成后，將所得AuNCs用超純水洗滌，除去過量的MPA和DNA，并將該AuNCs溶液于室溫下避光保存待用。

1.3.2 AuNPs的合成

AuNPs（13 nm）根據文獻報道的檸檬酸鈉還原法合成[27]：在三頸燒瓶中加入99 mL超純水和1 mL氯金酸溶液（25 mmol/L），磁力攪拌下加熱回流，反應液充分沸騰時，快速加入5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液。待溶液變?yōu)樯罹萍t色，即得到AuNPs原液，冷卻至室溫后至4 ℃冰箱避光保存。

1.3.3 cDNA標記AuNPs

根據Zhang Xu等[28]報道的快速穩(wěn)定巰基DNA修飾AuNPs進行，并通過紫外表征。10 μL（不同濃度的c-DNA）添加到200 μL的金納米溶液，然后旋渦混合器混勻，此時加入8 μL檸檬酸-HCl緩沖溶液（pH 3.0）（500 mmol/L）放置于室溫，孵育5 min，然后加入182 μL超純水，即得到cDNA-AuNPs溶液。

1.3.4 OTA的檢測

100 μL 3 nmol/L的cDNA標記金納米溶液，2.5 μmol/L核酸Apt修飾的AuNCs溶液混勻，之后將100 μL一系列不同濃度的赭曲霉毒素（包含10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，pH 7.4），添加到上述溶液中，37 ℃孵育60 min后，最終的混合物即用F-4600熒光光譜儀進行熒光掃描（激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長580 nm）。將反應體系中無靶標毒素OTA的熒光強度記為F；將反應體系中有OTA的熒光強度記為F’；熒光恢復強度為ΔF。

1.3.5 傳感器特異選擇性檢測

選擇常見食品生產、加工和儲存運輸過程中常見的毒素，如：黃曲霉毒素B1、OTA、T-2毒素等及其混合物作為干擾物質代表（1 ng/mL，75%甲醇溶液溶解），以對應波長580 nm處熒光強度為指標，評估該OTA核酸Apt模板合成的AuNCs和cDNA標記AuNPs構建熒光復合納米生物傳感器檢測靶標毒素OTA的特異選擇性。

1.3.6 玉米樣品加標檢測

實際玉米面粉樣品的前處理方法參照國標HPLC法[29]。首先在125 mL體積分數70%甲醇溶液中加入25 g玉米面粉和5 g氯化鈉粉末，超聲混勻30 min。將定性濾紙過濾過的該混合溶液收集于干凈的100 mL具塞量筒中備用，此濾液記為提取液A。準確移取15 mL提取液A與30 mL蒸餾水混勻，以微纖維濾紙過濾，此濾液記為提取液B，再在提取液B中加入不同濃度的OTA標準品，劇烈振蕩10 min。之后，將該混合溶液于4 000 r/min低溫高速離心機中勻速離心10 min，留取上清液于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測時，在復合熒光納米傳感器中加入收集到的上清液，記錄在580 nm波長處熒光強度，重復測定3 次，考察該方法的加標回收率，并通過結果評價該構建的生物傳感器檢測玉米樣品中OTA的準確度和實際樣品的可行性。

1.4 數據處理

每組數據均重復3 次，利用Origin 2018軟件處理數據作圖。

2 結果與分析

2.1 實驗設計與工作原理

基于無標記AuNCs的新型熒光生物傳感器的檢測原理如圖1所示：以靶標毒素（OTA）的底物核酸Apt作為識別分子，快速合成無標記核酸Apt的AuNCs，同時引入了與其底物核酸Apt鏈部分互補的cDNA標記修飾的AuNPs，形成Apt(OTA)-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感器。利用AuNPs的熒光猝滅性質，當無靶標毒素（OTA）存在時，Apt-AuNCs和cDNA-AuNPs雜交互補形成穩(wěn)定的結構，Apt-AuNCs（能量供體）的熒光就會被cDNA-AuNPs（能量受體）所猝滅；當靶標毒素（OTA）存在時，由于Apt與靶標之間具有更強的親和力，Apt-AuNCs會優(yōu)先和毒素靶標結合而分離出來，此時整個Apt(OTA)-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感體系的熒光強度將得到恢復。通過測定相對熒光強度，可準確定性及定量檢測靶標毒素OTA。

圖2 納米材料表征圖Fig.2 Characterization of nanomaterials

如圖2A所示，以OTA底物核酸Apt鏈為模板合成的AuNCs分散性良好，粒徑均勻（平均粒徑約2 nm），高分辨透射電鏡圖像表明，其晶格條紋（～2.3）與晶面的原子立方晶面間距（111）一致。由圖2B所示，Apt(OTA)-AuNCs的最大發(fā)射波長為580 nm，激發(fā)波長為350 nm。為進一步確定合成AuNCs的熒光現象，采用激發(fā)375 nm的紫外燈進行照射表征。由圖2B插圖可見，可觀察到合成的核酸Apt為模板的AuNCs具有紅色熒光，可確定AuNCs合成成功。如圖2C所示，合成的AuNPs在520 nm波長處有最大紫外吸收峰值。如圖2D所示，合成的AuNPs是酒紅色，均勻分散無團聚，平均粒徑約13 nm。

2.1.1 cDNA標記AuNPs的表征

圖3 cDNA標記AuNPs的表征Fig.3 Characterization of cDNA-labeled AuNPs

設計cDNA的3’端具有巰基，通過Au-S鍵與AuNPs結合形成cDNA-AuNPs偶聯物。與裸AuNPs相比，cDNA-AuNPs的吸收光譜出現了新的細微的吸收峰，如圖3A所示，其波長為260 nm，由此驗證cDNA與金納米表面的結合成功。Zeta電位測定結果也進一步證明了cDNA與AuNPs的結合，如圖3B所示，裸AuNPs的Zeta電位值約為-36.87 mV，而cDNA標記AuNPs后的Zeta電位值轉變約為-24.7 mV，進一步證明了cDNA成功標記在AuNPs的表面。

2.1.2 cDNA-AuNPs和Apt-AuNCs的熒光共振能量轉移表征

圖4 AuNPs的紫外吸收光譜圖的表征和AuNCs的熒光光譜表征Fig.4 UV-vis absorption spectra of AuNPs and fluorescence emission spectra of Apt(OTA)-AuNCs

由圖4可知，cDNA-AuNPs的吸收光譜與Apt-AuNCs的發(fā)射光譜有很好的重疊，說明Apt-AuNCs（能量供體）與cDNA-AuNPs（能量受體）之間可能發(fā)生熒光共振能量轉移，由于兩條鏈（核酸Apt與核酸Apt部分互補的cDNA）在一定的條件下可以發(fā)生部分雜交互補，Apt-AuNCs與cDNA-AuNPs之間的距離縮短，形成Apt-AuNCs@cDNAAuNPs復合物，從而形成了熒光共振能量轉移平臺平臺，達到了熒光共振能量轉移平臺距離的要求。

2.1.3 生物傳感器檢測靶標毒素（OTA）的可行性驗證

本研究中基于OTA底物核酸Apt模板快速合成的AuNCs，如圖5曲線a所示，在580 nm波長處具有最大的熒光發(fā)射峰值。當靶標毒素（OTA）單獨與該AuNCs同時存在時，混合溶液的熒光強度與AuNCs本身的熒光強度并區(qū)別不大，說明靶標毒素（OTA）本身對AuNCs的熒光不會產生影響（圖5曲線b）。在cDNA-AuNPs存在下，AuNCs上的底物核酸Apt與AuNPs上標記的cDNA互補結合雜交形成dsDNA，此時Apt-AuNCs與cDNA-AuNPs之間形成了熒光共振能量轉移體系，AuNCs的熒光被猝滅（圖5曲線d）。然而，若此時在Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感體系中加入靶標毒素（OTA），則如圖5曲線c所示，核酸Apt與靶標OTA之間更強的親和力致使Apt-AuNCs會優(yōu)先與靶標相結合而遠離cDNA-AuNPs，從而使得整個體系的熒光強度恢復。

圖5 復合生物傳感器可行性的熒光光譜表征Fig.5 Fluorescence spectral characterization of biosensor feasibility

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 修飾AuNPs的巰基DNA濃度優(yōu)化

AuNPs上修飾巰基DNA是本研究中重要的步驟。如圖6所示，不同濃度的cDNA加入到AuNPs溶液中（pH 3），通過紫外光譜檢測得知：當cDNA濃度為1 μmol/L時，其修飾AuNPs溶液較為穩(wěn)定，因此本研究最終選擇cDNA的濃度為1 μmol/L。

圖6 不同濃度的cDNA標記AuNPs的紫外表征Fig.6 UV-vis absorption spectra of AuNPs labeled with different concentration of cDNA

2.2.2 cDNA-AuNPs的濃度優(yōu)化

引 入c D N A 標 記A u N P s 后，A p t-A u N C s 與cDNA-AuNPs之間發(fā)生熒光共振能量轉移，如圖7所示，固定Apt-AuNCs濃度，隨著cDNA-AuNPs濃度的增加（濃度范圍為0～3.5 nmol/L），Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感體系的熒光強度迅速下降，當cDNA-AuNPs濃度為3 nmol/L時，此體系熒光強度猝滅效果最好。

由于cDNA-AuNPs濃度是反應體系中一個重要的因素，因此還進一步設計了實驗方案用以確認最優(yōu)濃度。設定cDNA-AuNPs濃度范圍為0～3.5 nmol/L，每個選取濃度重復測定3 次。每個固定濃度的c D N AAuNPs，分別在有、無OTA存在時（OTA質量濃度為0.5 ng/mL）進行實驗，此Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合納米傳感體系的熒光恢復強度，如圖8所示，隨著cDNA-AuNPs濃度的升高，體系熒光強度是逐漸恢復上升的。當濃度為3 nmol/L時，熒光恢復強度達到最大，當濃度上升到3.5 nmol/L時，熒光強度又下降。綜上所述，本研究中確定cDNA-AuNPs的最優(yōu)濃度為3 nmol/L，此時Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs傳感器的熒光靶標恢復性能最好。

圖7 不同濃度cDNA-AuNPs猝滅AuNCs的熒光圖譜Fig.7 Fluorescence spectra of Apt(OTA)-AuNCs/cDNA-AuNPs systems with different concentrations of cDNA-AuNPs

圖8 cDNA-AuNPs濃度的優(yōu)化Fig.8 Optimization of cDNA-AuNPs concentration

2.2.3 Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs與靶標毒素（OTA）的孵育時間優(yōu)化

靶標毒素（OTA）的孵育時間可能會對實驗中熒光強度的恢復程度有一定影響，為了探究實驗結果，固定Apt-AuNCs和cDNA-AuNPs的濃度，設定不同的孵育時間，使得反應體系OTA質量濃度為0.5 ng/mL，以此探究該因素對熒光恢復強度的影響。如圖9所示，隨著孵育時間的延長，熒光強度恢復程度逐漸上升，當孵育時間為60 min時，熒光恢復強度達到最大，而當孵育時間為70 min時，熒光強度又開始下降。由此可知孵育時間為60 min時，AuNCs上的核酸Apt與靶標毒素（OTA）結合最充分，此時多數AuNCs上的核酸Apt不與互補cDNA鏈發(fā)生雜交，體系熒光恢復強度最好。

圖9 孵育時間的優(yōu)化Fig.9 Optimization of incubating time

2.3 Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs對靶標毒素（OTA）的熒光檢測結果

圖10 不同濃度OTA對應的熒光光譜圖（A）及OTA濃度與580 nm波長處的熒光強度線性關系（B）Fig.10 Fluorescence spectra of the assay at various concentrations of OTA (A) and linear relationship between fluorescence intensity and OTA concentration (B)

本研究基于生物傳感器熒光共振能量轉移原理，以靶標毒素（OTA）的底物核酸Apt為模板合成AuNCs作為能量供體，cDNA標記AuNPs作為能量受體，在無靶標毒素（OTA）存在時，熒光共振能量轉移發(fā)生，體系熒光強度降低；隨著質量濃度的逐漸增加，該構建的復合生物納米傳感體系在580 nm處對應的熒光強度逐漸升高，進而可準確定性和定量檢測靶標毒素（OTA）。在上述最佳實驗條件下，將一系列不同質量濃度的OTA標準品加入到含有一定濃度的核酸Apt修飾的AuNCs與cDNA標記AuNPs的混合緩沖溶液中（10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，pH 7.4）孵育反應，測定OTA的標準曲線，如圖10所示，該方法在靶標毒素（OTA）0.01～2.5 ng/mL范圍內與熒光強度對應峰值（FI）呈良好的線性關系，回歸方程為FI=689.84lgC（OTA）+8 315.31，R2=0.988 4，檢出限為0.025 ng/mL。這個結果遠低于國標中谷物類OTA限量標準的0.5 ng/mL。根據本研究中所構建的復合熒光生物傳感器所得到的檢測下限，該熒光生物傳感器具有良好的靈敏度和相對較低的檢出限（檢出限為0.025 ng/mL）。

2.4 Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復核生物傳感器的特異選擇性

為了評估該構建的復合熒光生物傳感器對靶標毒素（OTA）的特異選擇性。選擇3 種食品檢測中常見的毒素：OTA、黃曲霉毒素B1、T-2毒素，將它們分別加入或混合后加入檢測體系中，監(jiān)測系統(tǒng)熒光強度的變化情況。使體系中毒素的終質量濃度為1 ng/mL，同時以Tris-HCl緩沖溶液代替毒素作為空白對照，結果如圖11所示：空白對照的熒光強度很低，這時體系中無靶標存在，Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs發(fā)生強烈的熒光共振能量轉移，熒光強度降低；黃曲霉毒素B1、T-2毒素時產生的熒光強度峰值與空白對照相似，說明以OTA的底物核酸Apt模板合成的AuNCs@cDNAAuNPs傳感器對這2 種毒素并無響應；而只有當靶標毒素（OTA）存在時，才產生了非常顯著的熒光特異性響應。由此表明，該核酸Apt生物傳感器對靶標毒素（OTA）具有良好的特異選擇性。

圖11 核酸Apt傳感器對OTA的特異選擇性驗證Fig.11 Selectivity of the assay toward OTA (1 ng/mL) and against other toxins

2.5 Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合生物傳感器的實際樣品檢測結果

在玉米提取液中，添加4 個不同質量濃度的OTA標準溶液，使得體系中的O T A 終質量濃度分別為0.25、0.5、0.75 ng/mL和1 ng/mL。采用構建好的復合熒光生物傳感器檢測玉米面中OTA的含量，進而確定復合熒光生物傳感器對玉米面提取液中不同質量濃度OTA的加標回收率和精密度，每組實驗重復測定3 次，按照標準曲線計算得到相應的含量，如表1所示。結果表明，該復合熒光生物傳感器檢測得到的回收率在88%～113%范圍內，相對標準偏差在8.06%～11.05%之間，符合檢測體系標準（12%）以下，說明該構建的復合熒光生物傳感器具有良好的加標回收率和精密度。

表1 實際樣品中不同質量濃度OTA的回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of aptasensor for real samples spiked with different concentrations of OTA

3 結 論

本研究旨在構建快速檢測OTA的復合熒光Apt生物納米傳感器。研究中發(fā)現，所制備的Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs復合熒光生物傳感器，當無靶標毒素存在時，cDNA標記AuNPs可以猝滅以核酸Apt為模板修飾AuNCs的熒光，發(fā)生熒光共振能量轉移現象，導致系統(tǒng)熒光強度降低；而一旦加入靶標毒素，Apt-AuNCs上的底物核酸序列傾向于與結合力更強的靶標毒素結合而從Apt-AuNCs@cDNA-AuNPs的復合體中分離出來，致使體系的熒光強度得到恢復。利用該原理，本實驗設計了以靶標毒素（OTA）的底物核酸Apt序列為模板，快速合成制備了發(fā)射波長為580 nm的AuNCs，以靶標毒素（OTA）的底物核酸Apt序列的互補鏈修飾的AuNPs作為熒光猝滅劑，2 種納米材料相結合形成Apt(OTA)-AuNCs@cDNA-AuNPs復合熒光生物傳感器，用以實現了對靶標毒素（OTA）的準確定性及定量檢測。在實際樣品的檢測過程中，該復合熒光生物傳感器針對OTA的殘留和加標檢測，均展現出了良好的精密度、準確性和特異性。本研究還可利用改變靶標物對應的底物核酸Apt序列，合成對應的Apt模板AuNCs，以此可廣泛應用于食品生產、儲存、運輸等各領域其他霉菌毒素及有害因子的檢測，也可以用于農作物的重金屬殘留、生物醫(yī)學中蛋白小分子的檢測，具有一定的通用性?？傊搹秃蠠晒馍飩鞲衅鞯臉嫿ㄓ型麨槭称分忻咕?、毒素等有害因子的檢測提供一種新型的研究思路，可以實現靶標物的現場快速檢測，提高檢測效率，這對食品安全質量檢測控制以及保證人類生命健康有著潛在的應用價值和社會意義。