超高效液相色譜-紫外檢測法測定嬰幼兒配方乳粉中的核苷酸含量

王象欣，單 藝，魏雪冬，李文斌，鄂來明，姜毓君

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，黑龍江 哈爾濱 150028；4.天津迪科馬實驗設(shè)備有限公司，天津 300402）

核苷酸是由含氮的堿基、戊糖、磷酸3 種分子連接而成，人乳中游離核苷酸的含量范圍在5～8 mg/100 mL[1]，目前核苷酸已被確定為條件型必需營養(yǎng)素。核苷酸對降低感染性腹瀉、改善腸道微生物菌群、調(diào)節(jié)免疫功能和脂質(zhì)代謝有積極作用[2-3]。與未添加核苷酸的嬰幼兒配方奶粉比較，添加核苷酸的嬰幼兒配方乳粉被認(rèn)為對健康嬰幼兒胃腸道的生長和成熟有益。嬰幼兒食用添加核苷酸的嬰幼兒配方乳粉，其腸道中普雷沃菌屬與雙歧桿菌定植比例接近母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒水平，明顯低于食用未添加核苷酸的嬰幼兒配方乳粉的嬰幼兒[4-5]。GB 14880ü 2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[6]中規(guī)定了嬰幼兒配方乳粉中允許添加的核苷酸種類有5’-胞嘧啶核苷酸（cytidine 5’-monophosphate，CMP）、5’-尿嘧啶核苷酸（uridine 5’-monophosphate，UMP）、5’-腺嘌呤核苷酸（adenosine 5’-monophosphate，AMP）、5’-次黃嘌呤核苷酸（inosine 5’-monophosphate，IMP）、5’-鳥嘌呤核苷酸（guanosine 5’-monophosphate，GMP），允許添加的使用量為12～58 mg/100 g（以核苷酸總量計）。歐盟關(guān)于嬰幼兒配方乳粉的法規(guī)Commission Directive 2006/141/EC規(guī)定了嬰兒和較大嬰兒及幼兒配方食品中添加核苷酸的上限為5 mg/100 kcal（約23.9 mg/100 g），并對5 種成分的添加量進(jìn)行了限定。

目前，嬰幼兒配方乳粉中核苷酸的檢測官方方法主要有GB 5413.40ü 2016《嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》[7]，其他文獻(xiàn)報道的研究方法主要有反相液相色譜聯(lián)合紫外檢測器[8-9]或質(zhì)譜檢測器[10]，前處理使用沉淀蛋白結(jié)合不同的固相萃取方式。經(jīng)驗證，離子對試劑結(jié)合C18極性色譜柱分離，使核苷酸對流動相pH值敏感，會引起雜質(zhì)對UMP或GMP的干擾；HLB固相萃取方法[9]雜質(zhì)去除能力弱，陰離子交換固相萃取[11]在不使用內(nèi)標(biāo)的情況下回收率偏低；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法由于不銹鋼毛細(xì)管噴霧鋼針對核苷酸磷酸基團(tuán)的捕集吸附，導(dǎo)致靈敏度下降、重現(xiàn)性差[12]。親水作用液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）法適合對極性化合物的分離[13-14]，但是選擇合適的固定相和樣品前處理方式對分析方法的開發(fā)至關(guān)重要。

本研究采用具有磺酸甜菜堿兩性離子官能團(tuán)固定相的HILIC方法對嬰幼兒配方乳粉中5 種核苷酸進(jìn)行定量分析，開發(fā)針對核苷酸這種兩性化合物的二維固相萃取方式，并且完善前處理方法，旨在為乳制品中核苷酸的定量分析提供重要的參考依據(jù)。同時評估嬰幼兒配方乳粉在不同加工工藝過程中的損耗以及貨架期的損耗，對嬰幼兒配方乳粉的研發(fā)具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方牛乳粉、嬰幼兒配方羊乳粉、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒乳蛋白部分水解配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒氨基酸配方食品均為市售；不同工藝嬰幼兒配方乳粉為委托不同工廠生產(chǎn)。

磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鉀溶液、正磷酸、甲酸、氨水、核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（CMP、UMP、AMP、IMP、GMP） 美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Fisher Chemical公司；乙酸（分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；去離子水（電阻率18.2 MΩ·cm）由美國Milipore公司超純水儀制備。

雙層填料（弱陰離子交換/強(qiáng)陽離子交換）固相萃取柱天津迪科馬實驗設(shè)備有限公司；0.22 μm PTFE針頭過濾頭（13 mmh 0.22 μm） 美國CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-CLASS超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀、2695高效液相色譜儀（配有紫外檢測器） 美國Waters公司；UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司 ；PB-10/C酸度計德國賽多利斯公司；QGC-12T干熱式氮吹儀 上海泉島科貿(mào)有限公司；V18R多功能臺式高速冷凍離心機(jī) 澳大利亞Dynamica公司；BS210S型分析天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Syncronis HILIC色譜柱（2.1 mmh 100 mm，1.7 μm，100 ?）；流動相：A為0.001%甲酸-乙腈，B為10 mmol/L磷酸二氫鈉，pH 5；流速0.4 mL/min；等度洗脫：A-B（80∶20，V/V）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測器波長254 nm。

1.3.2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與濃度校正

采用紫外分光光度法對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行校正[11]，核苷酸以酸型計，結(jié)構(gòu)式見表1。分別準(zhǔn)確稱取50 mg核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中。加入40 mL去離子水，溶解后，定容至刻度。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL于50 mL容量瓶中，用0.25 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.5，用0.1%磷酸調(diào)節(jié)）定容至刻度，按照表1測定其最大波長下該溶液的吸光度。

分別準(zhǔn)確稱取UMP 10 mg、AMP 10 mg、IMP 10 mg、GMP 10 mg、CMP 15 mg于5 個10 mL容量瓶中。加入5 mL去離子水，溶解后，定容到刻度。每種核苷酸分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6 個50 mL容量瓶中，加入35 mL乙腈，然后用水定容至刻度，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 5 種核苷酸的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of five nucleotides

1.3.3 樣品前處理

稱取混合均勻的固體試樣1 g（精確至0.1 mg），于50 mL離心管中，加入10 mL超純水（50～60 ℃）充分溶解試樣，冷卻至室溫。用10%乙酸溶液調(diào)pH值至4.1f 0.05，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水定容至25 mL，混勻，過濾待凈化。

采用雙層填料（弱陰離子交換/強(qiáng)陽離子交換）固相萃取柱，依次向柱中加入3 mL甲醇和3 mL水進(jìn)行活化，棄去流出液；準(zhǔn)確吸取2.5 mL待凈化液加入柱中，棄去流出液；加入5 mL甲醇進(jìn)行淋洗，控制流速1 滴/s；加入10 mL 30%氨水-甲醇溶液洗脫，收集流出液，控制流速1 滴/s；將洗脫液在50 ℃氮氣保護(hù)下吹干，準(zhǔn)確加入1 mL 30%乙腈溶液，超聲溶解，0.22 μm PTFE微膜過濾供UPLC分析。

1.3.4 計算方法

1.3.4.1 5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品純度計算

5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品純度按式（1）計算：

式中：Amax為在最大波長下的吸光度；為核苷酸1%比色光系數(shù)；m為標(biāo)準(zhǔn)儲備液中核苷酸的質(zhì)量/g；50為標(biāo)準(zhǔn)儲備液的定容體積/mL；50為純度校正溶液的定容體積/mL；1為加入到純度校正溶液中標(biāo)準(zhǔn)儲備液的體積/mL。

1.3.4.2 樣品中5’-核苷酸含量計算

根據(jù)測定原理建立數(shù)學(xué)模型，見式（2）：

式中：Xi為試樣中核苷酸各組分含量/（mg/100 g）；Ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣溶液中各核苷酸各組分的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Vi為試樣溶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量/g。

試樣中游離核苷酸的總量按式（3）計算：

式中：X總為試樣中游離核苷酸總量/（mg/100 g）；XCMP、XUMP、XAMP、XGMP、XIMP分別為按式（2）計算出的對應(yīng)游離核苷酸含量/（mg/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

采用ChemDraw軟件繪制原理結(jié)構(gòu)圖；理化參數(shù)（5 種核苷酸的正辛醇-水分配常數(shù)（lgP）、電離常數(shù)（pKa）、pH值依賴的正辛醇-水分配系數(shù)（lgD）和不同pH值下5 種核苷酸的預(yù)測離子化狀態(tài)百分比）根據(jù)ChemAxon軟件模擬計算得出；采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析、統(tǒng)計及趨勢圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

2.1.1 不同類型色譜柱上核苷酸的保留情況

表2 不同類型HILIC色譜柱的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)Table 2 Structures of functional groups of different types of HILIC columns

HILIC法為反相離子對液相方法提供了可行的替代方法，是分離和保留極性或可電離化合物（即lgP低于0的化合物，表1）的最成功方法之一。本實驗測試來自6 個制造商的8 種類型的HILIC色譜柱，固定相涵蓋了多種HILIC常用的鍵合相。如表2所示，氨丙基和兩性離子色譜柱具有帶電官能團(tuán)，而裸硅膠、酰胺基和二醇基色譜柱在本研究使用的色譜條件下為中性。分別從保留、選擇性、峰形和分離度等方面對核苷酸在不同HILIC色譜柱上的分離行為進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在核苷酸分離方面，具有不同官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的HILIC色譜柱之間存在顯著差異，對固定相和流動相之間的相互作用也進(jìn)行了闡述。

從理論上講，具有酰胺基和氨丙基官能團(tuán)的固定相應(yīng)當(dāng)最適合對酸性分析物進(jìn)行分離，酰胺基和氨丙基分別可與核苷酸上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵和靜電相互作用，從而使其在色譜柱上得到良好保留；裸硅膠和二醇基可以通過氫鍵作用力與帶負(fù)電荷的分析物相互作用[15-16]。但從本實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，具有裸硅膠和二醇基官能團(tuán)的色譜柱對核苷酸并沒有明顯保留；氨丙基色譜柱上未觀察到核苷酸的洗脫，推測核苷酸可能仍保留在色譜柱上，酸性條件使氨丙基帶正電，而且使固定相表面極性基團(tuán)質(zhì)子化，從而與核苷酸磷酸基團(tuán)之間產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用，阻止了核苷酸的洗脫。據(jù)文獻(xiàn)報道，氨丙基色譜柱上保留了核苷酸[17]，但洗脫條件（pH 9.45）可能加速硅膠基質(zhì)的降解，長時間使用可能會加快色譜柱的損壞；酰胺基色譜柱和磷酸膽堿型兩性離子鍵合的色譜柱對核苷酸有保留，但未將5 種核苷酸完全分離，樣品分離度差。

圖1 5 種核苷酸在不同色譜柱上的分離情況Fig.1 Separation profiles of five nucleotides on different columns

實驗過程中觀察到5 種核苷酸在全多孔（Merck SeQuant ZIC-HILIC）與表面多孔（Agilent Poroshell 120 HILIC-Z）和超高壓色譜柱（Thermo Syncronis HILIC）上的出峰順序不一致（圖1），可以判斷出即使相同類型的兩性離子磺酸甜菜堿色譜柱，在不同生產(chǎn)商和不同工藝下生產(chǎn)的色譜柱也有差別，原因可能是連接磺酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán)的短鏈烷基長短的差異影響了2 個基團(tuán)的電荷距離。而在3 款磺酸甜菜堿型HILIC色譜柱上，5 種核苷酸分離度均大于1.5，且峰形尖銳對稱（圖1）。綜合分離時間及響應(yīng)值等因素，選用Syncronis HILIC色譜柱，其具有分辨率高、分析速度快等優(yōu)勢，而且樣品批間測定重復(fù)性高。

2.1.2 核苷酸在磺酸甜菜堿型HILIC色譜柱上保留原理的分析

圖2 5 種核苷酸在磺酸甜菜堿型兩性HILIC色譜柱上的分離機(jī)理Fig.2 Separation mechanism of five nucleotides on sulfoalkylbetainebased zwitterionic HILIC column

磺酸甜菜堿型HILIC色譜柱的特點為強(qiáng)酸性磺酸基團(tuán)（鍵合配體末端）和強(qiáng)堿性季銨基團(tuán)（靠近硅膠表面）分別帶有負(fù)電荷和正電荷，2 個帶相反電荷的基團(tuán)被一個短鏈烷基間隔，其物質(zhì)的量比為1∶1，因此鍵合層上的表面凈電荷非常低，受pH值的影響很小。對于兩性離子固定相，離子交換和靜電相互作用較典型的離子交換（氨丙基、裸硅膠、酰胺等）弱?；撬崽鸩藟A鍵合相通過氫鍵強(qiáng)烈吸附水，大部分水層成為固定相的一部分（圖2），該富水層在保留機(jī)理方面起著重要作用，使分析物在流動相和富水層之間分配；核苷酸的雜環(huán)基團(tuán)（含有帶正電的質(zhì)子化氮原子和非質(zhì)子化氮原子）和帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)分別可與位于配體兩端的磺酸基團(tuán)和季氨基產(chǎn)生氫鍵作用和靜電相互作用；固定相與核苷酸之間還存在弱離子交換作用。通過親水分配作用、氫鍵、靜電相互作用和弱離子交換等多種作用力的協(xié)同作用[18-22]，磺酸甜菜堿鍵合相對核苷酸的結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)出了高度的選擇性，保留時間隨分析物極性的增加而增加。當(dāng)考慮在兩性HILIC分離中的保留程度時，分析物和固定相之間的靜電排斥（磺酸基團(tuán)與磷酸基團(tuán)）也很重要，這需要通過一定濃度的緩沖鹽溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2.2 流動相的選擇

2.2.1 不同pH值條件下核苷酸的靈敏度和離子化狀態(tài)

圖3 5 種核苷酸在不同pH值條件下的吸光度Fig.3 Absorbance of five nucleotides at different pH values

配制pH 1～6的0.25mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，分別用不同pH值的緩沖溶液溶解同一含量的核苷酸，在波長254 nm處測其吸光度，如圖3所示?？梢钥闯? 種核苷酸在不同pH值條件下吸光度的變化，CMP的吸光度隨pH值的增大而增大，CMP的吸光度在pH 1～6范圍內(nèi)的變異系為23.6%；而AMP、UMP、GMP、IMP的吸光度在pH 1～6范圍無顯著變化，其變異系數(shù)分別為4.2%、3.8%、5.0%、2.4%。通過5 種核苷酸的吸光度分析，在pH 1～6范圍內(nèi)，當(dāng)pH＞5時，5 種核苷酸的靈敏度最高。

流動相pH值的優(yōu)化對于控制不同核苷酸的離子化狀態(tài)至關(guān)重要，每種核苷酸在不同pH值下存在不同的離子化狀態(tài)。同種核苷酸在不同離子化狀態(tài)下的色譜行為不同，混合的離子化狀態(tài)會導(dǎo)致峰展寬和保留時間的不一致。因此，找到最佳pH值，使每種核苷酸均存在一種占主導(dǎo)的離子化狀態(tài)至關(guān)重要。使用ChemAxon軟件對每個核苷酸的正辛醇-水分配系數(shù)（lgP），pH值依賴的正辛醇-水分配系數(shù)（lgD）和pKa值進(jìn)行計算，如表1、3所示。從表3得出不同pH值下5 種核苷酸的lgD值均小于0，說明在此pH值范圍內(nèi)5 種核苷酸均適用于HILIC分析。圖4為使用ChemAxon軟件計算得出的不同pH值下CMP的預(yù)測離子化狀態(tài)百分比，選取占比最大的A、B和C 3 個離子化狀態(tài)進(jìn)行說明：A離子磷酸根帶一個負(fù)電荷，嘧啶雜環(huán)上的氮原子被質(zhì)子化，其占比最高的pH值為3附近；B離子只有磷酸根帶一個負(fù)電荷，嘧啶基團(tuán)無被質(zhì)子化氮原子，其占比最高的pH值約為5.5；C離子磷酸根帶2 個負(fù)電荷，嘧啶基團(tuán)無被質(zhì)子化氮原子，其占比最高的pH值為9.5～10.5。從這些數(shù)據(jù)可以明顯看出，在pH 5.5的條件下CMP以單一化離子狀態(tài)存在且占比最大；在pH 3條件下CMP以兩性狀態(tài)存在；pH 9.5～10.5的條件下硅膠基質(zhì)的溶解度增加，因此對于分析CMP，其最佳pH 5.5?；谙嗨频姆治?，每種核苷酸都有自己的最佳pH值，表3數(shù)據(jù)根據(jù)ChemAxon軟件計算得出，比較5 種核苷酸后，結(jié)合上述5 種核苷酸的pH值-吸光度結(jié)論，得出滿足此5 種核苷酸最佳范圍且最主要以單個離子形式存在的最合適的pH值為5。

表3 不同pH值下5 種核苷酸的lgD、電荷狀態(tài)和電離百分比Table 3 lgD values, charge states, and ionization percentages of five nucleotides at different pH values

圖4 不同pH值下CMP的預(yù)測離子化狀態(tài)百分比Fig.4 Predicted percent ionization state of CMP at different pH values

2.2.2 緩沖鹽的類型和濃度的選擇

使用緩沖鹽溶液，可以降低帶電分析物與未修飾的帶電硅醇基或固定相上帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用（引力和斥力）。在靜電引力的作用下，緩沖鹽濃度的增加會導(dǎo)致帶電分析物在帶相反電荷的固定相上的保留減少；而在靜電斥力作用下，會導(dǎo)致帶電分析物在具有相同電荷的固定相上的保留增加[17]。HILIC模式常用的緩沖鹽類型有銨鹽和磷酸鹽，磷酸鹽和乙酸銨的截止波長均小于220 nm，均適合UV檢測的高效液相色譜分析。乙酸銨的緩沖范圍為3.8＜pH＜5.8，實驗過程中發(fā)現(xiàn)，即使乙酸銨的濃度達(dá)到100 mmol/L，5 種核苷酸也不能達(dá)到基線分離。磷酸鹽具有3 個pKa值，在允許緩沖pKaf 1 pH單位的情況下，3 個緩沖范圍為1.1＜pH＜3.1、6.2＜pH＜8.2和11.3＜pH＜13.3。使用濃度為10 mmol/L的磷酸二氫鈉溶液，當(dāng)其pH值在其緩沖區(qū)間2.6時，CMP響應(yīng)明顯降低，與上述結(jié)論相符；pH 5雖然不在磷酸鹽的緩沖區(qū)間，但是5 種核苷酸分離度均大于1.5。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，與乙酸銨溶液相比，磷酸二氫鈉溶液具有較高的電荷密度，能有效平衡分析物和磺酸甜菜堿型兩性固定相之間的靜電相互作用，改善了核苷酸的峰形；而且改變分析物和磺酸甜菜堿型兩性固定相之間的靜電相互作用所需的磷酸鹽含量遠(yuǎn)低于乙酸銨溶液；此外，磷酸鹽可阻斷固定相基質(zhì)中的痕量金屬（例如鐵、銅、鋁等）與分析物的配位，從而改善色譜峰的形狀[23]。

2.2.3 有機(jī)相的選擇與優(yōu)化

影響保留的主要因素是固定相類型，流動相中水溶液的比例以及水溶液中緩沖鹽的類型、濃度和pH值[19,24-25]。HILIC要求使用包含質(zhì)子惰性溶劑的高比例（40%～97%）有機(jī)溶劑作為流動相，以及至少3%的水或緩沖鹽溶液，以配合其極性固定相，便于色譜分離。

由于甲醇可與核苷酸競爭固定相上的氫鍵位點，導(dǎo)致核苷酸的保留率和選擇性降低，因此選用乙腈作為流動相中的有機(jī)相。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，增加乙腈的濃度，分析物在固定相上的保留時間都會延長。原因是在高比例乙腈下，流動相變得更加疏水，分析物與極性固定相之間發(fā)生了更強(qiáng)的相互作用，從而實現(xiàn)了更強(qiáng)的分配機(jī)制[24,26]。

在HILIC分離過程中，pH值的控制和測量較復(fù)雜。盡管準(zhǔn)確設(shè)置水性流動相的pH值相對簡單，但使用標(biāo)準(zhǔn)pH計對含有高比例有機(jī)相設(shè)置相同的pH值是不切實際的。乙腈是一種介電常數(shù)低的弱堿，大比例的乙腈會改變分析物的電離狀態(tài)[26-27]，也導(dǎo)致無法確定所需要的pH值，尤其是梯度洗脫過程中有機(jī)成分變化。實驗發(fā)現(xiàn)，在使用0.001%甲酸-乙腈溶液代替100%乙腈溶液作為有機(jī)相時，5 種核苷酸的保留時間和分離度均有改善。

2.3 樣品前處理條件的建立

2.3.1 固相萃取前樣品的處理

建立固相萃取方法的過程中，樣品基質(zhì)的性質(zhì)與目標(biāo)化合物同樣重要。由于HILIC模式的流動相中包含大比例有機(jī)相，使用GB 5413.40ü 2016[7]的方法進(jìn)行樣品前處理時，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣后樣液遇到有機(jī)相會產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致柱壓逐漸升高；而且，在使用同樣修飾基團(tuán)的表面多孔和超高壓色譜柱時溶劑效應(yīng)明顯，CMP和GMP峰形差、峰分裂。當(dāng)按照流動相初始比例稀釋樣液時，有沉淀產(chǎn)生，離心上機(jī)后測得值偏低。原因或為乙腈使蛋白質(zhì)失去表面電荷而產(chǎn)生沉淀的同時，吸附了樣液中一部分核苷酸，導(dǎo)致測定值偏低。根據(jù)嬰幼兒配方奶粉高蛋白、高脂肪、高乳糖的性質(zhì)，將樣品溶解后加入一定量的甲酸溶液沉淀蛋白，分別用0.02%、0.5%、2%、4%、8%甲酸溶液進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)不同品牌的嬰幼兒配方奶粉沉淀效果均不一致。后采用稱量1 g樣品，加入10 mL 60 ℃超純水溶解，用10%乙酸溶液調(diào)pH值至4.1f 0.05沉淀蛋白，此種方式不論羊奶粉還是牛奶粉，沉淀效果一致，而且降低了樣品的黏度，樣品pH值與后續(xù)采用的固相萃取機(jī)理一致。

2.3.2 固相萃取材料的選擇

乳制品的基質(zhì)比較復(fù)雜，根據(jù)核苷酸的結(jié)構(gòu)和pKa值（表1）及固相萃取的原理，應(yīng)采用強(qiáng)陽離子交換（SCX）或陰離子交換固相萃取模式。但實驗發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)陽離子固相萃取模式對CMP和UMP有明顯保留；弱陰離子交換對AMP、GMP、IMP有明顯保留；強(qiáng)陰離子交換5 種成分均無法洗脫，因此通過一種模式進(jìn)行固相萃取無法達(dá)到滿意的效果。本研究通過以上實驗結(jié)果開發(fā)出了二維固相萃取模式，即PSA（弱陰離子交換）和SCX（強(qiáng)陽離子交換），2 種填料在同一個固相萃取柱內(nèi)添加。PSA與SCX的洗脫條件一致，均為酸性樣液上柱，堿性溶液洗脫，通過PSA保留磷酸基團(tuán)，SCX保留含氮基團(tuán)。實驗開始采用聚合物表面修飾的固相萃取填料，發(fā)現(xiàn)GMP回收率低，即使加大氨水-甲醇溶液中氨水的比例也不能使其全部洗脫，原因或為聚合物（苯乙烯-二乙烯基苯聚合物）材料比表面積大，表面修飾的弱陰離子交換基團(tuán)多、密度高、離子交換容量為3.0 mmol/g，對GMP產(chǎn)生了不可逆吸附。后采用硅膠表面修飾的填料，其離子交換容量為1.8 mmol/g，提高了GMP回收率。另外采用PSA和SCX兩種填料進(jìn)行混合，發(fā)現(xiàn)回收率不穩(wěn)定；SCX在上，PSA在下發(fā)現(xiàn)洗脫液渾濁；最終發(fā)現(xiàn)PSA在上，SCX在下效果最佳。

2.3.3 固相萃取方法的建立

通常采用甲醇或極性有機(jī)溶劑作為固相萃取柱的預(yù)處理溶液，水或緩沖溶液作為平衡溶液，上樣后采用水或緩沖溶液和有機(jī)溶液依次進(jìn)行淋洗[28]。實驗發(fā)現(xiàn)上樣后用水淋洗后，采用不同比例的甲醇溶液對固相萃取柱進(jìn)行淋洗，CMP回收率均低于60%。后采用上樣后直接用甲醇進(jìn)行淋洗，CMP回收率有所改善。洗脫采用5%～35%的氨水-甲醇溶液依次進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)采用30%氨水（pH 10.5）作為洗脫液時5 種核苷酸回收率均大于95%。圖5B與圖5A相比，最后一個成分GMP出峰后仍有雜質(zhì)出峰，持續(xù)20 min結(jié)束（色譜圖未完全展示）。通過圖5及實驗數(shù)據(jù)分析，此種固相萃取方式有效的除去了雜質(zhì)，保證了方法的準(zhǔn)確性。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.5 Chromatograms of partially hydrolyzed protein infant formula samples for special medical purposes

2.4 溶劑效應(yīng)的消除

圖6 5 種核苷酸的溶劑效應(yīng)色譜圖Fig.6 Chromatograms showing solvent effect of 5 nucleotides

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用純水配制標(biāo)準(zhǔn)品時，溶劑效應(yīng)明顯（圖6），原因或為樣品被注入色譜柱，當(dāng)樣品溶劑與流動相存在差異時，一部分樣品溶解進(jìn)入了流動相，一部分還留在溶劑里，造成色譜保留的差異，因此使用含有一定比例乙腈的溶液配制標(biāo)準(zhǔn)品和復(fù)溶樣品。由于大比例乙腈條件下核苷酸的溶解度較差，因此通過調(diào)節(jié)有機(jī)相比例和進(jìn)樣量2 種方式消除溶劑效應(yīng)。分別使用乙腈-水和乙腈（pH 5的10 mmol/L磷酸二氫鈉溶液）為60∶40、65∶35、70∶30、75∶25的溶液配制核苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和復(fù)溶樣品，每個標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品分別進(jìn)樣1、2、3、4、5 μL。通過實驗發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-水比例70∶30、進(jìn)樣量2 μL時，無論標(biāo)準(zhǔn)品還是復(fù)溶的樣品，峰形尖銳對稱，有效消除了溶劑效應(yīng)。

2.5 儀器條件的優(yōu)化

磷酸基團(tuán)是一種非常強(qiáng)的螯合劑，與高效液相色譜系統(tǒng)中的金屬存在相互作用，導(dǎo)致色譜峰不對稱，峰分裂等情況。有文獻(xiàn)報道[29]在流動相中添加焦磷酸改善磷酸基團(tuán)與金屬的相互作用，但實驗結(jié)果顯示此方法對于核苷酸分析并不適用，因此在實驗前有必要對高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行鈍化。用30%磷酸溶液（取85%濃磷酸35 mL與65 mL水混勻）作清洗劑，清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內(nèi)的污垢；用6 mol/L的硝酸（取濃硝酸40 mL與60 mL水混勻）作鈍化劑，鈍化目的是使不銹鋼管路的內(nèi)表面形成光滑均勻的氧化膜，先清洗再鈍化。依次用甲醇、水、30%磷酸、6 mol/L硝酸及超純水灌注泵及進(jìn)樣系統(tǒng)，流速1 mL/min，時間1 h；待流出超純水pH值為中性時，用純甲醇過渡，浸潤泵頭及管路。

分析物和固定相相互作用的差異與HILIC模式中溫度的變化有關(guān)[30-31]。將親水性分析物從富含有機(jī)物的流動相中轉(zhuǎn)移到固定相表面上的富水層是一個放熱過程，而帶電分析物與固定相之間的靜電引力是吸熱過程[25]。通常，色譜柱溫度升高會導(dǎo)致峰變窄以及保留時間縮短[32]。本研究選取25、30、35、40、45 ℃，5 個溫度對5 種核苷酸的保留因子和峰形進(jìn)行比較，當(dāng)柱溫≤30 ℃時，5 種核苷酸的保留時間有漂移；當(dāng)柱溫≥35 ℃時，5 種核苷酸的保留時間穩(wěn)定且峰形有所改善，靈敏度無顯著差異，因此柱溫選擇為35 ℃。

2.6 方法驗證

2.6.1 方法的線性方程、線性范圍和定量限結(jié)果

分別用不同質(zhì)量濃度的CMP、UMP、AMP、GMP、IMP標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，通過回歸計算求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，可見在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈正相關(guān)，相關(guān)性好，可用于外標(biāo)法進(jìn)行定量測定。根據(jù)GB/T 27417ü 2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》[33]方法計算檢出限，采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按樣品前處理方法進(jìn)行處理和檢測，以3 倍信噪比為方法檢出限，以10 倍信噪比為方法定量限，結(jié)果如表4所示。

表4 5 種核苷酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection, and limits of quantification of five nucleotides

2.6.2 方法回收率與精密度結(jié)果

根據(jù)JJF 1059.1ü 2012《測量不確定度評定與表示》[34]，精密度為在規(guī)定條件下，對同一或類似被測對象重復(fù)測量所得示值或測得值間的一致程度。按照實驗方法，對一定濃度含有5 種核苷酸的樣品進(jìn)行12 次重復(fù)性測試，計算其測試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異數(shù)）。根據(jù)GB/T 32465ü 2015《化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》[35]，應(yīng)使用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品核查、參加能力驗證計劃、與經(jīng)典方法或公認(rèn)方法進(jìn)行比對等手段實施方法正確度研究，可結(jié)合回收率進(jìn)行正確度研究，如表5所示。采用牛奶基質(zhì)嬰兒/成人營養(yǎng)奶粉有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIST SRM 1849a作為比對樣品，如表6所示，其結(jié)果均符合GB/T 27404ü 2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[36]中的相關(guān)要求。

表5 不同樣品中精密度與回收率結(jié)果測定結(jié)果（n=12）Table 5 Precision and recoveries for different samples (n= 12)

表6 NIST SRM 1849a測定結(jié)果（n=6）Table 6 Results of determination using NIST SRM 1849a (n= 6)

2.7 不同加工工藝過程中的損耗以及貨架期損耗的評估

嬰幼兒配方粉生產(chǎn)工藝有濕法工藝、干法工藝和干濕復(fù)合工藝3 種。在濕法工藝和干濕復(fù)合工藝下，核苷酸原料均為溶解后，經(jīng)過均質(zhì)、殺菌、濃縮、噴霧干燥等加工過程，應(yīng)考慮核苷酸在溶解過程中的熱損耗和堿性磷酸酶的分解損耗[37-38]。干法工藝下核苷酸原料直接混入基粉中，理論上無損失。通過對過保質(zhì)期的產(chǎn)品留樣測試，評估在正常儲存條件下，核苷酸的損耗。使用本方法對每類樣品進(jìn)行測試，通過對比理論添加值與實際測試數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)核苷酸在嬰幼兒配方乳粉的3 種生產(chǎn)加工過程中和貨架期均無明顯損耗。因此，只要確定好核苷酸原料的含水量、含鹽量，同時確保核苷酸原料的添加量，即可在相應(yīng)的工藝流程下生產(chǎn)出配方設(shè)計含量的產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

本研究采用弱陰離子交換/強(qiáng)陽離子交換二維固相萃取法提取樣品中的核苷酸，磺基甜菜堿型兩性離子HILIC方法對嬰幼兒配方乳粉中5 種核苷酸進(jìn)行定量分析。詳細(xì)闡述核苷酸在不同HILIC色譜柱上的保留情況，以及核苷酸在磺酸甜菜堿型HILIC色譜柱上保留機(jī)理，計算得出不同pH值下核苷酸的電荷狀態(tài)。經(jīng)過方法學(xué)驗證，該方法回收率、精密度滿足GB/T 27404ü 2008[36]中的相關(guān)要求。同時對嬰幼兒配方乳粉在不同加工工藝過程中的損耗以及貨架期的損耗進(jìn)行評估，結(jié)果表明，核苷酸在嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)加工過程中和貨架期均無明顯損耗。本研究可為核苷酸的分離和嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)及研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。