高效液相色譜法分析中國人參不同部位中多酚類化合物

徐艷陽，趙玉娟，高 峰，王二雷，魯海玲，李雪鳳，姜雯雯，陳 艷,*

（1.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062；2.琿春華瑞參業(yè)生物工程股份有限公司，吉林 琿春 133000）

人參是一種多年生草本五加科人參屬植物（Panax ginsengC.A.Meyer），其根為圓柱形或紡錘形，末端多分枝，外皮淡黃色；人參莖直立，圓柱形，人參葉為掌狀復(fù)葉，有長柄[1-2]，素有“百草之王”的美稱，是我國傳統(tǒng)的滋補養(yǎng)生名貴藥材。世界人參的主產(chǎn)區(qū)在中國東北、朝鮮、韓國、日本、俄羅斯東部以及美國和加拿大[3]。中國人參的產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%，主產(chǎn)區(qū)在吉林省，其中長白山區(qū)產(chǎn)量占85%。作為中國民族品牌的“長白山人參”，在2011年已成為注冊商標(biāo)，同時被列為地理標(biāo)志產(chǎn)品，同時，吉林省已將“長白山人參”區(qū)域公用品牌作為實施品牌發(fā)展戰(zhàn)略的重點工作之一[4-5]。2012年我國批準(zhǔn)種植的人參為新資源食品后，人參的應(yīng)用也由單一的中藥材拓展到食品、飲料及保健產(chǎn)品等多個領(lǐng)域，為我國人參產(chǎn)業(yè)的跨越式發(fā)展提供了新契機[6]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人參具有多種生物學(xué)和藥理特性，如免疫刺激、抗癌、止吐、抗氧化等[7-11]。這些特性與人參中的化學(xué)成分密切相關(guān)，如人參皂苷、人參多糖、生物堿、游離氨基酸、多酚以及檸檬烯等揮發(fā)性化合物[12-14]。其中多酚類化合物是植物的次生代謝產(chǎn)物，大部分由苯丙氨酸衍生而來，少部分由酪氨酸衍生而來。按其結(jié)構(gòu)不同可分為類黃酮、木聚素、酚酸和木酚素[15]。然而，與人參皂苷相比，人們對人參中多酚類化合物的了解相對較少。韓國在前期開展了部分研究，如研究發(fā)現(xiàn)人參中對·NO起清除作用的為多酚類物質(zhì)，特別是對香豆酸和香草酸，而非人參皂苷。此外，生曬參提取物中的酚類化合物顯示出較強的去色素、改善氧化應(yīng)激及降低動脈粥樣硬化特性，并且對大鼠肝微粒體脂質(zhì)的氧化具有較強的抑制作用[16-20]。Chung等[21]采用高效液相色譜法對不同生長年限以及人參不同部位中的多酚類化合物進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)人參葉中含有豐富的綠原酸、間香豆酸和對香豆酸。Choi等[22]發(fā)現(xiàn)人參葉中含有大量的對香豆酸，人參果中酚酸主要以肉桂酸為主。Jung等[23]通過高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)紅、白人參根中的7 種主要游離酚酸中，以順式阿魏酸為主，酯化酚酸中以反式阿魏酸為主。長白山人參因產(chǎn)量高、質(zhì)量佳在世界上享有盛名。另外，金學(xué)俊[24]、曾露露[25]等只對人參莖葉及黑參中的總多酚含量進(jìn)行了測定，其他鮮見報道。因此，本實驗以長白山人參為研究對象，應(yīng)用高效液相色譜系統(tǒng)分析紅參根、生曬參根、人參莖、人參葉、人參花和人參須中的多酚類化合物含量和種類，以期為長白山人參的深加工和綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅參根、生曬參根、人參莖、人參葉、人參花、生曬參須由琿春華瑞參業(yè)生物工程股份有限公司提供。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸、間香豆酸、鄰香豆酸、肉桂酸、柚皮苷、兒茶素、柚皮素、芒柄花黃素、麥芽酚、橙皮素、甲基香蘭素、白藜蘆醇（HPLC≥98%）、纖維素酶（50 000 U/g）、果膠酶（50 000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸、無水乙醇、硫酸銨（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SJIA-10N-50A冷凍干燥機 寧波雙嘉儀器有限公司；PH070A型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海一恒科技有限公司；LD4-2A型低速離心機 北京市雷勃爾離心機有限公司；FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；AL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；QL-901型試管振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-4802型紫外-可見分光光度計 尤尼科（上海）儀器有限公司；KQ-250DB型超聲波清洗器 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；LC-30A高效液相色譜儀 日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品溶液的制備

人參粉末制備：人參根、莖、葉、花、須→粉碎→過篩（60 目）→人參粉末。

稱取人參粉末0.50 g，經(jīng)0.30 mg/mL纖維素酶-果膠酶配比為1∶2（g/g）復(fù)合酶溶液40 mL進(jìn)行酶解，酶解pH值為4.5，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h，過濾，收集濾液。在濾渣中加入70%乙醇溶液15 mL，50 ℃浸提30 min，抽濾，合并所有提取液，減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮提取液凍干后得到凍干樣品，儲存?zhèn)溆谩７Q取凍干樣品0.100 g，用甲醇配成10 mg/mL供試樣品溶液。

1.3.2 人參樣品中總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteus比色法測定，原理為在堿性溶液中多酚類化合物可將磷鎢酸鈉還原并生成藍(lán)色化合物，根據(jù)顏色的變化在波長765 nm處進(jìn)行比色測定。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參考GB/T 8313ü 2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[26]建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱?。?.110 0f 0.000 1）g沒食子酸于100 mL容量瓶，溶解并定容至刻度，搖勻，配成1 000 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度，搖勻得到質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL沒食子酸工作液。用移液管分別移取不同質(zhì)量濃度的沒食子酸工作液、水（作空白對照）及測試液各1 mL，于刻度試管內(nèi)，再分別加入5 mL福林-酚試劑，搖勻。反應(yīng)3～8 min，加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水至刻度、搖勻。室溫下放置60 min。在765 nm波長處測定吸光度。根據(jù)沒食子酸工作液的吸光度與對應(yīng)的質(zhì)量濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測定凍干樣品的吸光度，樣品中總多酚含量按下式計算：

式中：Y為樣品中總多酚含量/（mg/100 g）；C為樣液中總多酚的質(zhì)量濃度/ （μg/mL）；V為樣液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量/g；100為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 人參樣品中18 種多酚類化合物的檢測

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸、間香豆酸、鄰香豆酸、肉桂酸、柚皮苷、兒茶素、柚皮素、芒柄花黃素、麥芽酚、橙皮素、甲基香蘭素、白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。采用梯度稀釋法用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

稱取凍干樣品粉末0.100 g，用甲醇定容至10 mL容量瓶中。0.22 μm微孔濾膜過濾，作為檢測待測液。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱Symmetry?C18柱（4.6 mmh 150 mm，5 μm），流動相0.1%磷酸（A）和乙腈（B），檢測波長2 3 0 n m，柱溫3 0 ℃；進(jìn)樣量1 0 μ L；流速0.8 mL/min；梯度洗脫：0～7 min，85% A，15% B；7～17 min，70%～85% A，30%～15% B；17～27 min，5 1%～7 0% A，4 9%～3 0% B；2 7 ～3 0 m i n，4 5%～5 1% A，5 5%～4 9% B；3 0 ～3 5 m i n，3 0%～4 5% A，7 0%～5 5% B；3 5 ～4 0 m i n，30%～85% A，70%～15% B；40～45 min，85% A，15% B。

1.3.3.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參考鄧俊琳等[27]方法，精密吸取含有18 種多酚化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋至5、10、15、20、25、30 μg/mL，在1.3.3.2節(jié)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

重復(fù)性實驗：按照1.3.3.1節(jié)方法平行制備6 份人參葉多酚類化合物待測液，按1.3.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，計算18 種多酚類化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

精密度實驗：按照1.3.3.1節(jié)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3.2節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算18 種多酚類化合物峰面積的RSD。

穩(wěn)定性實驗：按照1.3.3.1節(jié)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3.2節(jié)色譜條件對同一樣品分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL，計算18 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD。

回收率實驗：稱取人參葉多酚樣品適量于具塞錐形瓶中，加入18 種標(biāo)準(zhǔn)品適量，按1.3.3.1節(jié)的方法制備人參葉多酚提取物樣品，再按1.3.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)樣10 μL，并計算18 種多酚類化合物的加標(biāo)回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 人參各部位中總多酚含量的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.011 7X+0.034 9（R2=0.999 6），由回歸系數(shù)可知，沒食子酸質(zhì)量濃度在0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于樣品總多酚含量的測定。如圖1所示，人參葉中總多酚的含量顯著高于其他部位（P＜0.05），為紅參根中總多酚含量的3.7 倍（P＜0.05）。人參莖和人參花中總多酚的含量接近，但顯著高于紅參根、生曬參根和人參須，分別是紅參根的2.5 倍，生曬參根、人參須的1.8 倍（P＜0.05）。

圖1 人參不同部位中總多酚含量Fig.1 Total polyphenol contents of different parts of ginseng

2.2 多酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和人參樣品的高效液相色譜檢測

從圖2可以看出，在色譜條件1.3.3.2節(jié)下，18 種多酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品得到較好分離，人參各部位溶液的色譜圖中目標(biāo)峰的保留時間與多酚單體標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰一致。在此色譜條件下，紅參根、生曬參根、人參莖、人參葉、人參花和人參須中18 種多酚類化合物得到較好分離。因此，根據(jù)每種多酚單體的保留時間和紫外吸收光譜的特征吸收波長對人參樣品中18 種多酚單體分別進(jìn)行定性。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

18 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。由回歸系數(shù)（R2＞0.980 7）可知，18 種多酚類化合物質(zhì)量濃度在5～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 18 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測范圍Table 1 Calibration curve equations, correlation coefficients, and linear ranges of 18 polyphenols

2.3.2 重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表2 18 種多酚類化合物的重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 2 Repeatability, precision and stability for determination of 18 polyphenols

由表2 可知，1 8 種多酚類化合物的R S D 為0.25%～3.49%，均小于5%，表明該測定方法重復(fù)性良好。18 種多酚類化合物峰面積的RSD為0.52%～3.02%，均小于5%，表明測定方法的精密度良好。18 種多酚類化合物峰面積的RSD為0.52%～2.58%，均小于3%，表明18 種多酚在測定時間8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 回收率實驗結(jié)果

表3 18 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品在人參葉樣品中的加標(biāo)回收率（n= 5）Table 3 Recoveries of phenolic compounds from spiked ginseng leaves (n= 5)

由表3可知，18 種多酚類化合物的加標(biāo)回收率在84%～99%之間，RSD均小于5%，表明本實驗方法有較好的回收率，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 人參不同部位中多酚類化合物含量的測定

由表4可知，不同部位的人參樣品中，18 種多酚類化合物中均以麥芽酚含量最高（P＜0.05），其次是兒茶素。人參花和人參須中的總酚酸含量高于人參葉、人參莖（P＜0.05），紅參根、生曬參根中的總酚酸含量較低。人參花中的總黃酮含量高于紅參根、生曬參根（P＜0.05），人參莖、人參葉、人參須中的總黃酮含量較低。本實驗測定結(jié)果的排序與Chon等[28]對高麗參各部位的多酚類化合物含量測定接近。Chung等[29]通過高效液相色譜法對高麗參葉中的23 種多酚類化合物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，高麗參葉中的原兒茶酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、龍膽酸、阿魏酸、柚皮苷、肉桂酸和兒茶素含量分別為30.41、1.37、9.82、17.97、3.37、1.30、0.93、4.96 μg/g，均低于中國人參。

另外，紅參根中的麥芽酚、兒茶素和原兒茶酸含量較高，分別為0.976 3、0.499 6、0.194 2 mg/g。其中紅參根中麥芽酚的含量高于Kong等[30]測定的數(shù)據(jù)（0.518 mg/g）。生曬參根中麥芽酚的含量最高，其次為兒茶素、龍膽酸。紅參根中未測到阿魏酸，與Chung等[21]的研究結(jié)果不同，我國生曬參根中阿魏酸含量低于測定的干白參根。這可能與多酚類化合物的提取方法和人參的種類、生長環(huán)境等有關(guān)。人參莖中的麥芽酚含量最高（P＜0.05），其次兒茶素含量較高。人參葉中主要以麥芽酚、兒茶素、原兒茶酸為主。人參花中主要多酚類化合物為麥芽酚、兒茶素、原兒茶酸以及對羥基苯甲酸，其中對羥基苯甲酸占18 種多酚化合物含量總和的46.08%。人參須中麥芽酚、龍膽酸、柚皮苷、丁香酸、兒茶素和原兒茶酸含量豐富。

表4 人參不同部位中多酚類化合物含量（n=3）Table 4 Polyphenol contents in different parts of ginseng (n= 3) mg/g

表5 各文獻(xiàn)中對人參中總多酚及總皂苷含量的對比Table 5 Contents of total polyphenols and total saponins in ginseng measured by the HPLC method and those reported in the literature

本實驗和其他文獻(xiàn)中關(guān)于人參中總多酚及總皂苷含量的測定結(jié)果如表5所示。由表5可知，人參中總多酚及總皂苷的含量不同，這與人參的種類、生長年限、水分含量、提取方法、測定方法和環(huán)境等因素有關(guān)。

3 結(jié) 論

本實驗應(yīng)用Folin-Ciocalteus比色法對長白山人參不同部位中總多酚的含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明紅參根、生曬參根、人參莖、人參葉、人參花、人參須中的總多酚含量依次為（69.47f 3.25）、（95.04f 5.03）、（1 7 5.1 9 f 3.2 6）、（2 5 6.9 1 f 2.8 1）、（174.40f 6.26）、（99.31f 2.90）mg/100 g。其中人參葉中總多酚含量最高，其次為人參莖、花，紅參根、生曬參根、人參須中的總多酚含量較低。

本實驗建立一種同時測定長白山人參各部位中原兒茶酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、龍膽酸、對香豆酸、阿魏酸、間香豆酸、柚皮苷、甲基香蘭素、鄰香豆酸、白藜蘆醇、肉桂酸、麥芽酚、兒茶素、柚皮素、芒柄花黃素和橙皮素18 種多酚化合物含量的高效液相色譜分析方法，各成分的峰形和分離度較好，保留時間穩(wěn)定。以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，18 種多酚化合物的出峰時間均在35 min內(nèi)，且與相鄰峰的分離度良好。18 種多酚化合物在波長230 nm處有較大的吸收，且色譜圖的基線較為平穩(wěn)。18 種多酚類化合物在長白山人參的各部位中，麥芽酚含量最高（P＜0.05），其次為兒茶素。人參花中的總酚酸含量高于人參葉和人參根（P＜0.05）；人參根中的總黃酮含量高于人參葉（P＜0.05）。該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可為有效控制人參多酚的質(zhì)量提供依據(jù)。