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      綠茶提取液制備金納米粒子及其在VC比色分析中的應用

      2021-03-01 01:43:36賈靜嫻丁文琪楊蕊寧
      食品科學 2021年4期
      關鍵詞:比色溶膠茶多酚

      張 源,賈靜嫻,鄭 賀,丁文琪,楊蕊寧

      (唐山師范學院化學系,唐山市綠色專用化學品重點實驗室,河北 唐山 063000)

      VC又稱抗壞血酸,是人體必需的營養(yǎng)物質,充當輔酶因子、抗氧化劑、神經遞質等角色,參與生理代謝過程[1]。VC過量或不足均引發(fā)疾病,因此準確檢測VC具有重要意義[2]。VC檢測方法主要有高效液相色譜法[3]、熒光分析法[4]、電化學方法[5]等,這些方法檢測結果可靠,靈敏度高,但存在抗干擾差、依賴儀器設備等不足,不能實現現場實時快速檢測。因此建立快速準確、滿足現場檢測、成本低廉的VC檢測方法十分重要[6]。目前基于納米材料的可視化檢測[7-9]成為研究熱點,該法可通過裸眼觀察溶液顏色實現目標分析物的定性及半定量分析,結果直觀形象,結合紫外-可見光度計檢測實現目標分析物的定量分析,快速簡便,實用性強。

      納米金材料因特殊的物理化學性質和較大摩爾吸收系數而被用于比色分析農藥[10]、金屬離子[11]、蛋白質[12]、細菌[13]、病毒[14]等。制備性能穩(wěn)定的金納米粒子用于比色分析,可避免金納米粒子在基質復雜的樣品中受到高鹽、強酸堿等影響而發(fā)生非特異性團聚。目前金納米粒子的制備方法主要有化學還原法[15]、物理研磨法[16]、生物合成法[17]等。其中最常用的是化學還原法,采用檸檬酸鈉[18]、硼氫化鈉[19]等作為還原劑,但該法存在一些不足,如制備需高溫、反應時間長、制備的金納米粒子易團聚,不利于后續(xù)應用。雖然可采用加入分散劑的方式如十六烷基三甲基溴化銨改善金納米粒子的穩(wěn)定性[20],但可能引起生物毒性而限制金納米粒子的應用;也可加入修飾劑如谷胱甘肽提高金納米粒子的穩(wěn)定性[21],雖然制得的金納米粒子生物相容性好,但是制備過程繁瑣耗時。因此,研發(fā)快速省時、條件溫和、成本低廉的方法制備性能穩(wěn)定、生物相容性好的金納米粒子十分必要。

      植物中富含蛋白質、脂肪、有機酸等天然活性成分[22],既可作為還原劑還原HAuCl4合成金納米粒子,又可作為保護劑修飾在金納米粒子表面,提高金納米粒子的穩(wěn)定性和生物相容性。木瓜汁[23]、獼猴桃汁[24]、廢棄葡萄皮[25]、中藥黃連[26]等已被用于綠色制備金納米粒子。茶葉中富含茶多酚、茶多糖、蛋白質和氨基酸等[27],其中茶多酚包括黃酮類、酚酸類、花色苷等三十多種多酚類物質。茶葉提取液已被用于制備銅納米粒子[28]、銀納米粒子[29]、鐵納米粒子[30]等,而用于制備金納米粒子的報道較少[31],目前鮮見關于綠茶提取液合成的金納米粒子用于VC比色分析的研究報道。

      本研究以綠茶提取液為還原劑和保護劑快速綠色制備金納米粒子,并與傳統(tǒng)方法制備的金納米粒子進行比較,評估金納米粒子的穩(wěn)定性。以綠茶提取液制備的金納米粒子作為催化劑和晶種,與VC和AgNO3溶液混合,利用VC還原AgNO3生成銀單質,覆蓋在金納米粒子表面形成金銀核殼納米粒子(AuNPs@Ag),作為核的金信號被覆蓋,而作為殼的銀信號產生。隨著VC含量的增加,銀信號越來越強,溶液顏色發(fā)生變化,結合紫外-可見光度計檢測,實現VC的定性及定量分析。如圖1所示,據此建立納米金比色檢測VC的新方法,為藥品、食品檢測提供技術支持。

      圖1 綠茶提取液制備金納米粒子用于比色檢測VC示意圖Fig.1 Schematic illustration of the preparation of AuNPs with green tea extract and the colorimetric detection of vitamin C

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      市購綠茶毛尖,原產地河南信陽;HAuCl4?3H2O、AgNO3、苯酚、濃硫酸和水合茚三酮 上海國藥集團化學試劑有限公司;蔗糖、葡萄糖、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、沒食子酸、甘氨酸 上海阿拉丁生化股份有限公司;茶多酚(純度98%) 北京酷爾化學科技有限公司;其余所用試劑均為分析純;實驗用水均為超純水。

      1.2 儀器與設備

      UV-2600紫外-可見分光光度計、CT15RT冷凍離心機上海天美科學儀器有限公司;Sigma-300場發(fā)射掃描電鏡德國卡爾蔡司有限公司;TENSOR-37傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克科學儀器公司。

      1.3 方法

      1.3.1 綠茶提取液配制

      稱取茶葉50 g,加入95 mL純水,室溫攪拌30 min后用0.22 μm水系濾膜過濾,收集濾液,定容至100 mL,綠茶提取液質量濃度為0.5 g/mL,于-20 ℃保存,用前解凍。制備金納米粒子時稀釋50 倍。

      1.3.2 綠茶提取液主要成分分析

      參考GB/T 8313ü 2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[32],福林-酚比色法測定綠茶提取液中茶多酚含量。配制沒食子酸標準溶液,質量濃度分別為10、20、30、40 μg/mL和50 μg/mL。移取綠茶提取液或沒食子酸溶液1 mL,加入5 mL 10%福林-酚溶液,反應5 min后加入4 mL 7.5% Na2CO3溶液,室溫放置60 min后,測定吸光度A765nm。

      參考GB/T 8314ü 2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[33],茚三酮比色法測定綠茶提取液中氨基酸的含量。配制谷氨酸標準溶液,質量濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL和0.6 mg/mL。移取綠茶提取液或谷氨酸溶液1 mL,依次加入0.5 mL pH 8磷酸緩沖溶液和0.5 mL 2%茚三酮溶液,沸水浴中加熱15 min,冷卻定容至25 mL,測定吸光度A570nm。

      采用苯酚-硫酸方法[34]檢測綠茶提取液中茶多糖的含量。配制葡萄糖標準溶液,質量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.15 mg/mL和0.2 mg/mL。移取綠茶提取液或葡萄糖溶液1 mL,加入1 mL 5%苯酚溶液,混勻后迅速滴加5 mL濃硫酸溶液,40 ℃加熱30 min,冷卻至室溫測定吸光度A488nm。

      1.3.3 綠茶提取液合成金納米粒子

      10 mL玻璃管中依次加入0.6 mL 0.01 g/mL綠茶提取液和0.1 mL 0.01 g/mL HAuCl4溶液,加水定容至10 mL,室溫反應30 min,溶液為紫紅色,即制得金納米粒子。采用紫外-可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜和掃描電鏡對金納米粒子進行表征。改變綠茶提取液用量、NaOH溶液用量、反應溫度和反應時間等金納米粒子制備條件,測定400~700 nm波長范圍內納米金溶膠的紫外-可見吸收光譜,得到金納米粒子制備的最佳條件。

      1.3.4 檸檬酸鈉為還原劑制備金納米粒子

      參考文獻[35]方法,以檸檬酸鈉為還原劑制備金納米粒子,所用玻璃器皿經王水浸泡2 h后用大量自來水沖洗,超純水潤洗。50 mL 0.1 g/L HAuCl4溶液加熱至沸騰后,快速加入0.01 g/mL 1.5 mL檸檬酸鈉溶液,攪拌加熱10 min,冷卻至室溫,即制得金納米粒子。該傳統(tǒng)方法制得的金納米粒子,用于比較綠茶提取液為還原劑合成的金納米粒子的穩(wěn)定性。

      1.3.5 金納米粒子的穩(wěn)定性評價

      分別考察2 種方法制備的金納米粒子在不同條件下的穩(wěn)定性。首先評估金納米粒子的熱穩(wěn)定性,在不同溫度(20、30、50、70 ℃和100 ℃)條件下,測定納米金溶膠在波長530 nm處吸光度;其次評估金納米粒子的耐鹽性能,在不同鹽濃度(0、0.05、0.1、0.2 mol/L和0.3 mol/L)條件下,測定納米金溶膠在波長530 nm處的吸光度;最后評估金納米粒子的耐酸堿性,在不同pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)條件下,測定納米金溶膠在波長530 nm處的吸光度,采用NaOH和HNO3溶液調節(jié)納米金溶膠pH值。

      1.3.6 納米金比色檢測VC

      10 mL比色管中依次加入0.3 mL納米金溶膠、1.4 5 m L 純水、0.5 m L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH 9.6)、0.5 mL 0.01 mol/L AgNO3溶液和0.5 mL 20 mg/L VC溶液,室溫反應30 min,觀察溶液顏色,拍照記錄實驗現象,并測定紫外-可見吸收光譜。其余操作不變,用0.5 mL超純水取代VC溶液為空白對照組。分別改變AgNO3用量、緩沖溶液pH值和反應時間等以得到比色檢測VC的最佳實驗條件。

      1.3.7 納米金比色檢測VC方法特異性

      為考察納米金比色檢測VC方法的特異性,分別用0.5 mL 200 mg/L甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、硫酸鎂、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、碳酸鉀、天冬氨酸、蔗糖、混合溶液1(含上述10 種干擾物質)、混合溶液2(含上述10 種干擾物質和VC)代替0.5 mL 20 mg/L VC,并按1.3.6節(jié)方法檢測。觀察溶液顏色,測定紫外-可見吸收光譜。

      1.3.8 方法分析性能評價

      采用逐級稀釋法配制質量濃度0、0.4、2、4、8、10、20、40、60、80、100 mg/L和120 mg/L VC溶液。取0.3 mL納米金溶膠,依次加入1.35 mL水、0.5 mL甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH 10.6)、0.6 mL 0.01 mol/L AgNO3溶液,最后加入0.5 mL不同濃度VC溶液,搖勻,室溫反應20 min后,拍照記錄實驗現象,并測定紫外-可見吸收光譜。以VC質量濃度為橫坐標,溶液在波長410 nm處吸光度(A410nm)為縱坐標,建立標準曲線。平行做10 組超純水代替VC的空白對照實驗,測定A410nm,以計算方法的檢出限(檢出限為3 倍空白信號的標準偏差除以標準曲線斜率)。

      1.3.9 實際樣品分析

      當地藥店購買2 種不同廠家生產的VC藥片(劑量均為100 mg/片),將藥片研磨,超純水溶解,配制成VC理論質量濃度為5 mg/L樣品溶液;通過標準加入法進行加標回收率實驗,將已知量的VC標準溶液加入至樣品溶液中,配制VC理論質量濃度為6、25 mg/L和55 mg/L加標樣品溶液。市售脈動飲料(VC質量濃度為200 mg/L),超純水稀釋配制VC理論質量濃度為5 mg/L樣品溶液,并配制VC理論質量濃度為6、25 mg/L和55 mg/L加標樣品溶液。按照1.3.8節(jié)方法操作,并計算加標回收率。綠茶提取液成分不同,會影響制備的金納米粒子的性質,從而影響VC的檢測結果。為了保證方法的準確性,繪制標準曲線和檢測樣品時需使用同一批綠茶提取液制備的納米金溶膠。

      1.4 數據處理與分析

      相關實驗做3 次平行,使用Origin 8.6軟件統(tǒng)計并分析實驗數據。

      2 結果與分析

      2.1 綠茶提取液主要成分分析結果

      實驗結果表明綠茶提取液中茶多酚含量為46.84 μg/g,與文獻報道的酒石酸亞鐵比色法測得茶葉提取液中茶多酚(0.111~0.253 mg/g)相比[36],本方法測得綠茶提取液中茶多酚含量略低,這可能與綠茶提取液配制溫度有關,本實驗室溫下配制,而文獻中加熱煮沸。綠茶提取液中未檢測到氨基酸,但紅外光譜圖顯示綠茶提取液中含有—NO2和—NH基團,這可能是茶葉中與蛋白質結合在一起的酸性糖蛋白,即茶多糖。經計算綠茶提取液中茶多糖的含量為34.91 μg/g。

      2.2 金納米粒子的合成

      圖2 金納米粒子和納米金溶膠相關分析圖Fig.2 UV-Vis spectrum, FT-IR spectrum and SEM image of AuNPs colloid prepared with tea polyphenols

      如圖2A所示,只有綠茶提取液加HAuCl4的溶液為紫紅色,單獨的綠茶提取液或HAuCl4溶液均為無色,紫外-可見分光光度計檢測可知,紫紅色溶液最大吸收波長為530 nm,這是金納米粒子獨有的表面等離子體共振特征。如圖2B所示,茶多酚的Oü H伸縮振動和茶多糖的Nü H伸縮振動位于3 400~3 205 cm-1;ü CH2—和—CH3的Cü H伸縮振動位于2 925 cm-1;茶多糖、茶多酚C=C和C=O伸縮振動位于1 650 cm-1;芳香族化合物—NO2伸縮振動位于1 534 cm-1;—OH面內彎曲振動位于1 450 cm-1;茶多酚、多元醇、酰胺Cü O伸縮振動位于1 399 cm-1;環(huán)的分子骨架振動位于1 236 cm-1;Cü Oü C反對稱伸縮振動位于1 146 cm-1;Cü N伸縮振動位于1 036 cm-1。傅里葉變換紅外光譜譜圖可知綠茶提取液中含有茶多酚、茶多糖等。反應后制備體系上清液中,1 532、1 234 cm-1和1 035 cm-1處吸收峰強度降低,表明有少量殘余茶多糖,而Oü H的伸縮振動、面內彎曲振動以及Cü O伸縮振動峰消失,推斷綠茶提取液中起還原作用的主要是茶多酚。制備的金納米粒子中,3 400 cm-1處弱吸收峰,表明金納米粒子表面有少量的—O H 和—N H 基 團;苯 環(huán) 上C ü H 伸 縮 振 動 位 于1 035 cm-1;C=O伸縮振動位于1 626 cm-1;Cü O伸縮振動位于1 400 cm-1;Cü Oü C反對稱伸縮振動位于1 120 cm-1;這些結果表明綠茶提取液中茶多酚的ü OH被氧化后的產物吸附在金納米粒子表面,充當保護劑。如圖2C所示,可看出制備的金納米粒子為球形,分散良好。以上實驗結果表明由綠茶提取液成功制備金納米粒子。

      茶多酚的羥基具有還原性,與Au3+發(fā)生氧化還原反應生成Au0,羥基氧化產物RO吸附在金納米粒子表面。即:+3R-OHn→Au0+4Cl-+3nH++3RO(n表示—OH個數)。為了驗證推測的綠茶提取液制備金納米粒子的還原機理,使用茶多酚制備納米金溶膠。將0.1 mL 0.01 g/mL HAuCl4溶液分別與1、3、5 mL和7 mL 20 mg/L茶多酚溶液混合,定容至10 mL,70 ℃反應30 min。如圖2D所示,當20 mg/L茶多酚體積在3 mL以上時可制備納米金溶膠,隨茶多酚體積的增大,金納米粒子的最大吸收波長稍有變小。茶多酚作為還原劑成功制備納米金溶膠,但是需要加熱且反應時間稍長。而綠茶提取液可在室溫條件下快速制備納米金溶膠,這表明綠茶提取液中茶多酚起還原作用,但是其他成分如茶多糖等在金納米粒子的制備中也有貢獻。

      2.3 綠茶提取液制備金納米粒子實驗條件優(yōu)化

      固定0.1 mL 0.01 g/mL HAuCl4溶液,定容10 mL,通過改變0.01 g/mL綠茶提取液用量0.03~2 mL,0.1 mL NaOH濃度0~0.1 mol/L,反應溫度20~100 ℃,反應時間2~26 min,測定制備的納米金溶膠的紫外-可見吸收光譜,以A530nm最大的條件為最佳。如圖3A所示,隨綠茶提取液用量增加,A530nm先增大后減小,當綠茶提取液用量為0.8 mL時A530nm最大,表明此時金納米粒子含量最大。堿性條件對納米顆粒的形成及生長具有重要影響[37],因此考察NaOH用量對合成金納米粒子的影響,從圖3B可知,加入不同濃度NaOH溶液,A530nm均在1.0左右,考慮到操作方便,后續(xù)選擇不加堿。不同溫度下,A530nm均在0.8以上(圖3C),可在室溫條件下制備金納米粒子。隨時間的延長(圖3D),4 min時A530nm已在0.9以上。綠茶提取液制備金納米粒子的最佳條件為綠茶提取液用量0.8 mL,室溫反應10 min。

      圖3 金納米粒子制備條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of synthesis conditions of AuNPs

      2.4 金納米粒子穩(wěn)定性

      制備性能穩(wěn)定的納米材料非常重要,在高鹽、強酸堿環(huán)境中易團聚的納米材料應用領域受限,難以用于實際樣品分析。當金納米粒子發(fā)生團聚時,顆粒粒徑、形狀和間距都發(fā)生變化,金納米粒子表面等離子共振特征吸收峰波長和強度均發(fā)生變化,據此本研究以A530nm作為指標,考察溫度、離子強度和pH值對金納米粒子穩(wěn)定性的影響,并與檸檬酸鈉制備的金納米粒子進行比較,結果如圖4所示。如圖4A所示,在不同溫度下,A530nm均保持不變,說明2 種方法制備的金納米粒子均耐高溫。如圖4B所示,當NaCl濃度低于0.3 mol/L時,綠茶提取液制備的金納米粒子A530nm基本不變,而檸檬酸鈉合成的金納米粒子A530nm明顯下降。如圖4C所示,綠茶提取液制備的金納米粒子A530nm沒有發(fā)生變化,而pH值在6以下和9以上時檸檬酸鈉合成的金納米粒子A530nm有所下降。這些結果表明在高鹽和強酸堿環(huán)境中檸檬酸鈉制備的金納米粒子發(fā)生了團聚,而綠茶提取液合成的金納米粒子穩(wěn)定性更佳,有利于后續(xù)應用,這可能與綠茶提取液中多成分充當保護劑有關。

      圖4 2 種金納米粒子穩(wěn)定性Fig.4 Stability of AuNPs prepared by two different methods

      2.5 納米金比色檢測VC

      綠茶提取液制備的金納米粒子用于比色分析VC的原理[38]:將納米金溶膠與VC和AgNO3混合,金納米粒子作為晶種和催化劑,VC還原AgNO3生成銀單質,覆蓋在金納米粒子表面,生成金銀核殼納米粒子,作為核的金信號減弱,作為殼的銀信號增強,裸眼觀察溶液顏色變化實現VC定性及半定量分析,結合紫外-可見分光光度計實現VC定量分析。使用紫外-可見分光光度計和掃描電鏡表征進行驗證,如圖5A所示,與對照組相比(純水取代VC),加入VC后溶液由淡紅色變?yōu)辄S色,最大吸收波長由530 nm藍移至410 nm;如圖5B所示,金銀核殼納米粒子粒徑比金納米粒子明顯增大。以上結果表明納米金比色檢測VC方法可行。

      圖5 加入VC前后體系的紫外-可見吸收光譜圖(A)和加入VC后體系的掃描電鏡圖(B)Fig.5 UV-Vis spectra of AuNPs in the absence and presence of vitamin C (A),and SEM image of AuNPs@Ag in the presence of vitamin C (B)

      2.6 納米金比色檢測VC條件優(yōu)化

      納米金比色檢測VC方法的靈敏度依賴于AgNO3用量、pH值和反應時間。固定加入0.3 mL納米金溶膠,0.5 mL 20 mg/L VC,定容2.75 mL,通過改變0.01 mol/L AgNO3溶液用量50~700 μL,緩沖溶液pH 9.0~10.6,反應時間0~39 min,測定金銀核殼納米粒子的紫外-可見吸收光譜,以A410nm最大的條件為最佳。如圖6所示,納米金比色檢測VC最佳條件為AgNO3溶液用量為600 μL,甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH值為10.6,反應時間40 min。使用甘氨酸-NaOH緩沖溶液,不僅為反應體系提供堿性環(huán)境,且與Ag+配位,避免生成AgOH沉淀。

      圖6 納米金比色檢測VC條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of experimental conditions for the colorimetric detection of vitamin C using AuNPs

      2.7 納米金比色檢測VC方法特異性

      為考察納米金比色檢測VC方法的特異性,混合溶液1、混合溶液2代替VC,結果如圖7所示。只有加入VC和混合溶液2時,溶液顏色由淺粉變?yōu)辄S色,且產生明顯A410nm信號,表明該方法具有良好的特異性。

      圖7 納米金比色檢測VC方法特異性Fig.7 Specificity of AuNPs for vitamin C detection

      2.8 納米金比色檢測VC方法分析性能評價

      圖8 加入不同質量濃度VC溶液顏色圖Fig.8 Changes in color and absorbance at 410 nm in the presence of different concentrations of vitamin C

      在最優(yōu)實驗條件下考察方法分析性能,由圖8可知,從左到右VC質量濃度分別為0、0.4、2、4、8、10、20、40、60、80、100 mg/L和120 mg/L。當VC質量濃度2 mg/L時,溶液顏色由淺粉變?yōu)榈S色,隨著VC質量濃度增大,顏色越來越深。通過紫外-可見吸收光譜檢測,以VC質量濃度為橫坐標,A410nm為縱坐標,繪制標準曲線,線性方程為y=0.024 4x+0.098 2,R2=0.994 6,線性范圍為0.4~120 mg/L,檢出限為0.14 mg/L。相對標準偏差為1.4%(n=8,VC質量濃度為2 mg/L)。

      2.9 實際樣品中VC的比色分析

      圖9 納米金比色檢測實際樣品中VC含量Fig.9 Color changes observed for real samples with different concentrations of vitamin C

      表1 實際樣品中VC的檢測(n= 3)Table 1 Summary of results obtained from determination of vitamin C in real samples (n= 3)

      為了考察本方法的應用性,測定VC藥片和市售飲料中VC的含量。如圖9所示,隨著VC質量濃度的增加,體系顏色越來越深。根據紫外-可見光譜檢測結果,計算加標回收率(表1)在92.2%~115.0%之間。對于牛奶等復雜基質樣品中VC的檢測,復雜基質破壞金納米粒子的穩(wěn)定性而限制本方法的應用,因此本方法的應用性還需進一步研究與改進。本方法可用于簡單基質樣品中VC的分析,特別是裸眼觀察體系顏色即可實現VC的快速定性分析。

      3 結 論

      本實驗以綠茶提取液為還原劑和保護劑,與HAuCl4室溫反應10 min,成功制備金納米粒子,方法簡單快速,成本低廉,綠色環(huán)保。且與傳統(tǒng)方法制備的金納米粒子(檸檬酸鈉為還原劑)相比較,本方法制得的金納米粒子具有更好的穩(wěn)定性。以綠茶提取液制備的金納米粒子為晶種和催化劑,用于VC的比色分析,在最優(yōu)條件下,VC質量濃度在2 mg/L以上,裸眼觀察溶液顏色實現VC定性及半定量分析;紫外-可見分光光度計測量實現VC定量分析,檢出限為0.14 mg/L。并將建立的方法用于VC藥片和市售飲料中VC的分析,加標回收率令人滿意。該研究以綠茶提取液為原料制備金納米粒子,制備的金納米粒子可用于實際分析,具有應用價值,同時也可為其他新型納米材料的綠色制備技術提供基礎資料。

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