超聲對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-異亮氨酸的影響

熊海波，劉云鵬，徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津， 300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津， 300457)3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津， 300457)

L-異亮氨酸作為哺乳動物8種必需氨基酸之一，是合成人體激素及酶類的原料，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制其分解[1]。近年來,隨著L-異亮氨酸在醫(yī)藥保健、食品加工和飼料工業(yè)中的應(yīng)用研究不斷深入,市場對L-異亮氨酸的需求在不斷生長。L-異亮氨酸雖已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),但目前產(chǎn)量仍不能滿足需要，目前我國L-異亮氨酸的需求缺口較大,并且年需求量逐年增加[2]。

一般認(rèn)為微生物在生長旺盛期，正常代謝不會出現(xiàn)在培養(yǎng)液中大量分泌特定的中間代謝物的現(xiàn)象，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)為了積累特定的氨基酸，必須使用某些方法使其代謝或結(jié)構(gòu)異?；痆3-5]。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵在不同的階段細(xì)胞形態(tài)會產(chǎn)生不同的變化，增殖培養(yǎng)時期菌株以生長分裂、倍速擴(kuò)增菌體生物量為目的，而在生產(chǎn)目的產(chǎn)物異亮氨酸時，需要實現(xiàn)菌體形態(tài)的“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”，限制細(xì)胞膜的合成，菌體伸長、膨脹，形成生產(chǎn)型細(xì)胞，開始積累L-異亮氨酸[6-7]。而這種“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”，需要通過各種物理、化學(xué)或生物手段對細(xì)胞膜的合成或細(xì)胞膜本身進(jìn)行干擾或破壞[8]。這些方法包括發(fā)酵液中添加表面活性劑、CaCl2、限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量、減少葡萄糖供應(yīng)使菌體處于亞生長狀態(tài)等[9]。

研究表明超聲對發(fā)酵液產(chǎn)生的微擾動可以加速細(xì)胞間的物質(zhì)交換，加強(qiáng)發(fā)酵液中的CO2和O2的交換速率，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而超聲產(chǎn)生的切向力可在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和產(chǎn)酸能力[14]。研究通過在發(fā)酵罐內(nèi)添加超聲裝置，在發(fā)酵的某些時期對發(fā)酵液進(jìn)行在線超聲，通過增強(qiáng)發(fā)酵液的流動性及增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，解決谷氨酸棒桿菌發(fā)酵適應(yīng)期較長，菌體產(chǎn)酸轉(zhuǎn)型慢、轉(zhuǎn)型不徹底的問題[10-13]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌YILM1504，由天津科技大學(xué)代謝工程實驗室保存。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨12 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO41.6 g/L，VB10.3 mg/L，豆餅水解液15 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，玉米漿干粉30 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L 自動控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies；KQ-C 高壓蒸汽發(fā)生器，上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；752 分光光度計，上海分析儀器廠；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本 OLYMPUS 會社。

1.4 培養(yǎng)方法

種子罐培養(yǎng)條件：接種量2支茄形瓶(250 mL)，發(fā)酵體積2 L，培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，種子培養(yǎng)12～15 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：接種量600 mL，發(fā)酵體積3 L, 培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動，發(fā)酵時間36～40 h。

1.5 實驗方法

通過單因素試驗對超聲條件的確定，如表1所示，選取超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時間、超聲模式進(jìn)行5因素4水平的L16(54)正交試驗，對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。采用綜合平衡分析法確定超聲的最佳組合條件[15]。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal experimental factors

1.6 檢測方法

1.6.1 細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)Ca2+濃度

Ca2+濃度檢測參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.6.2L-蘇氨酸脫氨基酶活性檢測

在發(fā)酵罐中取適量的菌液，4 ℃ 8 000 r/min離心收集菌體，用50 mmol/L Tris-HCl清洗菌體2次，并重懸菌體。然后將懸浮菌體，經(jīng)過超聲破碎(開2 s停3 s、4 ℃、400 W、10 min)，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。蛋白濃度通過BCA Protein Assay Kit測定。酶活性重復(fù)3次測定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活性通過檢測ɑ-酮丁酸的生成來確定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活定義為每分鐘生成1 μmol ɑ-酮丁酸所需要的酶活為1 U[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對菌體生物量的影響

2.1.1 超聲對菌體不同生長階段的影響

L-異亮氨酸發(fā)酵是一個連續(xù)動態(tài)過程，在不同的生長階段菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝途徑不同，超聲所起的作用不同。實驗將菌體發(fā)酵分為適應(yīng)期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期、衰亡期4個階段，實驗設(shè)計在不同階段超聲，探究不同階段超聲對菌體的影響。

如圖1所示，對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵不同生長階段1 h連續(xù)超聲，在適應(yīng)期、對數(shù)期和平穩(wěn)期生物量分別增加了15.6%、63.2%、23.6%，這可能是在適應(yīng)期及對數(shù)生長期，超聲對菌體損傷較小，超聲加劇了培養(yǎng)基的擾動，加速了罐內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的微擾動，提高了細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換的傳輸速率；而在平穩(wěn)期，超聲所起到的微擾動能力，解決了副產(chǎn)物堆積、營養(yǎng)供應(yīng)不足等問題，增加了菌體活力[18]。但同時，超聲對衰亡期菌體生長產(chǎn)生負(fù)面效果，菌體生物量下降了35.8%，這是因為在菌體衰亡期，超聲剪切作用力加速了菌體破碎死亡。因此可在適應(yīng)期、對數(shù)生長期和平穩(wěn)期超聲發(fā)酵，提高菌體總體基數(shù)，為產(chǎn)酸總量的提高提供生物量基礎(chǔ)。

圖1 超聲對菌體不同生長階段的影響Fig.1 Influence of ultrasound on different growth stages of bacteria

2.1.2 超聲功率對菌體生物量的影響

實驗設(shè)計在對數(shù)生長期，分別用60、80、100、120 W/L不同的超聲功率，探究超聲功率對菌體生物量的影響。

如圖2所示，超聲功率<100 W/L時，對菌體的增長均有效果，在功率達(dá)到80 W/L時效果最好；但功率超過120 W/L時，對菌體生長產(chǎn)生抑制作用。超聲刺激菌體生長不一定與功率成正比，有時小功率也會產(chǎn)生增殖效果，但功率過小就會失去微擾動及菌體刺激作用；而功率大到一定的數(shù)值，雖然擾動及剪切效果增強(qiáng)，但空化強(qiáng)度大大增加，干擾菌體正常的生長分裂，使菌體細(xì)胞膜內(nèi)外環(huán)境失衡，正常的菌體形態(tài)發(fā)生形變，破碎死亡，降低菌體活力[19]。

圖2 超聲功率對菌體生物量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the biomass of bacteria

2.1.3 超聲頻率對菌體生物量的影響

實驗設(shè)計在對數(shù)生長期，分別用10、18、26、34、42 kHz超聲頻率，探究超聲頻率對谷氨酸棒桿菌生物量的影響。

由圖3可知，不同的超聲頻率對菌體生物量的影響較大，在超聲頻率為18 kHz時，菌體生物量下降了13.6%，但當(dāng)超聲頻率為26 kHz時，菌體生物量增加了42.4%，隨后將超聲頻率增加到42 kHz時，菌體生物量劇烈下降了45.3%。菌體的增長量隨超聲頻率的梯度增加呈現(xiàn)極陡的波浪狀，生物量急速升降。這種現(xiàn)象可能類似于電磁波的窗效應(yīng)，指在某一頻段內(nèi)，只有某些個離散的、頻率區(qū)間極窄的電磁波才能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，而不同于圖2所示80 W/L是該菌功率窗，該菌的生物學(xué)效應(yīng)在26 kHz還存在1個頻率窗[20]。

圖3 超聲頻率對菌體生物量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the biomass of bacteria

2.1.4 超聲時間對菌體生物量的影響

在對數(shù)生長期分別超聲0、2、4、6、8、10 h后，檢測發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量，探究超聲時間對菌體生物量的影響。

從圖4可知，0～8 h隨著超聲時間的增加，菌體生物量逐漸增加，在超聲6 h后，菌體增加量達(dá)到最大，隨后對菌體生長產(chǎn)生抑制作用，在超聲10 h后菌體量比對照組降低了21.2%。對數(shù)生長期菌體增殖速度快，低頻率低能量的超聲對菌體的損傷較小，同時短時間的空化作用，形成的流體微擾動，可以增加細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換速率，有利于菌體的生長；但超聲時間過長使得空化事件增多，對細(xì)胞膜通透性影響增大，損壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而引起細(xì)胞崩解[21]。

圖4 超聲時間對菌體生物量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the biomass of bacteria

2.1.5 超聲模式對菌體生物量的影響

設(shè)計在對數(shù)生長期使用不同的處理模式，分別為先開10 s，再停10、20、30、40、50 s，循環(huán)往復(fù)，持續(xù)6 h，探究間隔時間對菌體生物量的影響。

由圖5可知，谷氨酸棒桿菌對低頻率低能量的超聲耐受能力很強(qiáng)，在不同的處理模式下菌體生物量都有明顯的增長，但在處理模式開10 s停30 s模式下，效果最好，菌體生物量增加了46%。這可能是因為對數(shù)期菌體生長旺盛，超聲處理的影響較小，且超聲波可以將微生物在培養(yǎng)過程中形成的細(xì)胞束松散開來，提高了菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進(jìn)了菌體的生長繁殖，提高了微生物的生物量。

圖5 超聲模式對菌體生物量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic pattern on the biomass of bacteria

2.2 超聲對谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸的影響

在單因素基礎(chǔ)上，設(shè)計L16(54)正交試驗，以L-異亮氨酸生成量為評價標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。

由正交試驗結(jié)果可知，因素1均值2最大，即在對數(shù)生長期超聲細(xì)胞菌體產(chǎn)異亮氨酸最好；因素2均值2最大，即超聲功率為80 W/L產(chǎn)酸效果最好；因素3均值1最大，即超聲頻率為18 kHz產(chǎn)酸效果最好；因素4均值1最大，超聲時間2 h對產(chǎn)酸最有利；因素5均值1最大，說明超聲模式為開10 s停10 s產(chǎn)酸效果最好。對比表2極差數(shù)值發(fā)現(xiàn)，影響L-異亮氨酸產(chǎn)量的主要因素是對菌體超聲階段的選擇，剩下依次的超聲功率、超聲頻率、超聲模式，最后是超聲時間對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

對比生物素與L-異亮氨酸最優(yōu)超聲條件，使用綜合平衡分析法分析得出最終超聲發(fā)酵條件，如表3所示。由表2可知，超聲周期的極差達(dá)到了11.650，說明影響產(chǎn)酸量的最大因素是超聲周期，對比產(chǎn)酸與生物量發(fā)現(xiàn)最優(yōu)超聲條件都是在對數(shù)生長期，同時超聲功率一致在80 W/L產(chǎn)酸量與生物量都達(dá)到最高選擇；在超聲頻率最優(yōu)條件上，生物量與產(chǎn)酸量不同，但18 kHz或26 kHz對L-異亮氨酸產(chǎn)量的均值相差不大，同時考慮到頻率越低，超聲產(chǎn)生的空化泡的數(shù)量越大，空化越強(qiáng)烈，菌體受損越嚴(yán)重，因此選擇26 kHz超聲頻率；在超聲時間和超聲模式上，生物量與產(chǎn)酸量的最優(yōu)條件也相差很大，但對于產(chǎn)酸條件來說，極差分別為1.775和2.075，都是次要因素，為保證生物量，增加具有產(chǎn)酸能力的菌體量基數(shù)，超聲條件趨向于生物量最優(yōu)條件，即超聲時間為6 h，超聲模式為開10 s停30 s。

表3 超聲對生物量與L-異亮氨酸對比結(jié)果Table 3 Comparison results of biomass and L-isoleucine by ultrasound

2.3 超聲對跨膜行為的影響

細(xì)胞在不同生長時期攝取外源Ca2+的能力與胞外Ca2+的跨膜傳導(dǎo)能力有關(guān)。超聲處理對數(shù)生長期細(xì)胞，探究不同超聲時間后，細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)Ca2+濃度變化。

取超聲結(jié)束后對數(shù)生長期的細(xì)胞，F(xiàn)ura-4/AM負(fù)載后，測定胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，用負(fù)載后的溶液在激光波長652 nm處比較熒光強(qiáng)度，胞內(nèi)Ca2+濃度與熒光強(qiáng)度成正比，如圖6所示，隨著超聲時間的增加，胞內(nèi)Ca2+濃度不斷升高，在超聲6 h達(dá)到最高，比未超聲前胞內(nèi)Ca2+濃度增加了75%，細(xì)胞膜與外界物質(zhì)交換頻繁，有利于胞外Fluo-4/AM熒光探針的進(jìn)入；隨后超聲時間的延長熒光強(qiáng)度逐漸減弱，超聲時間過長改變了菌體正常生長環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，與胞外的物質(zhì)和能量交換速率下降，造成Fluo-4/AM熒光探針的負(fù)載量減少，致使熒光強(qiáng)度下降?？偟慕Y(jié)果來看，超聲處理增加了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞膜兩側(cè)的流動性，同時跨膜Ca2+濃度對于刺激膜蛋白活性及維持細(xì)胞膜骨架的穩(wěn)定性非常重要。

圖6 超聲時間對細(xì)胞膜通透性的影響Fig.6 Influence of ultrasound time on membrane permeability

2.4 超聲對酶活的影響

超聲功率是影響L-異亮氨酸產(chǎn)量的第二大因素，探究不同超聲功率下隨著超聲時間的增長L-蘇氨酸脫氨基酶的活性變化如圖7所示。

圖7 超聲時間與功率對酶活的影響Fig.7 Effects of ultrasonic time and power on enzyme activity

由圖7可知，L-蘇氨酸脫氨基酶活性隨超聲時間先增強(qiáng)后減小，大約在超聲4 h前后達(dá)到峰值，且超聲時間4 h，超聲功率為80 W/L時，L-蘇氨酸脫氨基酶活性最強(qiáng)，達(dá)到(0.27±0.02)U/mL；隨著超聲功率的增強(qiáng)，L-蘇氨酸脫氨基酶的活性先上升，隨后在80 W/L達(dá)到頂點后快速下降，酶活分別降至(0.18±0.01)U/mL(100 W/L)、(0.16±0.01)U/mL(20 W/L)。同時，低功率超聲隨著超聲時間的增加下降趨勢最為平穩(wěn)，說明低強(qiáng)度超聲在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，改變了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，但因為其強(qiáng)度不夠，超聲所造成的細(xì)胞表面的傷口較小，細(xì)胞可正常修復(fù)。

2.5 超聲對菌體形態(tài)的影響

發(fā)酵3 h后經(jīng)過26 kHz，80 W/L 超聲處理谷氨酸棒桿菌對數(shù)1 h 后(其余處理條件均相同)，比較超聲處理的谷氨酸棒桿菌和未處理的菌體形態(tài)如圖8所示。谷氨酸棒桿菌的顯著特征是前期菌體擴(kuò)培階段菌體分散，菌體小而近圓型，以分裂擴(kuò)培為主要目的，中期菌體需要轉(zhuǎn)換菌體形態(tài)，轉(zhuǎn)為產(chǎn)酸形態(tài)，菌體粗壯呈橢圓型，菌體多為“八”字形態(tài)。而未進(jìn)行超聲處理的菌體小而圓，以分裂增殖為主，菌液經(jīng)過超聲處理后，菌體數(shù)量明顯增多，且菌體大而粗壯，活力強(qiáng)，利于產(chǎn)酸。超聲加速了菌體的增殖并提前實現(xiàn)菌體“形態(tài)轉(zhuǎn)換”，產(chǎn)酸提前，菌體產(chǎn)酸能力得到加強(qiáng)。

a-未超聲；b-超聲圖8 未超聲與超聲的菌體形態(tài)Fig.8 Morphology of bacteria without ultrasound and ultrasound

2.6 超聲對菌體生物量、產(chǎn)酸能力及葡萄糖消耗的影響

由前期工作可以得出綜合生物量與L-異亮氨酸雙重考慮的超聲標(biāo)準(zhǔn)，為在谷氨酸棒桿菌適應(yīng)期、對數(shù)生長期和平穩(wěn)期，用80 W/L、18 kHz罐內(nèi)分別連續(xù)超聲2、6、1 h，超聲模式設(shè)置為每超聲10 s，停30 s，循環(huán)往復(fù)。由此設(shè)計對比實驗，以未超聲條件發(fā)酵為對照組，最優(yōu)超聲條件發(fā)酵為優(yōu)化組，繪制生物量與L-異亮氨酸生成量過程曲線，探究罐內(nèi)超聲結(jié)果的優(yōu)越性。

由圖9-a對照組生物量曲線可以看出，超聲后發(fā)酵適應(yīng)期幾乎消失，菌體發(fā)酵適應(yīng)階段縮短至2 h以內(nèi)，菌體快速進(jìn)入對數(shù)生長期；同時對數(shù)生長期從2 h延續(xù)到24 h，且24 h菌體生物量達(dá)到了39.4 g/L，比對照組增加了35.7%；幾乎無衰亡期，直至40 h結(jié)束菌體活力依舊很強(qiáng)，最終菌體量達(dá)到了41.0 g/L，比對照組提高了74.5%。由圖9-a優(yōu)化組L-異亮氨酸產(chǎn)量曲線可以看出，超聲優(yōu)化后產(chǎn)酸提前了2 h，并且在對數(shù)生長中后期及平穩(wěn)期，L-異亮氨酸產(chǎn)量增長趨勢明顯，由于谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸為生長偶聯(lián)型，高生物量有利于產(chǎn)酸速率的提升，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到了39.0 g/L，比對照組產(chǎn)酸量提升了69.6%。

由圖9-b可知，超聲后葡萄糖消耗量達(dá)到了482 g/L，比未超聲多消耗了41.97%；但葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率及L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率上升顯著(P<0.05)，在10 h，葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，超聲后葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率比未超聲增加了14.92%，菌體活力旺盛；同時對比葡萄糖對L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率曲線，超聲后葡萄糖轉(zhuǎn)化率在第20 h達(dá)到最大值，延長了2 h，轉(zhuǎn)化率為0.397 g/g，比未超聲增加了13.75%，且超聲20 h后，葡萄糖對L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率曲線下降速率平緩，加強(qiáng)了菌體后期產(chǎn)酸能力。

a-實心代表生物量，空心代表L-異亮氨酸產(chǎn)酸量;b-實心代表葡萄糖消耗量，空心代表葡萄糖對菌體轉(zhuǎn)化率，左空右實代表葡萄糖對L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率圖9 超聲與未超聲對生物量與L-異亮氨酸生成量及對葡萄糖消耗量與轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effects of ultrasound and non-ultrasound on biomass and L-isoleucine production and glucose consumption and conversion

3 結(jié)論

在發(fā)酵過程中用超聲作為物理手段處理發(fā)酵液，對于谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸效果顯著，其超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時間和超聲模式都會對菌體的增殖及產(chǎn)酸能力都有很強(qiáng)的提升能力。谷氨酸棒桿菌超聲發(fā)酵的最優(yōu)條件為：用80 W/L、26 kHz超聲波，在菌體適應(yīng)期、對數(shù)生長期及平穩(wěn)期分別超聲2、6、1 h，超聲模式設(shè)置為開10 s、停30 s。超聲形成的流體微擾動，使發(fā)酵液中分子活性提高，可以增加細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換速率，有利于菌體的生長，結(jié)果顯示，直至40 h結(jié)束菌體活力依舊很強(qiáng)，最終菌體量達(dá)到了41.0 g/L，比未超聲提高了74.5%；超聲形成的機(jī)械切向力，在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，改變了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，解除了胞內(nèi)產(chǎn)物濃度過高而產(chǎn)生終產(chǎn)物抑制，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到了39.0 g/L，比未超聲產(chǎn)酸量提升了69.6%。