水禽源致病性大腸桿菌流行病學調查及耐藥性分析

沈 達，王 健，宋海港，邱 添，徐 強，成大榮*

（1．揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225000；2．江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300）

大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內正常菌群成員之一，在人或動物出生的數(shù)小時后經過口進入消化道后段，繁殖定居且終生伴隨[1]。致病性大腸桿菌僅是大腸桿菌中的一小部分，但大量繁殖會給人類帶來生命威脅和財產損失，尤其對嬰兒和幼畜（禽），常引發(fā)嚴重腹瀉和敗血癥[2]，引起大面積的發(fā)病和死亡。目前主要應用抗生素治療該病，從而導致臨床上的耐藥菌株越來越多，并且會不斷產生許多新的耐藥菌株，進而應用抗生素治療的效果較差[3]。本試驗以水禽源大腸桿菌為研究對象，研究其在江蘇地區(qū)的流行情況及對分離株的藥物敏感情況，為高效快速防治水禽源大腸桿菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2017～2019年共采集江蘇省10個地級市64個水禽養(yǎng)殖場的疑似大腸桿菌性腹瀉510份泄殖腔拭子，樣品來源信息見表1。

表1 樣品來源Tab.1 Sample source

1.1.2 試驗試劑

瓊脂糖購自索萊寶生物有限公司；10×TBE緩沖液購自生工生物工程股份有限公司；DL2000 DAN Marker購自Mix購維諾贊生物公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物公司。

1.1.3 PCR引物

根據陳曉浪等[4]的研究報道，基于對不同毒力基因序列的分析設計引物。PCR引物序列見表2。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。

1.2 試驗方法

1.2.1 參考菌株及待檢樣品基因組的提取

以 F1+大 腸 桿 菌（C1253-77株）、P+大 腸 桿 菌(C1976-79株)、LEE+大腸桿菌（S442712株）、沙門氏菌（ATCC25923株）、HPI+大腸桿菌（S452631株）為參考菌株建立水禽源致病性大腸桿菌PCR檢測方法。以上菌株由揚州大學獸醫(yī)學院微生物教研組保存。

表2 PCR的引物序列Tab.2 PCR primer sequences

運用煮沸法提取細菌的DNA模板：吸取液體培養(yǎng)物600 μL于離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；棄去上清，重新懸浮于800 μL的去離子水中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；再次棄去上清，重新懸浮于300 μL的去離子水中；100 ℃水浴10 min；冰浴1 min；13 000 r/min離心5 min；吸取上清即為制備好的DNA模板，存于4 ℃冰箱備用[5]。

1.2.2 大腸桿菌菌毛基因的檢測

用PCR方法對F1菌毛基因進行擴增。取待檢測DNA為模板，擴增的F1引物為F1-F、F1-R，各引物濃度50 μmol/L。PCR的體系：細菌DNA1 μL、上下游引物0.5 μL、Mix12.5 μL，加入去離子水至整個體系25 μL。PCR 反應程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

用PCR方法對P菌毛基因進行擴增。擴增P菌毛基因引物為Pap-F、Pap-R，引物濃度50 μmol/L，PCR體系同上。PCR反應程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、60 s，每2個循環(huán)降低1 ℃，共8個循環(huán)；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s 共 30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.2.3 LEE毒力島的檢測

用PCR方法對LEE毒力島eaeA基因進行擴增，特異性引物為eae-F、eae-R。PCR反應體系：上、下游引物0.5 μL，Mix12.5 μL，取待檢測DNA模板1 μL，再加入去離子水至整個體系25 μL。按以下反應體系進行PCR擴增。PCR反應程序：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s；58 ℃、30 s；72 ℃、60 s，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存[6]。

1.2.4 HPI毒力島的檢測

用PCR方法對HPI毒力島irp2基因進行擴增，特異性引物為irp2-F，irp2-R，PCR反應體系和程序同1.2.3。

1.2.5 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

取各PCR擴增產物8 μL進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2 000 Marker為參照，觀察擴增基因片段的大小。

1.3 PCR陽性菌純化與純化菌的鑒定

對PCR陽性菌進行麥康凱平板三區(qū)劃線，挑取單菌落進行細菌純化培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)12 h，進行3次純化，得到純化菌再次進行PCR鑒定。

1.4 藥敏試驗

將挑取的陽性菌涂布于MH培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。吸取200 μL菌液涂布于平板上，藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基上，使其附著嚴密。37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑，判斷該菌對測試紙片的敏感度[7]。

2 結果與分析

2.1 致病性大腸桿菌分離鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1～圖4。由圖1～圖4可知，對純化菌進行PCR擴增F1菌毛基因、P菌毛基因、LEE（eaeA）基因與HPI（irp2）基因，均可擴增出目的片段。

2.2 樣品的快速檢測結果

純化菌PCR鑒定后，樣品的快速檢測結果見表3。由表3可知，江蘇省各地區(qū)致病性大腸桿菌陽性率均在65%左右。

表3 樣品的快速檢測結果Tab.3 Quick test results of samples

2.3 樣品的快速藥敏試驗結果（見表4）

各地區(qū)分離株均挑取10株用13種抗生素進行藥敏試驗。由表4可知，致病性大腸桿菌對磷霉素、多黏菌素B比較敏感，敏感比例分別為90%和78%，耐藥最強的是多西環(huán)素，耐藥比例可達90%，其次是新霉素和四環(huán)素，耐藥比例均為70%。

表4 樣品的快速藥敏試驗結果Tab.4 Results of rapid drug sensitivity test of samples

3 討論

水禽養(yǎng)殖過程中，由大腸桿菌引起的繼發(fā)性疾病較多且難控制?？刂拼竽c桿菌在養(yǎng)殖場及水禽體內的繁殖可以解決根本性問題。在飼養(yǎng)過程中應嚴格把控各個環(huán)節(jié)，通過科學用藥最大限度抑制大腸桿菌的繁殖[8]。通過不同株大腸桿菌的藥敏試驗，確定江蘇不同地區(qū)養(yǎng)殖場中常駐大腸桿菌的類型及耐藥情況，可以選擇科學的給藥方案，進而有效控制和治療大腸桿菌病。

當前，敏感藥物的療效雖然較好，但其價格較高，只有環(huán)丙沙星價格相對便宜，長期、超量使用勢必引起細菌的耐藥性。臨床上治療細菌性傳染病時，需要科學用藥、謹慎用藥。在用藥前先做藥敏試驗，根據結果針對性用藥。同時，不應長期使用一種藥物治療，應考慮藥物組合、藥物輪換，尋找抗菌藥物替代品及采用綜合防控措施，力爭少用藥、不用藥。

傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式已不適應新形勢下對疾病防控及動物源農產品質量提升的要求。當養(yǎng)殖場發(fā)生細菌性疾病時，盲目濫用抗生素只會導致病原菌大量出現(xiàn)耐藥性，增加疾病防控的難度。未來，尋找抗生素替代品，實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖，提高農產品質量，保障食品安全將是養(yǎng)殖業(yè)追求的共同目標。

本研究通過對江蘇省內各地區(qū)的水禽進行致病性大腸桿菌毒力因子的檢測，了解水禽源大腸桿菌的流行情況，完善江蘇地區(qū)流行病學數(shù)據。從江蘇水禽中分離大腸桿菌進行13種抗生素藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)江蘇各地區(qū)所分離到的水禽源致病性大腸桿菌中有著不同程度的藥物敏感性，但總體對磷霉素、多黏菌素B比較敏感。本研究為該地區(qū)的大腸桿菌耐藥情況制定合理的防治方案提供參考。藥敏試驗快速篩選敏感藥物及快速有效治療，可以減少抗生素的濫用與耐藥性的產生，節(jié)約養(yǎng)殖成本。

4 結論

研究通過PCR技術快速確診了江蘇部分地區(qū)養(yǎng)殖場中的疑似大腸桿菌病例，對已分離的大腸桿菌進行多種抗生素藥敏試驗，實現(xiàn)對敏感藥物的快速篩選。