siRNA 干擾牦牛Bmal1 基因?qū)︻w粒細(xì)胞激素分泌的影響

趙明旺，張 君，徐尚榮，黃 榮，舒 適，彭 巍，張琳欽

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016）

牦牛是高原地區(qū)的全能家畜[1]。在我國，牦牛的需求量大，市場廣泛，牦牛養(yǎng)殖業(yè)是高原畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)和西北地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的組成部分，但受環(huán)境等因素影響，牦牛的繁殖能力普遍不高。因此，提高牦牛的繁殖力有助于牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

作為生物鐘家族的核心成員之一，Bmal1（Brain and muscle arnt-like 1）主要以異源二聚體的形式在哺乳動(dòng)物生物鐘轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)中起到正調(diào)節(jié)的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因能參與哺乳動(dòng)物生殖生理的調(diào)控[3-4]。有研究表明，敲低顆粒細(xì)胞Bmal1 可顯著降低動(dòng)物COX2 的表達(dá)，從而影響前列腺素的合成[5-6]；Alvarez 等[7]研究發(fā)現(xiàn)敲除Bmal1基因后，雌雄小鼠不僅出現(xiàn)不孕不育現(xiàn)象，而且孕激素合成的重要調(diào)節(jié)蛋白（Star）功能出現(xiàn)降低，導(dǎo)致小鼠類固醇激素合成及分泌減少，影響雌雄鼠的生殖能力。Cyp19a1是雌激素合成的關(guān)鍵基因，參與性激素的合成[8]；Star作為類固醇激素合成的限速酶，主要負(fù)責(zé)編碼的蛋白能夠?qū)⒕€粒體外膜的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜，Star基因是類固醇激素合成的重要基因[9]。關(guān)于Bmal1基因的表達(dá)對(duì)牛繁殖生理的影響鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的牦牛卵巢顆粒細(xì)胞作為研究對(duì)象，用siRNA 干擾Bmal1基因的表達(dá)，探討抑制Bmal1基因表達(dá)是否對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞激素分泌有所影響，以期為闡明Bmal1基因參與牦牛卵泡發(fā)育的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 西寧市裕泰屠宰場母牦牛。

1.1.2 主要試劑 DMEM、10% 胎牛血清購于Gibico公司；TransZol Up Plus RNA Kit 和蛋白提取試劑盒購自北京全式金生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM購自大連寶TaKaRa 生物工程有限公司；siRNA-Mate 轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；ELISA 試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；BMAL1 和GAPDH 抗體購自Abcam 公司；CYP19A1和STAR 抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo 產(chǎn)品；qRTPCR 儀為Applied Biosystems 產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為Biotek 產(chǎn)品；蛋白電泳儀為Bio-rad 產(chǎn)品；多功能化學(xué)發(fā)光儀為Proteinsimple 產(chǎn)品。

1.2 牦牛顆粒細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)

1.2.1 牦牛顆粒細(xì)胞的體外分離 采集健康牦牛的卵巢置于盛有36℃生理鹽水及雙抗的保溫杯中，在2～6 h 內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞間。剪掉卵巢上的結(jié)締組織，將卵巢用生理鹽水清洗3 次。用10 mL 注射器吸取卵泡液于盛有2 mL 5%胎牛血清（FBS）的15 mL 離心管中，常溫離心5 min（1 200 r/min），棄去上清液，PBS 離心清洗5 次。用細(xì)胞篩過濾，得到較為純凈的牦牛顆粒細(xì)胞。

1.2.2 牦牛顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將收集好的牦牛顆粒細(xì)胞按照4×105/mL 接種于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別裝入細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。24 h 后觀察細(xì)胞生長情況，棄掉原培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 遍，再換上新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后，細(xì)胞長滿瓶底時(shí)，將細(xì)胞傳代至6 孔板中，細(xì)胞量為1.5×105個(gè)/孔，然后在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Bmal1 siRNA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)20 h，待細(xì)胞長至30%～50%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。①將200 μL 無血清培養(yǎng)基加入無菌EP 管中，再加入6 μL Bmal1 siRNA 或Bmal1 siRNA NC（Negative Control）；②每管加入10 μL siRNA-Mate，充分混勻，室溫靜置10 min；③給6 孔板每孔換上2 mL 預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基；④將靜置完畢的轉(zhuǎn)染混合物分別加入孔中，然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

siRNA 干擾片段帶有熒光標(biāo)記染色，當(dāng)將其對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染6 h 后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕地使用PBS 吹吸細(xì)胞3 次，然后在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫已知牦牛各基因序列，利用Oligo7.0 軟件分別設(shè)計(jì)Bmal1、激素合成相關(guān)基因Cyp19a1和Star，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Bmal1基因干擾片段由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列如表1。

1.5 總RNA 提取及cDNA 的合成 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍后，用TransZol Up Plus RNA Kit 對(duì)細(xì)胞的總RNA 進(jìn)行提取，經(jīng)測定各組RNA 濃度及純度后，每組按700 ng 的量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行。cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中雌二醇（E2）和孕酮（P4）含量 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h 后，收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)液，參照ELISA 試劑盒說明書分別檢測E2和P4含量。

1.7 qRT-PCR 反應(yīng)按照試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）說明書進(jìn)行，體系為20 μL：Premix 10 μL，Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各0.8 μL、DNA 模板2 μL；退火溫度為59℃。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，共35 個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因GAPDH分管同板以相同條件擴(kuò)增。

1.8 Western blot

1.8.1 總蛋白的提取 在利用si-Bmal1 進(jìn)行干擾處理72 h后，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的顆粒細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化收集后，用PBS 離心清洗（700 r/min），棄掉上清液；向細(xì)胞沉淀加入1 mL TPEB，然后劇烈震蕩15 s，冰上孵育30 min；最后14 000 r/min 離心10 min，小心收集上清液，得到的總蛋白置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.8.2 Western blot 將變性后的蛋白通過SDS-PAGE（8%分離膠）分離；電泳結(jié)束后，利用PVDF 膜將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂牛奶37℃封閉3 h；將按一定的比例稀釋后的一抗：BMAL1（1:2500）；CYP19A1（1:500）；STAR（1:600）；GAPDH（1:3 000），與PVDF 膜4 ℃冰箱過夜孵育；將PVDF 膜取出，TBST 清洗1 h，然后室溫孵育二抗2 h；將PVDF 膜取出，用TBST 在37℃環(huán)境下清洗2 h；配置適量的發(fā)光液，加到PVDF 膜上反應(yīng)2 min 左右，最后曝光儀器上曝光并拍照。每組實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)Ct 值，采用2-△△Ct法，計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)量。Western blot 結(jié)果Alpha View SA軟件進(jìn)行計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。用IBM SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組內(nèi)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)，同組不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示差異性顯著（P＜0.05），**表示差異性極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 siRNA 轉(zhuǎn)染和干擾效率的檢測 轉(zhuǎn)染6 h 后，在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。如圖1 所示，經(jīng)過帶有熒光標(biāo)記的siRNA 轉(zhuǎn)染后，在超過80%的細(xì)胞中都能觀察到綠色的熒光信號(hào)，表明siRNA 的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%以上，合成的干擾片段可用于后期實(shí)驗(yàn)。

圖1 Bmal1 siRNA 轉(zhuǎn)染效果

將牦牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行分組，用si-Bmal1和陰性對(duì)照NC 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后提取細(xì)胞RNA，應(yīng)用qPCR 檢測si-Bmal1干擾效率。如圖2 所示，si-Bmal1mRNA 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比極顯著下調(diào)，干擾效率大于50%，si-Bmal1干擾片段可用于后期實(shí)驗(yàn)。

圖2 Bmal1 siRNA 的干擾效率

2.3 ELISA 檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中E2和P4含量 在使用si-Bmal1對(duì)體外培養(yǎng)的牦牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染72 h后，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的激素濃度。如圖3 所示，在siRNA 干擾Bmal1后，E2（P＜0.05）和P4（P＜0.01）濃度低于對(duì)照組。

圖3 干擾Bmal1 表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞激素分泌的影響

2.4 siRNA 干擾Bmal1對(duì)激素分泌基因表達(dá)的影響在使用si-Bmal1干擾處理72 h 后，用qPCR 檢測對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的顆粒細(xì)胞激素合成相關(guān)基因Cyp19a1和Star的表達(dá)。如圖4 所示，使用siRNA 進(jìn)行干擾后，Cyp19a1和Star的表達(dá)下降；其中，Cyp19a1的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)極顯著。

圖4 干擾Bmal1 對(duì)Cyp19a1 和Star 表達(dá)的影響

2.5 siRNA 干擾Bmal1對(duì)激素分泌相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 用Western blot 檢測BMAL1 蛋白、E2 合成相關(guān)蛋白CYP19A1 以及孕酮合成的相關(guān)基因STAR 的表達(dá)。如圖5 所示，siRNA 片段可以降低BMAL1 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），同時(shí)CYP19A1 蛋白表達(dá)也在抑制Bmal1后降低（P＜0.05），STAR 的降低趨勢不顯著。

圖5 干擾Bmal1 對(duì)BMAL1、CYP19A1 和STAR 表達(dá)的影響

3 討 論

作為卵泡重要細(xì)胞之一，顆粒細(xì)胞在多種激素和信號(hào)分子的作用之下增殖和分化，進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育和成熟[10]。在哺乳動(dòng)物卵巢中，顆粒細(xì)胞分泌的E2和P4可以促進(jìn)卵泡的發(fā)育、成熟和排卵，對(duì)卵巢生長有著重要意義[11-12]。此外，顆粒細(xì)胞在發(fā)育過程中通過多條信號(hào)通路（如mTOR 信號(hào)通路和cAMP 信號(hào)通路等）與卵母細(xì)胞之間相互作用，而且這些信號(hào)通路之間同樣存在相互影響的關(guān)系，最終決定卵泡的成熟或閉鎖[13-14]。趙明旺等[15]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛顆粒細(xì)胞中存在Bmal1基因的表達(dá)。因此，本研究以體外牦牛卵巢顆粒細(xì)胞作為研究對(duì)象，應(yīng)用siRNA 干擾顆粒細(xì)胞細(xì)胞Bmal1基因的表達(dá)，探究Bmal1基因?qū)﹃笈Ｂ雅莅l(fā)育功能的影響。

生物鐘基因參與調(diào)控雌性動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸（HPG），從而影響雌性動(dòng)物的生殖代謝活動(dòng)[16-17]。Chu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因的晝夜節(jié)律性表達(dá)對(duì)大鼠顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的生長有影響，敲低Bmal1基因的表達(dá)不僅破壞了其表達(dá)的節(jié)律性，而且顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的凋亡水平顯著增加。在激素分泌及合成方面，動(dòng)物卵巢激素受體以及合成基因的編碼區(qū)上游被證實(shí)存在著生物鐘調(diào)控元件E-box、RORE 和 D-box 的序列，表明卵巢關(guān)鍵功能基因啟動(dòng)子區(qū)域中的這些調(diào)控元件可能在生物鐘系統(tǒng)的作用下發(fā)揮調(diào)控激素分泌的作用[19]。Zhang 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，人類卵巢顆粒細(xì)胞中的Bmal1和Sirt1基因敲除后，顆粒細(xì)胞的雌激素分泌下降，并且雌激素合成相關(guān)芳香化酶的表達(dá)也減弱，而細(xì)胞中Bmal1和Sirt1基因過表達(dá)處理后則相反；該研究表明Bmal1基因參與卵巢顆粒細(xì)胞雌激素的分泌。也有研究指出，Bmal1基因的缺失或突變能夠下調(diào)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量，抑制卵巢顆粒細(xì)胞孕酮的分泌[6,21-22]。Chu等[23]敲除小鼠顆粒細(xì)胞中的Bmal1基因，導(dǎo)致Lepr、Cyp19a1和Cyp11a1的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，而且E2分泌量下降。Wang 等[22]研究指出生物鐘基因的缺失能影響Star基因的表達(dá)，使得P4的合成受到影響。本研究應(yīng)用ELISA 檢測得出干擾Bmal1基因的表達(dá)后顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中E2和P4的分泌量下降，并且最后通過mRNA 和蛋白水平檢測了激素分泌相關(guān)基因的表達(dá)在干擾Bmal1基因的表達(dá)后都降低，這說明Bmal1基因參與牦牛卵巢激素合成的調(diào)節(jié)。在對(duì)激素合成蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾Bmal1基因表達(dá)后，Cyp19a1 蛋白的表達(dá)并沒有像其mRNA 一樣被顯著性下調(diào)；而Star 蛋白下調(diào)不顯著，推測下調(diào)Bmal1基因后對(duì)Cyp19a1和Star基因翻譯成相應(yīng)蛋白的過程干擾程度減弱，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。本研究結(jié)果表明，Bmal1基因參與調(diào)控牦牛卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素和P4。這為進(jìn)一步研究Bmal1基因在牦牛顆粒細(xì)胞的生長作用的調(diào)節(jié)提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低Bmal1基因能通過調(diào)控相關(guān)的基因?qū)е麦w外培養(yǎng)牦牛顆粒細(xì)胞激素的分泌受到抑制，說明Bmal1基因在牦牛顆粒細(xì)胞凋亡和激素分泌的調(diào)控中起著重要作用。