不同運(yùn)動方式和運(yùn)動時間對小鼠睪酮分泌和精子生成的影響

張 姹 ，魏易焓，盧靜怡，王蕾蕾，常成杰，徐 暢，袁業(yè)現(xiàn)，尹 聰，束 剛*，江青艷

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東廣州 510642）

雄性動物的精子數(shù)量和活力是保證雌性動物受胎率、產(chǎn)仔數(shù)和子代健康的重要前提[1]。在雄性生殖系統(tǒng)中，睪丸和附睪是重要的性腺器官[2]。睪丸主要由睪丸曲細(xì)精管和管外組織組成，曲細(xì)精管是精子生成的場所[3]。睪丸生成的精細(xì)胞不具備運(yùn)動與受精的能力，需要在附睪中完成精子成熟相應(yīng)的形態(tài)變化和功能變化[4]。雄激素是維持性腺功能必不可少的激素[5]。

除性腺激素外，雄性動物生殖能力還受到營養(yǎng)、應(yīng)激和運(yùn)動等多種因素影響[6]。其中，運(yùn)動是改善動物生殖機(jī)能的有效方式之一。在畜牧生產(chǎn)中，通常需要給種公豬配備運(yùn)動場，滿足運(yùn)動的需求，以保證精液品質(zhì)[7-8]。目前研究運(yùn)動對生殖能力影響的研究模型多為肥胖且生殖能力受損的小鼠[9]。有研究表明，高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠長期負(fù)重游泳訓(xùn)練可顯著增加大鼠的精子總數(shù)、增加精子活動率[10]。相反，間接性耐力會顯著增加肥胖大鼠的精子畸形率，降低精子總量[11]?？梢姴煌倪\(yùn)動方式和運(yùn)動強(qiáng)度對小鼠生殖機(jī)能的影響不一，但目前鮮有關(guān)于運(yùn)動對健康青年小鼠生殖能力影響的報道。因此，本實驗主要研究力竭運(yùn)動（Exhaustive Exercise，EE）、短期有氧運(yùn)動（Acute Aerobic Exercise，AAE）和長期有氧運(yùn)動（Chronic Aerobic Exercise，CAE）對健康青年雄性小鼠睪酮分泌和生殖的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 不同運(yùn)動模型小鼠的構(gòu)建 實驗所用雄性的C57BL/6J 小鼠均購自廣東省實驗動物中心（廣東佛山）。32 只11 周齡雄性小鼠按體重隨機(jī)分成4 組（n=8），分別是對照組（CON 組）、力竭運(yùn)動組（EE 組）、短期有氧運(yùn)動組（AAE 組）和長期有氧運(yùn)動組（CAE 組）。EE組訓(xùn)練方法：在跑步機(jī)上以10 m/min 的速度跑10 min后休息10 min，休息結(jié)束以10 m/min 的速度每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 持續(xù)訓(xùn)練3 h，訓(xùn)練結(jié)束后迅速采樣。AAE 組訓(xùn)練方法：在跑步機(jī)上以10 m/min 的速度跑10 min 后休息10 min，休息結(jié)束在10 m/min 的速度基礎(chǔ)上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持續(xù)訓(xùn)練1 h，訓(xùn)練結(jié)束后迅速采樣。CAE 組訓(xùn)練方法：在跑步機(jī)上以10 m/min的速度跑10 min 后休息10 min，休息結(jié)束后在10 m/min的速度基礎(chǔ)上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持續(xù)訓(xùn)練1 h，每天按照上述方式重復(fù)訓(xùn)練，每訓(xùn)練5 d 休息2 d，訓(xùn)練2 周后停止訓(xùn)練，最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h 內(nèi)采樣[12]。

1.2 性腺樣本的采集、HE 染色及統(tǒng)計方法 實驗結(jié)束后小鼠脫頸法處死，腹部涂抹75% 酒精，開腹后迅速采集一側(cè)完整睪丸和附睪置于4%的多聚甲醛中固定過夜，然后經(jīng)過乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。HE 染色過程：經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇溶液脫水，蘇木精伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

使用ImageJ 1.8.0 統(tǒng)計睪丸曲細(xì)精管空腔絕對面積。附睪尾每個樣品隨機(jī)選取10 個視野，統(tǒng)計該視野不規(guī)則附睪管的比率，最后求均值。小鼠處死后迅速分離附睪，轉(zhuǎn)移至1 mL、37℃生理鹽水中，剪刀剪碎附睪，37℃孵育10 min 后，移液槍輕輕吹勻精子懸浮液后，用血球計數(shù)板測定精子數(shù)量；將懸浮液均勻抹于玻片上風(fēng)干，甲醇固定5 min，伊紅染色1 h，蒸餾水浸洗。風(fēng)干后在400 倍光學(xué)顯微鏡模式下觀察2000 個精子細(xì)胞的形態(tài)，統(tǒng)計精子畸形率。

1.3 血清樣品檢測 采集小鼠全血，4℃、3000 r/min離心25 min，吸取上層血清-20℃保存?zhèn)溆?。血清睪酮水平的檢測：采用Testosterone assey kit（USA，R&D system）檢測。

1.4 睪丸樣本的采集及熒光定量PCR 檢測 小鼠處死后分別取出取完整睪丸置于液氮中速凍，然后將樣品轉(zhuǎn)移至冰箱中-80℃保存。提取睪丸組織總RNA，利用試劑 TRIzol，常規(guī)方法抽提，熒光定量PCR 檢測睪丸中睪酮合成代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因包括類固醇急性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，STAR）、3β-羥基類固醇脫氫酶異構(gòu)酶2（Hydroxy-Delta-5-Steroid Dehydrogenase,3 Beta-And Steroid，3β-HSD）、17β羥類固醇脫氫酶（Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase，17β-HSD）、類固醇5α-還原酶1（Steroid 5 Alpha-Reductase 1，SRD5A1）、類固醇5α-還原酶2（Steroid 5 Alpha-Reductase 2，SRD5A2）和細(xì)胞色素P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450scc，P450scc）。以β-actin作為內(nèi)參，對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。基于各目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近，根據(jù)公式計算目的基因相對于內(nèi)參基因的比值來反映各基因的相對表達(dá)豐度：2-△△Ct=2-（Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因），其中Ct目的基因為目的基因的Ct 值，Ct內(nèi)參基因為內(nèi)參基因的Ct 值。

表1 熒光定量PCR 所用引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠性腺重量及血清睪酮水平對比不同運(yùn)動方式的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EE 可顯著增加小鼠睪丸組織重量，AAE 和CAE 對小鼠睪丸和附睪的組織重量均無顯著影響（圖1-A），組織重量按照小鼠體重校正。與對照組相比，EE 可顯著降低小鼠血清睪酮水平，AAE 對小鼠血清睪酮無顯著影響，而CAE 可顯著上調(diào)小鼠血清睪酮（圖1-B）?？梢姴煌\(yùn)動方式可能通過影響睪酮分泌水平，調(diào)節(jié)雄性生殖能力。

2.2 不同運(yùn)動方式對血清睪酮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 圖2 表明，EE 可降低STAR mRNA 的表達(dá)，AAE 對STAR 表達(dá)無顯著影響，而CAE 可上調(diào)STAR表達(dá)（P＜0.05）。不同運(yùn)動訓(xùn)練對睪丸3β-HSD、17β-HSD、SRD5A1、SRD5A2 的mRNA 表達(dá)均無顯著影響。由此提示，不同運(yùn)動方式可能通過調(diào)控睪丸STAR mRNA 表達(dá)，從而影響血清睪酮水平。

圖1 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠性腺重量和血清睪酮的影響（n=8）

圖2 不同運(yùn)動方式對小鼠血清睪酮及睪丸睪酮合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響（n=8）

2.3 不同運(yùn)動方式對睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)的影響 如圖3所示，對照組、AAE 組和CAE 組睪丸組織曲細(xì)精管排列緊密，睪丸間質(zhì)無滲出；但EE 組曲細(xì)精管排列不緊密，間質(zhì)可見細(xì)胞滲出；而CAE 組曲細(xì)精管空腔面積顯著低于其他3 組，說明精子生成較多。

2.4 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠附睪發(fā)育的影響 如圖4所示，EE 組小鼠附睪管排列不緊密，附睪管形狀不規(guī)則，間質(zhì)可見滲出的精子。AAE 和CAE 組小鼠附睪管排列緊密，附睪管形狀規(guī)則，與對照組無明顯差異。提示EE 可損害附睪管管壁結(jié)構(gòu)。

圖3 不同運(yùn)動方式對小鼠睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)的影響（n=8）

2.5 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠精子品質(zhì)的影響 進(jìn)一步通過小鼠精子涂片HE 染色，發(fā)現(xiàn)EE 組精子總數(shù)雖無變化，但其畸形率顯著升高；相反，CAE 可顯著增加精子總數(shù)，顯著降低精子畸形率（圖5）。AAE 對小鼠精子總數(shù)和精子畸形率均無顯著影響。

圖4 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠附睪發(fā)育的影響（n=8）

圖5 不同運(yùn)動方式對雄性小鼠精子品質(zhì)的影響（n=8）

3 討 論

運(yùn)動可以調(diào)節(jié)雄性動物生殖能力，也可以調(diào)控雄性動物血清睪酮水平。有研究表明，運(yùn)動可顯著增加公豬性腺器官指數(shù)，顯著提高每次射精的精子總數(shù)[13]。長期中等強(qiáng)度游泳可有效激活肥胖小鼠瘦素信號通路，增加其血清睪酮水平，但長期高強(qiáng)度游泳反而抑制該信號通路，降低血清睪酮水平，降低精子質(zhì)量[14]。這些研究中運(yùn)動對于雄性動物生殖或睪酮水平的影響并不一致，原因可能與運(yùn)動的時間和強(qiáng)度有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，僅一次性力竭運(yùn)動可顯著降低小鼠血清睪酮水平，損傷精子品質(zhì)，而CAE 則可顯著提高小鼠血清睪酮水平，提高精子品質(zhì)。目前對于高強(qiáng)度運(yùn)動損傷雄性生殖系統(tǒng)的機(jī)制還不是非常清楚，推測可能與應(yīng)激激素、代謝物和局部炎癥水平有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度運(yùn)動可以增加肥胖小鼠的皮質(zhì)酮和乳酸的產(chǎn)生，從而降低睪酮的分泌，而中低強(qiáng)度的運(yùn)動會抑制NF-κB 信號通路的激活，減少TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)，改善精子質(zhì)量，提高雄性生殖能力[15]。上述結(jié)果說明，長期有氧運(yùn)動對雄性動物生殖機(jī)能最為有利。所以在畜牧生產(chǎn)中可考慮采用長期有氧運(yùn)動來改善種公豬繁殖性能。

雄性動物精子發(fā)育、成熟和品質(zhì)不僅受到性腺局部組織的微環(huán)境，如睪丸組織局部炎癥、附睪液pH 等影響，也受性激素、甲狀腺素等內(nèi)分泌激素影響[16]。其中，下丘腦-垂體-性腺軸對于精子發(fā)生和精子成熟過程是不可或缺的。摘除成年雄性大鼠垂體，大鼠精子發(fā)生過程受損，如補(bǔ)充睪酮可重新啟動精子發(fā)生過程，而且促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）、促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）以及睪酮的協(xié)同作用對維持正常生精和生精再激活必不可少[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的運(yùn)動方式和運(yùn)動時間對于小鼠睪酮水平有不同的影響。其中，EE 可顯著降低血清睪酮水平，而CAE 可顯著提高小鼠睪酮水平。睪酮水平受多種代謝酶影響，睪酮的生成涉及多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶促反應(yīng)，其中STAR和P450scc分別是睪酮合成過程中重要的運(yùn)載體和主要的限速酶[16]。STAR轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇至線粒體內(nèi)膜，在線粒體內(nèi)膜上的P450scc催化膽固醇裂解成為孕烯醇酮，后者由3β-HSD轉(zhuǎn)運(yùn)至滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)17β-HSD催化生成睪酮[18]。有研究報道，6 周間歇性游泳訓(xùn)練可顯著降低大鼠睪丸STAR的mRNA 水平[19]。本研究檢測不同運(yùn)動后小鼠睪丸睪酮合成代謝轉(zhuǎn)運(yùn)酶相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，EE 可顯著抑制睪丸STARmRNA 表達(dá)，抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，而CAE 可顯著上調(diào)睪丸STARmRNA 表達(dá)，增加膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。由此可以推測，STAR可能是運(yùn)動調(diào)節(jié)睪酮合成的關(guān)鍵靶點，而運(yùn)動對睪酮合成代謝酶酶活是否有影響還需進(jìn)一步研究。

睪丸生成的精子需要在附睪中完成精子成熟相應(yīng)的形態(tài)變化和功能變化，包括原生質(zhì)滴移位、頂體形狀和大小的變化、精子頭尾結(jié)構(gòu)的固定等[19]。由此可知，附睪組織受損可導(dǎo)致精子畸形率的異常增加[20]。目前尚無運(yùn)動如何直接通過調(diào)控附睪功能，從而影響精子成熟的研究報道。有研究表明，6 周有氧運(yùn)動可增加高糖誘導(dǎo)肥胖小鼠附睪脫氫表雄酮的水平，同時改善大鼠的生殖功能[21]。脫氫表雄酮是作為睪酮來源的前體物質(zhì)，但尚不清楚脫氫表雄酮是否介導(dǎo)了運(yùn)動對附睪功能的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，EE 嚴(yán)重?fù)p害小鼠附睪管管壁形態(tài)，精子滲出至間質(zhì)，降低睪酮水平，導(dǎo)致精子畸形率顯著增加；而CAE 組雖對附睪形態(tài)無明顯影響，但可以顯著升高睪酮水平，同時降低了精子的畸形率。不同運(yùn)動方式和運(yùn)動時間通過何種機(jī)制影響附睪功能和精子成熟還有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本實驗發(fā)現(xiàn)，長期有氧運(yùn)動可顯著促進(jìn)睪酮分泌和精子生成，同時降低精子畸形率，但急性力竭運(yùn)動正好相反。短期有氧運(yùn)動對雄性生殖無顯著影響。