基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析藜蘆中化學(xué)成分*

賈曉華 ，王維 ，高夢(mèng)園 ，歐陽(yáng)慧子 ，何俊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

藜蘆為百合科植物黑藜蘆（Veratrum nigrum L.）的干燥根及根莖[1]，味苦且辛，性平，有毒，具有催吐、瀉下、祛痰、殺蟲(chóng)等功效，主產(chǎn)于中國(guó)貴州、河南、河北、山東、山西、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古自治區(qū)、湖北、四川和東北等地[2-3]。

藜蘆中化學(xué)成分復(fù)雜，包括生物堿類、黃酮類、二萜類、茋類等[4]，其中藜蘆甾體生物堿在藜蘆中數(shù)量最多，含量最高，為主要成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，藜蘆生物堿既是其有毒成分也是有效成分，它可造成小鼠腦部脫氧核糖核酸（DNA）損傷[5]，引起急性毒性并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]，但也具有降低血壓、強(qiáng)心、抗真菌、抗血栓、抗氧化等藥理作用[7]。鑒于其良好的藥理作用，藜蘆在食品添加劑、保健品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用也越發(fā)廣泛[8]。目前對(duì)藜蘆的研究主要集中在化學(xué)成分分離和藥理作用等方面[8]，對(duì)藜蘆藥材中化學(xué)成分分析研究較少[9]。

超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）具有高靈敏度、高選擇性、高精密度、高信息采集速度等特點(diǎn)，已成為研究中藥復(fù)雜化學(xué)成分及其定性分析的重要工具[10]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)藜蘆中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，通過(guò)與Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)及對(duì)照品比對(duì)，結(jié)合化合物準(zhǔn)分子離子、碎片離子峰信息及相關(guān)文獻(xiàn)，共初步鑒定出47個(gè)化學(xué)成分，為研究藜蘆的有效成分及完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），AgilentQ-TOF 6520質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司），Agilent MassHunter分析軟件（美國(guó)Agilent公司），Milli-Q IQ 7005超純水制備儀（Millipore公司），5424R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），AS 60/220.R2型十萬(wàn)分之一天平（波蘭RADWAG公司），G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥 對(duì)照品：環(huán)巴胺（批號(hào)：DST190314-087）、芥芬胺（批號(hào)：DST190407-087）、藜蘆胺（批號(hào)：DST190108-024）、槲皮素（批號(hào)：DST180521-028）、白藜蘆醇（批號(hào)：DST190311-045）、藜蘆定（批號(hào)：2-ALI-112-1）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，藜蘆托素（批號(hào)：CHB-L-153）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸（色譜純）購(gòu)自美國(guó)ROE公司，乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）均購(gòu)自Merck公司（美國(guó)）。藜蘆藥材，購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為百合科植物黑藜蘆（Veratrum nigrum L.）的干燥根。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：CORTECS UPLC C18柱（2.1mm×100mm，1.6μm）；流動(dòng)相：A相0.1%甲酸水，B相乙腈；梯度洗脫，洗脫梯度為：0～16min，5%～26%B；16～19 min，26%～27%B；19～33 min，27%～42.5%B；33～37 min，42.5%～60%B；37～40 min，60%～70%B；40～42 min，70%～85%B；42～45 min，85%～95%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：3 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管溫度350°C；霧化器壓力40 psi；碰撞能量30 V；干燥氣流速11 L/min；碎裂電壓135 V。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品藜蘆托素、芥芬胺、環(huán)巴胺、藜蘆胺、槲皮素、白藜蘆醇、藜蘆定各1 mg加甲醇定容至10 mL，配制成100 μg/mL的對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液均置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 供試品溶液的制備 將藜蘆粉碎過(guò)2號(hào)篩，稱取10 g藜蘆粗粉，加入150 mL 70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，合并濾液，放置室溫，補(bǔ)足失重量。取上清液用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾即得，將儲(chǔ)備液放在4°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3 結(jié)果與分析

將藜蘆供試品溶液和混合對(duì)照品溶液按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行UPLC-QTOF-MS/MS分析，分別采集正、負(fù)離子模式下的基峰離子流色譜（BPC）圖，見(jiàn)圖1。用Agilent Masshunter Qualitative Analysis分析軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下采集的藜蘆提取物BPC圖進(jìn)行提取，根據(jù)分子離子碎片，確定化合物的分子量和分子式，并對(duì)比對(duì)照品、文獻(xiàn)及Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。見(jiàn)表1。

表1 藜蘆中化學(xué)成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別分析

圖1 藜蘆提取物中正、負(fù)離子模式下BPC圖

3.1 生物堿類化合物 西藜蘆堿型甾體生物堿是藜蘆中數(shù)量最多、含量最高的一類甾體生物堿[4]。該類化合物在電噴霧離子阱質(zhì)譜（ESI-MS）正模式下顯示明顯的[M+H]+峰，且均出現(xiàn)脫去中性分子氧化氫（H2O）、藜蘆酸（C9H10O4）等的碎片離子信號(hào)。以化合物20、36、43說(shuō)明鑒定過(guò)程。

化合物 20[保留時(shí)間（tR）=11.97 min]在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 636.346 5[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰有m/z 618.327 3[M+H-H2O]+、m/z 558.306 3[M+H-H2O-C2H4O2]+、m/z 438.257 3[M+H-2H2O-C2H4O2-C5H10O2]+，可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律與計(jì)莫亭堿參考文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]，故推測(cè)化合物20為計(jì)莫亭堿。計(jì)莫亭堿的裂解途徑見(jiàn)圖2。

圖2 計(jì)莫亭堿裂解途徑

化合物36（tR=18.055 min）在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 658.367 6[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰有m/z 640.348 4[M+H-H2O]+、m/z 622.337 2[M+H-2H2O]+、m/z 422.270 7[M+H-3H2O-C9H10O4]+、m/z 458.289 8[M+H-H2O-C9H10O4]+，可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律與藜蘆酰棋盤(pán)花胺參考文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]，故推測(cè)化合物36為藜蘆酰棋盤(pán)花胺。藜蘆酰棋盤(pán)花胺的裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 藜蘆酰棋盤(pán)花胺裂解途徑

化合物43（tR=25.83 min）在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 800.422 6[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰有m/z 740.401 4[M+H-CH3COOH]+、m/z 540.340 1[M+H-H2O-C9H10O4]+，可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律與verussurine參考文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]，故推測(cè)化合物43為verussurine。verussurine的裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 verussurine裂解途徑

3.2 黃酮類化合物 從藜蘆提取物中共鑒定出5個(gè)黃酮類成分，黃酮及其苷類在裂解過(guò)程中容易發(fā)生糖苷鍵斷裂、黃酮苷元C環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德（RDA）裂解以及一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、H2O等一些中性分子的丟失，以化合物3、27為例說(shuō)明鑒定過(guò)程。

化合物3（tR=0.8 min）在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 607.224 3[M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰有 m/z 298.112 8[M-H-C11H18O9-CH3]－，可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律與葛花苷參考文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故推測(cè)化合物3為葛花苷。葛花苷的裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 葛花苷裂解途徑

化合物27（tR=14.433 min）在負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜生成準(zhǔn)分子離子峰m/z 269.046 4[M-H]－，二級(jí)碎片主要包括 m/z 241.050 9[M-H-CO]－、m/z 197.060 1[M-H-CO-CO2]－，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28]，故推測(cè)化合物27為去甲漢黃芩素。去甲漢黃芩素的裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 去甲漢黃芩素裂解途徑

3.3 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，由于該類化合物中含有羧基基團(tuán)，因此其分子離子峰在裂解過(guò)程中存在CO2（44 Da）的中性丟失，以化合物1、4為例說(shuō)明鑒定過(guò)程。

化合物1（tR=0.799 min）在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 179.054 7[M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片為 m/z 135.029 1[M-H-CO2]－與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故推測(cè)化合物1為咖啡酸。咖啡酸的裂解途徑見(jiàn)圖7。

圖7 咖啡酸裂解途徑

化合物4（tR=0.9 min）在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 133.013 7[M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子峰有m/z 115.003 6[M-H-H2O]－，可發(fā)現(xiàn)該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律與蘋(píng)果酸參考文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故推測(cè)化合物4為蘋(píng)果酸。蘋(píng)果酸的裂解途徑見(jiàn)圖8。

圖8 蘋(píng)果酸裂解途徑

3.4 其他類化合物 除上述3類化合物外，在藜蘆藥材供試品溶液中鑒定出1種香豆素類化合物，由于呋喃香豆素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，比較容易連續(xù)失去中性分子CO和CO2。在正離子模式下，保留時(shí)間為9.278 min，獲得 m/z 229.085 8[M+H]+的質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)201.033 4[M+H-CO]+和185.113 8[M+HCO2]+離子碎片，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配出分子式為C14H12O3，推測(cè)該化合物為川白芷素。

4 討論

藜蘆藥材中化學(xué)成分復(fù)雜，為得到分離度更好、更豐富的色譜峰，本研究對(duì)分析條件進(jìn)行了多重優(yōu)化?？疾炝思状?水、乙腈-水兩種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-水的洗脫效果優(yōu)于甲醇-水且分析時(shí)間更短，另加入0.1%甲酸后可以改善色譜峰拖尾現(xiàn)象，故流動(dòng)相采用0.1%甲酸-水和乙腈。同時(shí)，考慮到不同化合物響應(yīng)模式不同，故采用正、負(fù)兩種監(jiān)測(cè)模式，實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)化學(xué)成分的鑒定。

UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、靈敏的特點(diǎn)，為全面系統(tǒng)研究中藥成分提供了有效途徑。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析了藜蘆中的化學(xué)成分，并根據(jù)保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子等信息，結(jié)合對(duì)照品的裂解規(guī)律并參考相關(guān)文獻(xiàn)，成功地鑒定和推測(cè)出了藜蘆中的47個(gè)化合物，其中包括生物堿類36個(gè)、黃酮類5個(gè)、有機(jī)酸類4個(gè)、其他類2個(gè)。本研究建立了一種能夠快速準(zhǔn)確地鑒定藜蘆藥材中多種化學(xué)成分的方法，為藜蘆質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究提供了參考。