T9SS蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)及其在微生物降解多糖過程中的功能

陳曉藝，方 程，王 辛，趙 鑫

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

0 引 言

分泌系統(tǒng)在細(xì)菌的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞通過分泌系統(tǒng)從外界環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)、進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、分泌毒力(致病)因子以及抵御宿主免疫系統(tǒng)的攻擊等[1-3]。近幾十年來，人們對(duì)革蘭氏陰性菌的蛋白質(zhì)分泌途徑進(jìn)行了深入的研究，迄今共發(fā)現(xiàn)了9種不同類型的分泌系統(tǒng)，分別被命名為Ⅰ～Ⅸ型分泌系統(tǒng)。待分泌的物質(zhì)通過貫穿細(xì)胞被膜的專一性通道被直接運(yùn)送到胞外(T1SS、T3SS、T4SS、T6SS)，或先通過細(xì)胞內(nèi)膜上的Sec通道從胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間，再進(jìn)一步跨細(xì)胞外膜被分泌至胞外(T2SS、T5SS、T7SS、T8SS、T9SS)[4-6]。

其中，T9SS是新近發(fā)現(xiàn)的一類蛋白分泌系統(tǒng)，最初也被稱為PorSS系統(tǒng)，僅在擬桿菌門的部分微生物中存在，具有較高的種屬特異性[6-8]。以T9SS為分泌系統(tǒng)的微生物主要是牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，前者是主要的牙周炎致病菌，后者則是一種常見的環(huán)境微生物，具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的特征。目前已經(jīng)鑒定到很多通過T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有一定的共性，除了具有N末端信號(hào)肽外，C末端還普遍存在一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域——CTD。CTD由大約80個(gè)氨基酸殘基組成，負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白質(zhì)跨越細(xì)胞外膜而被運(yùn)送至胞外[9]。圍繞T9SS的結(jié)構(gòu)、功能以及相關(guān)分泌蛋白的性質(zhì)已展開了許多研究，取得了一定的進(jìn)展。

1 T9SS的發(fā)現(xiàn)

T9SS最初在牙齦卟啉單胞菌P.gingivalis中被發(fā)現(xiàn)，該菌株屬于革蘭氏陰性菌，專性厭氧，是誘發(fā)牙周炎的主要病原菌之一[10]。P.gingivalis能夠向胞外大量分泌一系列牙齦蛋白酶，它們大部分吸附在細(xì)胞外膜的外表面上，少部分以游離狀態(tài)存在。這些蛋白酶能夠攻擊和破壞宿主的先天防御機(jī)制，是重要的毒力因子[10]。P.gingivalis在血瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，由于亞鐵血紅素在細(xì)胞表面積累，菌落正常呈黑色，而這與細(xì)胞表面牙齦蛋白酶的蛋白水解活性及其與血凝素和血紅蛋白的結(jié)合能力密切相關(guān)[11]。自發(fā)突變產(chǎn)生的白色或淺褐色突變株，其細(xì)胞表面的蛋白酶活性均顯著下降[11]。因此，牙齦蛋白酶的胞外活性與P.gingivalis菌落顏色之間的正相關(guān)性成為研究菌株蛋白分泌途徑的有效篩選工具。

PorT(PG0751/PGN_0778)是第一個(gè)被成功鑒定的編碼牙齦蛋白酶分泌途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，它的缺失導(dǎo)致突變株的胞外牙齦蛋白酶活性顯著降低，大量的酶蛋白以沒有活性的酶原形式滯留在細(xì)胞周質(zhì)空間中[12]。研究者們將含有PorT基因的牙齦卟啉單胞菌與不含有PorT基因的多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的蛋白質(zhì)組/基因組進(jìn)行了比對(duì)，從中篩選出除PorT外另外55個(gè)可能參與的基因。隨后，通過對(duì)這些基因進(jìn)行同源基因突變實(shí)驗(yàn)，最終確定了11個(gè)與牙齦蛋白酶跨細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)運(yùn)及激活過程相關(guān)的基因。由于以上基因編碼的蛋白質(zhì)與其他已知分泌系統(tǒng)(T1SS-T8SS)的任何組分都沒有序列相似性，因此研究者們認(rèn)定這是一個(gè)全新的分泌系統(tǒng)，并將其命名為PorSS分泌系統(tǒng)[7]，該系統(tǒng)各組分蛋白的命名大多以“Por”為前綴，以表示這些蛋白質(zhì)在牙齦蛋白酶分泌過程中的重要作用，而后者則與細(xì)胞產(chǎn)卟啉類黑色素密切相關(guān)[13]。為了與已有分泌系統(tǒng)命名一致，后又將其更名為Ⅸ型分泌系統(tǒng)，即T9SS[9，14]。

隨著T9SS在擬桿菌門中的發(fā)現(xiàn)，越來越多研究表明，不僅是P.gingivalis，很多其他病原微生物如福賽斯坦納菌(Tannerellaforsythia)和鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)等，同樣是利用這一系統(tǒng)向胞外分泌毒力因子或效應(yīng)蛋白，從而具有入侵宿主細(xì)胞以及抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊的能力[15-18]。另一方面，以哈氏噬纖維菌(Cytophagahutchinsonii)和約氏黃桿菌(Flavobacteriumjohnsoniae)為代表的非病原環(huán)境微生物，也通過T9SS向胞外分泌幾丁質(zhì)酶和纖維素酶，使細(xì)胞能夠利用幾丁質(zhì)和纖維素等生物大分子作為營養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，這兩類微生物細(xì)胞都具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的特性，而研究發(fā)現(xiàn)T9SS的核心組件本身也是重要的滑動(dòng)蛋白編碼基因[7-8，19]。所以，對(duì)不同的擬桿菌門微生物而言，T9SS既可以是病原菌攻擊宿主細(xì)胞的有力武器，也可以是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物質(zhì)的有效工具[20-21]。

2 T9SS的組成

T9SS本身是一個(gè)多蛋白復(fù)合體，以P.gingivalis的T9SS為例，目前已知至少由18個(gè)組分構(gòu)成(PorT、Sov、PorK、PorL、PorM、PorN、PorP、PorQ、PorU、PorW、PorV、PorX、PorY、PorZ等)，整體結(jié)構(gòu)跨越了細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和細(xì)胞外膜。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除任何一個(gè)基因，都會(huì)導(dǎo)致突變株菌落呈白色，且分泌蛋白在周質(zhì)空間非正常積累[22]。P.gingivalis的T9SS結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖1所示[23]。

在P.gingivalis的基因組中，porPKLMN這5個(gè)基因連續(xù)排列并且同時(shí)轉(zhuǎn)錄，但PorP蛋白的表達(dá)水平比其他4個(gè)蛋白要低很多，研究者推測(cè)可能有單獨(dú)的啟動(dòng)子負(fù)責(zé)調(diào)控porKLMN這5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[24]。PorK是嵌于細(xì)胞外膜上的一個(gè)脂蛋白，與PorN相連接，PorL和PorM兩個(gè)蛋白則位于細(xì)胞內(nèi)膜上(圖1)。這5個(gè)蛋白共同組成了一個(gè)分子質(zhì)量超過1 000 ku的復(fù)合體，構(gòu)成了跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)通道[7]。同樣，在F.johnsoniae中，這4個(gè)蛋白在細(xì)胞滑動(dòng)和代謝幾丁質(zhì)的過程中也起著關(guān)鍵作用，重要的滑動(dòng)黏附素SprB和RemA都是通過這一通道被分泌到胞外的[19]。在眾多T9SS的外膜組分中，PorK和PorN被認(rèn)為是細(xì)胞分泌物質(zhì)以及滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)最不可或缺的兩個(gè)蛋白。結(jié)構(gòu)分析表明，二者均具有32～36個(gè)亞基組成的大型環(huán)狀結(jié)構(gòu)，直徑50 nm，高度約7 nm，且環(huán)狀結(jié)構(gòu)大部分位于外膜的周質(zhì)空間一側(cè)。據(jù)推測(cè)，PorK或PorN的環(huán)狀結(jié)構(gòu)至少有一部分參與組成了外膜上的運(yùn)輸孔道[25]。

圖1 P.gingivalis的T9SS的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Structural prediction of T9SS of P.gingivalis

根據(jù)現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)，大多數(shù)通過T9SS分泌的蛋白都是錨定在細(xì)胞外膜的表面，而非游離釋放到培養(yǎng)基中。在P.gingivalis中，分泌蛋白在一個(gè)轉(zhuǎn)肽酶的作用下切除C末端的部分肽段(轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào))，并與脂多糖A-LPS共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而被錨定在細(xì)胞外膜上，這個(gè)轉(zhuǎn)肽酶即PorU[26]。PorU與其他3個(gè)蛋白(PorV、PorQ和PorZ)一起共同構(gòu)成了一個(gè)“附著復(fù)合體”，在分泌蛋白錨定到外膜的過程中起關(guān)鍵作用[27]。PorV和PorQ都是外膜上的內(nèi)在蛋白，而PorU則通過PorV而被錨定在外膜上[28]。缺失PorU和PorZ基因的突變菌株，分泌蛋白會(huì)部分游離釋放到培養(yǎng)基中，且其C末端信號(hào)肽未被切除[26-27]，由此推測(cè)PorU和PorZ參與了分泌蛋白信號(hào)肽切除及與A-LPS的結(jié)合過程。PorU的主要功能是作為轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行肽段的切除，而PorZ則主要通過識(shí)別脂多糖A-LPS的甘露糖重復(fù)單元，幫助分泌蛋白與A-LPS共價(jià)結(jié)合。同時(shí)，PorZ對(duì)PorU在外膜上的固定也起到了一定的作用。相反，缺失PorV和PorQ基因的P.gingivalis突變菌株，細(xì)胞表面則完全沒有錨定分泌蛋白[27]。實(shí)驗(yàn)表明，PorV與PorU的功能有相似之處，也能夠錨定細(xì)胞分泌的蛋白，在敲除PorU的突變株中，分泌蛋白可通過PorV的作用而被錨定在細(xì)胞表面。

除蛋白外，T9SS還包含很多其他組分，但目前對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能研究報(bào)道相對(duì)較少。PorP雖然在基因組中與PorKLMN相連，但PorP的蛋白表達(dá)水平幾乎比另外4個(gè)蛋白低了20倍。盡管PorP在空間結(jié)構(gòu)上與PorK等其他組分相連，但卻不是外膜上分泌通道的核心組成成分。在約氏黃桿菌F.johnsoniae中存在多個(gè)PorP的同源基因，SprF是其中之一。在基因組上，SprF與SprB相連，后者編碼一種滑動(dòng)黏附蛋白。SprF對(duì)SprB的分泌表達(dá)至關(guān)重要，但SprF的敲除并不影響細(xì)胞的滑動(dòng)性，說明細(xì)胞還存在其他PorP同源基因在調(diào)控滑動(dòng)黏附蛋白的分泌表達(dá)[29]。PG1058也是P.gingivalis細(xì)胞T9SS的一個(gè)重要組分，它的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚[22]。PG1058是一個(gè)脂蛋白，定位于細(xì)胞的周質(zhì)空間，由TolB和肽聚糖結(jié)合模塊組成。與PorP類似，PG1058在F.johnsoniae及其他滑動(dòng)細(xì)菌中也存在多個(gè)同源蛋白，推測(cè)可能參與了某些特定底物的分泌表達(dá)。PorT和Sov是最先被鑒定的兩個(gè)T9SS組分，但是它們的功能至今尚未得到解析。PorT、Sov和PorW都是P.gingivalis細(xì)胞T9SS的基本組成成分，在F.johnsoniae中，這3個(gè)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能正常分泌幾丁質(zhì)酶，但不影響細(xì)胞的滑動(dòng)性。

PorX和PorY兩個(gè)蛋白既是T9SS的組成成分，也是系統(tǒng)的調(diào)控因子。PorX是響應(yīng)調(diào)控因子同源蛋白，PorY是組氨酸激酶感應(yīng)蛋白[30]。敲除其中任何一個(gè)基因，都導(dǎo)致T9SS各組分表達(dá)下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的牙齦蛋白酶活性降低[7，31]。研究表明，PorY能夠自我磷酸化，并與PorX相互作用，使得后者也被磷酸化修飾。PorX在細(xì)胞質(zhì)中與信號(hào)分子SigP結(jié)合，后者又進(jìn)一步與T9SS各組分基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[31]。由此，PorY感應(yīng)來自周質(zhì)空間的信號(hào)，并通過PorX和SigP級(jí)聯(lián)反應(yīng)來上調(diào)T9SS各組分基因的表達(dá)。

3 T9SS的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

蛋白質(zhì)通過T9SS分泌運(yùn)輸?shù)倪^程可分為兩步。首先，分泌蛋白在其自身N端信號(hào)肽的引導(dǎo)下，通過細(xì)胞內(nèi)膜上的Sec轉(zhuǎn)運(yùn)通道被運(yùn)送至周質(zhì)空間；然后，信號(hào)肽被切除，蛋白質(zhì)折疊成具有穩(wěn)定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。其次，蛋白質(zhì)進(jìn)一步在其CTD的引導(dǎo)下，通過細(xì)胞外膜上的易位子被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。已有研究結(jié)果表明，所有通過T9SS運(yùn)送的蛋白質(zhì)普遍具有保守的CTD結(jié)構(gòu)域。以牙齦蛋白酶RgpB為例，去掉C末端72個(gè)氨基酸殘基的突變體蛋白只能在細(xì)胞周質(zhì)空間中積聚，不能被分泌到胞外[9]。CTD的完整性對(duì)RgpB的分泌至關(guān)重要，即使僅僅缺失2個(gè)氨基酸殘基，或者其中保守氨基酸殘基發(fā)生突變，都直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能夠被正常分泌[15]。

與其他分泌系統(tǒng)相比，T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)有其獨(dú)特的特點(diǎn)，即被轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)大多數(shù)都被錨定在細(xì)胞表面，只有少數(shù)以游離狀態(tài)分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中。實(shí)驗(yàn)表明，錨定在外膜上的分泌蛋白，其分子質(zhì)量通常比理論值大20 ku左右，這是由于蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合了一個(gè)脂多糖分子A-LPS[32]。A-LPS本身是鑲嵌在細(xì)胞外膜上的，從而使與之結(jié)合的蛋白質(zhì)被錨定在了細(xì)胞表面。在電鏡下觀察P.gingivalis細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)被錨定在細(xì)胞表面的牙齦蛋白酶形成了一層包裹著細(xì)胞的致密電子層[26]。A-LPS合成有缺陷的突變株細(xì)胞表面則沒有電子層包裹，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)均以游離態(tài)被釋放到培養(yǎng)基中[33]。A-LPS與分泌蛋白的結(jié)合機(jī)制目前尚未得到解析，推測(cè)這一過程主要是在PorU的作用下完成的。PorU具有轉(zhuǎn)肽酶功能，能夠切除分泌蛋白的CTD結(jié)構(gòu)域，隨后將新生成的C末端與A-LPS通過一段連接肽結(jié)合起來，而這一模式與革蘭氏陽性菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)與肽聚糖層的結(jié)合十分相似[34]。

4 T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的典型蛋白

通過T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)，按照功能不同大致可分為兩類：一類是能夠分解復(fù)雜生物大分子的酶，包括蛋白酶、糖苷水解酶(主要是幾丁質(zhì)酶和纖維素酶)、核酶和脂酶等；另外一類則主要是黏附素、血細(xì)胞凝集素以及一些富含亮氨酸的蛋白質(zhì)等。

P.gingivalis產(chǎn)生的牙齦蛋白酶RgpA、RgpB和Kgp是研究相對(duì)深入的T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。它們是細(xì)胞分泌的主要毒力因子，能夠結(jié)合肽段和血紅素，攝取血紅蛋白為細(xì)胞提供營養(yǎng)；同時(shí)，它們通過自身的吸附性以及異常調(diào)節(jié)宿主的免疫防御和炎癥響應(yīng)系統(tǒng)，在細(xì)胞致病機(jī)理中也發(fā)揮著重要作用[35-36]。類似的，T.forsythia利用T9SS分泌一系列毒素因子，包括各種細(xì)胞表層蛋白、富含亮氨酸的重復(fù)蛋白以及一類被稱為KLIKK的蛋白酶等[17，37-38]。其中兩個(gè)重要的分泌蛋白TfsA和TfsB構(gòu)成了細(xì)胞表面的S層。S層結(jié)構(gòu)較為規(guī)則，在細(xì)胞表面形成了一層被膜，能夠幫助菌株黏附并入侵人牙齦上皮細(xì)胞，且能夠延遲人體免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的識(shí)別[39]。

C.hutchinsonii能夠高效降解結(jié)晶纖維素，且降解過程依賴于完整的活細(xì)胞。已有研究證實(shí)，該菌株利用T9SS向胞外分泌纖維素酶，并將酶蛋白錨定在細(xì)胞表面[20]。SprP是C.hutchinsonii細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的PorP(P.gingivalis)同源蛋白，基因敲除實(shí)驗(yàn)表明，SprP基因缺失的突變株失去纖維素降解能力，且依賴于T9SS分泌的胞外蛋白CHU_3105含量也顯著降低；同時(shí)，突變株也喪失了在纖維素表面的滑動(dòng)能力，推測(cè)可能與滑動(dòng)蛋白SprB不能夠被正常分泌有關(guān)[20]。已知C.hutchinsonii基因組中有147個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)含有CTD結(jié)構(gòu)域，包括5個(gè)β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶以及大量與纖維素和其他多糖結(jié)合和降解相關(guān)的蛋白質(zhì)。C.hutchinsonii細(xì)胞能夠在纖維素表面滑動(dòng)、與纖維素底物吸附以及降解結(jié)晶纖維素的過程均與T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)密切相關(guān)。

C.hutchinsonii的細(xì)胞外膜上存在許多纖維素酶組分，它們可能共同構(gòu)成了一個(gè)蛋白復(fù)合體[40]。例如，蛋白CHU_3220的C末端具有保守的CTD結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞外膜上，可與纖維素結(jié)合，是菌株降解結(jié)晶纖維素過程中不可或缺的一個(gè)酶組分。敲除CHU_3220基因后，突變株細(xì)胞表面的內(nèi)切葡聚糖酶活性顯著降低，說明CHU_3220基因可能同時(shí)調(diào)控了其他內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)[40]。CHU_1276和CHU_1277也是兩個(gè)外膜蛋白，二者本身都不具有纖維素酶活性，但均參與調(diào)控多個(gè)纖維素酶基因的表達(dá)或者與維持細(xì)胞表面的纖維素酶活性密切相關(guān)[41-42]。Zhu等[43]系統(tǒng)研究了C.hutchinsonii的所有內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因及其編碼蛋白的細(xì)胞定位和活性，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)酶蛋白(Cel5A、Cel9A、Cel9B、Cel9D和Cel9E)是通過T9SS被分泌并錨定在細(xì)胞外膜上，它們負(fù)責(zé)將纖維素分解為小分子的纖維寡糖，繼而跨過細(xì)胞外膜被運(yùn)送至周質(zhì)空間，再進(jìn)一步被定位于周質(zhì)空間的兩個(gè)內(nèi)切酶Cel5B和Cel9C分解，由此共同組成了一個(gè)完整的纖維素降解酶系。

F.johnsoniae與C.hutchinsonii同屬擬桿菌門，具有滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力，并且能夠降解幾丁質(zhì)。研究表明，F(xiàn).johnsoniae利用T9SS向胞外分泌滑動(dòng)黏附蛋白SprB和RemA，使菌體細(xì)胞能夠在固體表面滑動(dòng)[19]。SprB蛋白的分子質(zhì)量大小為669 ku，是一個(gè)高度序列重復(fù)的蛋白質(zhì)，它從外膜開始形成向外的長絲狀，并沿細(xì)胞表面呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)[44]。在F.johnsoniae細(xì)胞中還含有多個(gè)SprB同源蛋白，它們可能賦予細(xì)胞在不同固體表面滑動(dòng)的能力。RemA的分子質(zhì)量為152 ku，與SprB一樣呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)。RemA蛋白中心含有一個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合細(xì)胞自身分泌的多糖[45]。F.johnsoniae正是借助SprB和RemA等蛋白來推動(dòng)細(xì)胞的自我滑動(dòng)，而這些黏附蛋白如何錨定在細(xì)胞外膜上并沿著一定軌跡運(yùn)動(dòng)的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

F.johnsoniae能夠分泌幾丁質(zhì)酶ChiA，該蛋白由兩個(gè)GH18家族結(jié)構(gòu)域組成，分子質(zhì)量為168.9 ku。ChiA基因的插入突變導(dǎo)致細(xì)胞失去利用幾丁質(zhì)的能力，表明ChiA是該菌株降解幾丁質(zhì)的關(guān)鍵酶蛋白。與上述大多數(shù)T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同的是，ChiA是以游離態(tài)被分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中，而不是錨定在細(xì)胞表面；同時(shí)，序列分析結(jié)果顯示，ChiA的CTD與已知的其他CTD序列相似性很低，可能是一種新型的CTD[46]。因此，CTD或許是決定T9SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白細(xì)胞定位的關(guān)鍵影響因素。此外，GldK、GldL、GldM、GldN、SprA、SprE或SprT等編碼滑動(dòng)蛋白相關(guān)基因的缺失則會(huì)導(dǎo)致分泌的ChiA被錨定在細(xì)胞外膜上，說明F.johnsoniae的很多滑動(dòng)蛋白本身也是T9SS的組成成分，它們除了賦予細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)也直接參與酶蛋白的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

5 總結(jié)與展望

與其他已知蛋白分泌系統(tǒng)相比，T9SS的功能與運(yùn)送機(jī)制相對(duì)較為獨(dú)特，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是其組成構(gòu)造較為復(fù)雜，由分布在細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和細(xì)胞外膜上的多個(gè)組分相互連接構(gòu)成，所轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白底物首先跨細(xì)胞內(nèi)膜被運(yùn)送至周質(zhì)空間，經(jīng)過一定加工后再進(jìn)一步穿過細(xì)胞外膜被運(yùn)送到胞外；二是被運(yùn)送到胞外的蛋白質(zhì)，大多數(shù)不能夠游離分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中，而是通過與外膜上的脂多糖A-LPS共價(jià)結(jié)合而被錨定在細(xì)胞表面，并由此形成S層被膜結(jié)構(gòu)(某些微生物中)。因此，以T9SS作為細(xì)胞主要蛋白分泌系統(tǒng)的微生物，它們的致病性、運(yùn)動(dòng)性、降解生物大分子等生理功能與細(xì)胞膜上的錨定蛋白密切相關(guān)。

盡管已經(jīng)初步了解了T9SS的組成及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)模式，但對(duì)其各組分的結(jié)構(gòu)和功能、各組分之間如何相互連接形成復(fù)雜的蛋白復(fù)合體、蛋白質(zhì)如何通過外膜上的運(yùn)送孔道以及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程的調(diào)控機(jī)理等具體信息還知之甚少。隨著生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是冷凍電鏡(crys-EM)技術(shù)的應(yīng)用，將有助于更好地了解T9SS這一復(fù)雜“細(xì)胞機(jī)器”的構(gòu)造，解析蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

以C.hutchinsonii和F.johnsoniae為代表的微生物能夠吸附在不溶性多糖底物表面并進(jìn)行滑動(dòng)，它們降解多糖的過程依賴于細(xì)胞與底物的緊密吸附。錨定在細(xì)胞外膜上的多糖降解酶在底物降解過程起著至關(guān)重要的作用，但它們是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)并錨定在細(xì)胞表面、CTD是否影響酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)及活性、纖維寡糖又是如何被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間等問題目前尚未得到解析。對(duì)T9SS結(jié)構(gòu)和功能的深入解析將有助于更清晰地了解微生物的多糖降解機(jī)制，或許也有助于發(fā)現(xiàn)新型的多糖降解酶類，從而為工業(yè)酶制劑的研發(fā)提供新的思路。