耐力運(yùn)動(dòng)與高脂飲食對Wistar大鼠骨骼肌線粒體融合分裂蛋白表達(dá)的影響研究*

鄭 義, 徐曉陽,薄 海, 張 勇

(1.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510000;2.武警后勤學(xué)院軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)教研室，天津 300162；3.天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300381)

隨著人民生活水平的提高，脂肪攝入占機(jī)體總熱量攝入的比重逐年升高，高脂飲食(High Fat Diet，HFD)習(xí)慣已成為機(jī)體肥胖的主要原因之一。研究表明，長期高脂飲食(High Fat Diet，HFD)可以顯著增加機(jī)體體重，骨骼肌線粒體氧化功能異常及能力代謝紊亂，降低機(jī)體胰島素敏感性，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)乃至Ⅱ型糖尿病[1]。耐力運(yùn)動(dòng)可以有效改善骨骼肌線粒體脂肪氧化能力，降低機(jī)體體重、血糖濃度并增強(qiáng)機(jī)體胰島素敏感性[2]。骨骼肌是人體重要的運(yùn)動(dòng)器官，線粒體是骨骼肌重要的“能量工廠”，通過氧化磷酸化為骨骼肌提供能量。線粒體同時(shí)也是一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，通過不斷的移動(dòng)、融合與分裂等動(dòng)態(tài)變化維持其分布、形態(tài)與數(shù)量的穩(wěn)定性以便適應(yīng)各種外界應(yīng)激條件，從而滿足細(xì)胞的能量代謝及其他生物學(xué)需求。目前已發(fā)現(xiàn)一些與線粒體融合與分裂密切相關(guān)的線粒體蛋白，如調(diào)控線粒體內(nèi)外膜融合的蛋白MFN1、MFN2與OPA1等，調(diào)控線粒體分裂的蛋白DRP1、FIS1等[3]。骨骼肌線粒體融合與分裂變化極大程度的影響了骨骼肌線粒體功能與能量代謝，其異常改變可導(dǎo)致骨骼肌線粒體動(dòng)態(tài)失衡與能量代謝紊亂，故骨骼肌線粒體融合與分裂狀態(tài)的變化在肥胖與運(yùn)動(dòng)干預(yù)中的作用是本研究所關(guān)注的重點(diǎn)。

目前耐力運(yùn)動(dòng)中線粒體融合與分裂相關(guān)蛋白表達(dá)的研究較少，長期耐力運(yùn)動(dòng)對于肥胖個(gè)體骨骼肌線粒體融合與分裂蛋白表達(dá)及其意義仍不清楚。本研究采用HFD誘導(dǎo)Wistar大鼠肥胖模型，通過觀察HFD與長時(shí)間高強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠骨骼肌線粒體融合與分裂蛋白的影響，初步探討骨骼肌線粒體動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律，為肥胖個(gè)體的營養(yǎng)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與訓(xùn)練方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為8周齡SPF級雄性Wistar大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006)48只，初始體重291.08±6.98g。大鼠飼養(yǎng)地點(diǎn)為天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分為普通飲食組(N組，16只)與高脂飲食組(H組，32只)，兩組大鼠初始體重?zé)o差異。N組大鼠使用維持飼料(Normal Diet， ND；北京華阜康生物科技有限公司)進(jìn)行飼喂，H組大鼠使用高脂飼料(High Fat Diet，HFD；北京華阜康生物科技有限公司，脂肪含量60%)進(jìn)行飼喂，共飼喂8周，每周末記錄大鼠體重。第9周將N組大鼠分為普食安靜組(NNC組，8只)與普食運(yùn)動(dòng)組(NNE組，8只)，H組大鼠分為高脂安靜組(HHC組，8只)、高脂運(yùn)動(dòng)組(HHE組，8只)、飲食轉(zhuǎn)換安靜組(HNC組)與飲食轉(zhuǎn)換運(yùn)動(dòng)組(HNE組，8只)，NNC組與NNE組繼續(xù)使用維持飼料飼喂，HHC組與HHE組繼續(xù)使用HFD飼料進(jìn)行飼喂，、HNC組與HNE組從HFD飼料轉(zhuǎn)換為維持飼料進(jìn)行飼喂。NNE組、HHE組與HNE組從第9周開始進(jìn)行耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)，第9周進(jìn)行為期1周的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)(運(yùn)動(dòng)方案如圖1所示)，第10周-第17周進(jìn)行正式運(yùn)動(dòng)干預(yù)，其運(yùn)動(dòng)方式為0°跑臺速度9m/min，熱身3～5min；隨后0°跑臺速度19m/min運(yùn)動(dòng)1h，1h/d，5d/w。每周末記錄大鼠體重。第17周末進(jìn)行取材。

圖1 大鼠適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)階梯方案

1.2 取材與指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)第8周末對實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠進(jìn)行OGTT測試。測試前1天晚進(jìn)行禁食處理，隔夜禁食14～16h后，用平板固定器(北京合力科創(chuàng)公司，HL-DBS-400)將大鼠固定，將鼠尾浸泡于45℃左右的溫水中3～5min以舒張大鼠鼠尾靜脈血管，擦干并酒精消毒后用采血針輕輕扎破尾靜脈取血，擦掉第一滴血后測定空腹血糖(0min)。立即灌注10ul/g體重的20%葡萄糖溶液，并開始計(jì)時(shí)。在葡萄糖灌注后的30min、60min、90min與120min再次使用采血針進(jìn)行尾靜脈取血，測定血糖值。每次采血結(jié)束后對大鼠鼠尾采血點(diǎn)均使用酒精片消毒并壓迫止血。將記錄的0min、30min、60min、90min與120min血糖值(G0、G30、G60、G90、G120)作圖繪制OGTT曲線。

第17周末處死前稱量大鼠體重并測量大鼠體長，計(jì)算Lee’s指數(shù)；處死后解剖稱量大鼠附睪脂肪與腎周脂肪重量，計(jì)算內(nèi)臟脂肪指數(shù)。

內(nèi)臟脂肪指數(shù)=(附睪脂肪+腎周脂肪)/體重*100%

動(dòng)物經(jīng)麻醉后處死，取右腿腓腸肌用預(yù)冷的PBS清洗后放入凍存管進(jìn)行液氮速凍，隨后放入-80℃低溫冰箱進(jìn)行保存。稱取100mg腓腸肌加入含有10ul PMSF(Solarbio)的 1mlRIPA裂解液(Solarbio)，表面皿剪碎后在冰水浴中使用杜恩斯勻漿器充分勻漿，倒入1.5mlEP管中，冰上靜置20min。隨后將裝有混合液的EP管使用離心機(jī)4℃，15000g離心20min，取上清液使用BCA蛋白濃度試劑盒(Solarbio)測定蛋白濃度，調(diào)整濃度后加入5Xloading buffer(碧云天)煮沸10min進(jìn)行蛋白變性。冷卻后取15-20ug蛋白使用10%與12%SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至0.22umPVDF膜(millipore)上，5%脫脂牛奶常溫封閉1h，TBST稍稍清洗后加入一抗MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、FIS1、PINK1、PARKIN、BNIP3、P62、LCⅢ抗體(abcam)及β-tubulin、GAPDH內(nèi)參抗體(CST)過夜，次日使用TBST清洗PVDF膜，加入HRP標(biāo)記的與一抗對應(yīng)之二抗(中杉金橋)室溫孵育1h，再次使用TBST清洗。清洗結(jié)束后滴加ECL發(fā)光底物(millipore)進(jìn)行蛋白顯影，使用暗匣膠片拍照。使用ImageJ 4.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。方差齊性條件下，同一指標(biāo)數(shù)據(jù)使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn) / 雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)和HFD干預(yù)前后大鼠體重、OGTT、Lee‘s指數(shù)及內(nèi)臟脂肪指數(shù)

正式實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，N組大鼠與H組大鼠初始體重均無差異；HFD飼喂6周后，H組大鼠體重開始顯著高于N組大鼠體重，如圖2所示。

*：P<0.05，H組相較于N組圖2 第1周-第8周N組與H組大鼠體重

第8周末對N組與H組大鼠進(jìn)行OGTT測試(圖3)，H組大鼠30min、60min、90min、120min血糖均非常顯著高于N組大鼠，顯示H組大鼠已出現(xiàn)較為明顯的IR癥狀，綜合體重改變情況認(rèn)定8周HFD干預(yù)大鼠肥胖模型造模成功。

**：P<0.01，H組相較于N組圖3 第8周末N組與H組大鼠OGTT測試結(jié)果

如圖4所示，第9周再次分組后，隨著HFD飼喂的時(shí)間增加HHC組大鼠體重持續(xù)升高，而9周耐力運(yùn)動(dòng)干預(yù)使NNE組、HHE組與HNE組大鼠體重顯著下降，NNC組、HNC組大鼠與HHC組大鼠體重相比具有顯著差異，提示耐力運(yùn)動(dòng)與飲食轉(zhuǎn)歸均可有效降低肥胖大鼠體重，HFD與運(yùn)動(dòng)缺失均是大鼠體重增加乃至肥胖的主要誘因之一。

圖4 第8周-第17周各組大鼠體重變化

17周末進(jìn)行大鼠宰殺，如表1所示NNE組與NNC組、HHE組與HHC組相比Lee’s指數(shù)均顯著下降，提示耐力運(yùn)動(dòng)顯著降低了大鼠Lee’s指數(shù)；NNE組與NNC組、HHE組與HHC組、HNE組與HNC組、NNC組與HHC組、HNC組與HHC組相比內(nèi)臟脂肪指數(shù)均有顯著性(P<0.05)或非常顯著性(P<0.01)差異，提示運(yùn)動(dòng)顯著降低了大鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)，HFD顯著提升了大鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)。

表1 各組大鼠Lee‘s指數(shù)與內(nèi)臟脂肪指數(shù)

2.2 耐力運(yùn)動(dòng)和HFD對大鼠骨骼肌線粒體融合蛋白的影響

骨骼肌線粒體融合分為外膜融合與內(nèi)膜融合。MFN1與MFN2是骨骼肌線粒體的外膜融合蛋白，可以形成3種不同的復(fù)合體(MFN1-MFN1、MFN2-MFN2及MFN1-MFN2)調(diào)控線粒體外膜融合。由圖 5可知NNC組與NNE組、HHC組與HHE組、HNC組與HNE組骨骼肌MFN1表達(dá)均存在非常顯著性差異(P<0.01),提示運(yùn)動(dòng)可以顯著提升MFN1的表達(dá)；NNC組與HHC組、HHC組與HNC組骨骼肌MFN1表達(dá)均存在非常顯著性差異(P<0.01)，提示HFD可以顯著降低骨骼肌MFN1的表達(dá)；NNE組與HHE組、HHE組與HNE組骨骼肌MFN1表達(dá)均存在非常顯著性差異(P<0.01)，提示HFD可以抑制運(yùn)動(dòng)對MFN1表達(dá)的提升作用。

由圖6結(jié)果可知，NNC組與NNE組、HHC組與HHE組、HNC組與HNE組骨骼肌MFN2蛋白均存在顯著性(P<0.05)/非常顯著性(P<0.01)差異，提示9周耐力運(yùn)動(dòng)可以提升MFN2蛋白表達(dá)；NNC組與HHC組、HHC組與HNC組骨骼肌MFN2蛋白存在顯著性(P<0.05)/非常顯著性(P<0.01)差異，提示HFD干預(yù)可以降低MFN2蛋白表達(dá)；NNE組與HHE組骨骼肌MFN2蛋白存在非常顯著性(P<0.01)差異，提示HFD可以抑制9周耐力運(yùn)動(dòng)對MFN2蛋白表達(dá)的提升作用。

*：P<0.05；**：P<0.01圖5 各組大鼠骨骼肌MFN1蛋白表達(dá)

*：P<0.05；**：P<0.01圖6 各組大鼠骨骼肌MFN2蛋白表達(dá)

*：P<0.05；**：P<0.01圖7 各組大鼠骨骼肌OPA1蛋白表達(dá)

OPA1是線粒體內(nèi)膜上的重要蛋白，參與線粒體內(nèi)膜融合與嵴重構(gòu)。由圖7結(jié)果可知，NNC組與NNE組、HNC組與HNE組骨骼肌總OPA1蛋白表達(dá)具有顯著性(P<0.05)與非常顯著性(P<0.01)差異，而HHC組與HHE組骨骼肌總OPA1表達(dá)無差異；同時(shí)NNC組與HHC組、NNE組與HHE組、HHE組與HNE組骨骼肌總OPA1表達(dá)均具有非常顯著性差異，提示長期耐力運(yùn)動(dòng)提升了大鼠骨骼肌總OPA1表達(dá)，同時(shí)HFD顯著降低了骨骼肌OPA1的蛋白表達(dá)，且HFD可以顯著甚至完全抑制了長期耐力運(yùn)動(dòng)對OPA1蛋白表達(dá)的提升作用。為了進(jìn)一步了解不同類型OPA1所受到的影響，本研究將OPA1進(jìn)行分型統(tǒng)計(jì)，上方為L-OPA1，下方為S-OPA1。由結(jié)果可知，由于L-OPA1與S-OPA1在各組大鼠骨骼肌蛋白表達(dá)與總OPA1表達(dá)相一致，故不作贅述。不同的是，HHC組與HHE組大鼠骨骼肌S-OPA1蛋白表達(dá)存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 耐力運(yùn)動(dòng)和HFD對大鼠骨骼肌線粒體分裂蛋白的影響

與線粒體融合模式有所不同，線粒體分裂主要由線粒體分裂蛋白DRP1進(jìn)行調(diào)控。DRP1在線粒體外膜結(jié)合FIS1、MID49/51及MFF等受體蛋白，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后逐漸收縮分裂線粒體。本研究主要檢測了骨骼肌DRP1及FIS1的蛋白表達(dá)情況。

*：P<0.05；**：P<0.01圖8 各組大鼠骨骼肌DRP1蛋白表達(dá)

由圖8可知，NNC組與NNE組、HHC組與HHE組、HNC組與HNE組相比骨骼肌DRP1蛋白表達(dá)均存在顯著性(P<0.05)與非常顯著性差異，NNE組與HHE組、HHE組與HNE組相比骨骼肌DRP1蛋白表達(dá)均存在非常顯著性差異(P<0.01)，提示維持飼料及飲食轉(zhuǎn)歸飼喂情況下9周耐力運(yùn)動(dòng)顯著提升了骨骼肌DRP1的表達(dá)，9周耐力運(yùn)動(dòng)顯著降低了HFD干預(yù)組的DRP1的表達(dá)。

*：P<0.05圖9 各組大鼠骨骼肌FIS1蛋白表達(dá)

由圖9可知，NNC組與NNE組、HHC組，HNC組與HNE組大鼠相比骨骼肌FIS1蛋白表達(dá)存在顯著性差異(P<0.05),提示運(yùn)動(dòng)與HFD均顯著提升了大鼠骨骼肌FIS1蛋白的表達(dá)。但HHC組與HHE組FIS1蛋白表達(dá)無差異，提示運(yùn)動(dòng)并不能降低HFD干預(yù)后FIS1蛋白表達(dá)。

3 分析與討論

3.1 耐力運(yùn)動(dòng)與HFD對肥胖大鼠骨骼肌線粒體融合蛋白的影響

骨骼肌線粒體是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的細(xì)胞器，隨著外界環(huán)境的刺激產(chǎn)生不同的變化以保證其功能的完整性[4]。線粒體融合蛋白MFN1與MFN2具有功能互補(bǔ)性，當(dāng)線粒體同時(shí)缺乏MFN1與MFN2時(shí)則不能進(jìn)行線粒體外膜融合[5-6]；當(dāng)線粒體缺乏OPA1時(shí)則僅能進(jìn)行線粒體外膜融合而不能進(jìn)行內(nèi)膜融合。由結(jié)果可知，9周耐力運(yùn)動(dòng)上調(diào)了大鼠骨骼肌MFN1的蛋白表達(dá)，HFD干預(yù)使MFN1的表達(dá)顯著下降，同時(shí)抑制了9周耐力運(yùn)動(dòng)對MFN1的表達(dá)上調(diào)；9周耐力運(yùn)動(dòng)也上調(diào)了MFN2的蛋白表達(dá)，HFD干預(yù)同樣使MFN2的表達(dá)顯著下降并抑制了9周耐力運(yùn)動(dòng)對MFN2的上調(diào)作用。MFN2相較于MFN1似乎具有更多功能，有研究表明MFN2表達(dá)量下降可能會(huì)導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號的激活，進(jìn)而加重IR病程[7]。Greene等人研究發(fā)現(xiàn)小鼠高脂飲食降低了骨骼肌MFN2、OPA1的蛋白表達(dá)量[8]，Joseph等也·觀察到T2DM患者骨骼肌中MFN2和OPA1融合蛋白表達(dá)顯著降低[9]。各組大鼠骨骼肌OPA1蛋白表達(dá)結(jié)果與MFN1/MFN2結(jié)果相一致，但本研究并未檢測出HHC組與HHE組間OPA1表達(dá)結(jié)果的差異，提示HFD對于運(yùn)動(dòng)提升OPA1的表達(dá)具有抑制作用。有研究表明，過表達(dá)OPA1可以顯著改善線粒體呼吸功能，減少Cyt C與ROS的生成速率[10-11]。而OPA1缺失則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體早衰、全身性炎癥反應(yīng)以及代謝紊亂癥狀[12]。但HHE組大鼠骨骼肌S-OPA1蛋白表達(dá)顯著低于HHC組，S-OPA1參與了線粒體分裂與凋亡等活動(dòng)，此結(jié)果與DRP1表達(dá)結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中已報(bào)道隨著一次大強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，骨骼肌mfn1/2 mRNA的表達(dá)逐漸下降，同時(shí)骨骼肌MFN1蛋白水平下降，而骨骼肌fis1 mRNA表達(dá)和FIS1蛋白含量顯著升高，上述結(jié)果提示一過性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體融合減少，趨向于分裂[13]。長期耐力運(yùn)動(dòng)后由于能量代謝的需求增加，PGC-1a等線粒體生物合成上游因子顯著上調(diào)[14]，骨骼肌線粒體趨向于融合，與一次性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體趨向于分裂有所不同。綜上耐力運(yùn)動(dòng)顯著提升了骨骼肌線粒體融合蛋白的表達(dá)，HFD顯著降低了骨骼肌線粒體融合蛋白的表達(dá)，HFD顯著抑制了耐力運(yùn)動(dòng)對骨骼肌融合蛋白表達(dá)的提升作用。

3.2 耐力運(yùn)動(dòng)與HFD對肥胖大鼠骨骼肌線粒體分裂蛋白的影響

由結(jié)果可知，運(yùn)動(dòng)干預(yù)顯著上調(diào)了S-OPA1與DRP1的表達(dá)，提示9周耐力運(yùn)動(dòng)與增加了線粒體分裂蛋白的表達(dá)。然而HFD干預(yù)后進(jìn)行9周耐力運(yùn)動(dòng)組(HHE組)小鼠DRP1與S-OPA1顯著下降，提示9周耐力運(yùn)動(dòng)顯著下調(diào)了HFD干預(yù)大鼠骨骼肌DRP1與S-OPA1蛋白表達(dá)。此結(jié)果與骨骼肌線粒體OPA1切割蛋白OMA1表達(dá)結(jié)果(未顯示)相一致。此前兩項(xiàng)獨(dú)立研究均表面DRP1在骨骼肌中的過度表達(dá)損害了骨骼肌線粒體網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降以及機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的顯著下降[15-16]。在使用mdivi-1(DRP1抑制劑)干預(yù)C2C12細(xì)胞后，線粒體趨于融合態(tài)且氧化能力有所增加綜合融合蛋白表達(dá)[17]。Borengasser等人觀察到HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠在骨骼肌中表現(xiàn)出DRP1與FIS1蛋白的上調(diào)[18]，而本研究中NNC組與HHC組DRP1蛋白表達(dá)無差異，其原因可能是HFD干預(yù)時(shí)間存在差異，隨著HFD干預(yù)時(shí)間的增加，線粒體分裂蛋白的表達(dá)可能趨于升高。相關(guān)研究均表明HFD可能擾亂了骨骼肌的線粒體動(dòng)態(tài)變化[19-20]，與本研究結(jié)果相一致。綜合本研究中骨骼肌線粒體融合與分裂蛋白表達(dá)情況來看， 9周耐力運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)了骨骼肌線粒體融合蛋白的表達(dá)，也上調(diào)了線粒體分裂蛋白的表達(dá)，骨骼肌線粒體融合與分裂呈現(xiàn)較為活躍的狀態(tài)；HFD干預(yù)后骨骼肌線粒體融合蛋白下調(diào)，線粒體分裂蛋白上調(diào)，線粒體趨向于分裂；9周耐力運(yùn)動(dòng)對HFD干預(yù)后大鼠骨骼肌下調(diào)了線粒體分裂蛋白的表達(dá)，提示運(yùn)動(dòng)抑制了HFD大鼠骨骼肌線粒體的分裂蛋白表達(dá)，使線粒體趨向于融合。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，HFD降低骨骼肌融合蛋白的表達(dá)并提升分裂蛋白的表達(dá)；9周耐力運(yùn)動(dòng)同時(shí)升高了骨骼肌融合蛋白與維持飼料及飲食轉(zhuǎn)歸飼喂組分裂蛋白的表達(dá)，但9周耐力運(yùn)動(dòng)降低了HFD干預(yù)組骨骼肌分裂蛋白的表達(dá)。