比色法輔助下紫外分光光度法測定蘆山藤總黃酮含量

陳惠媚 黃 穎 劉夢(mèng)君 吳鴻羽 張倚瑋 黎蔚玲

廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000

蘆山藤是菊科植物巖穴千里光Cissamp-elopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉，具有活血、止痛、祛風(fēng)除濕等功效，用于治療跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、小兒驚風(fēng)等癥[1]。早記載于《中國高等植物圖鑒》。而在《貴州植物志》中記載的蘆山藤別名為巖生藤菊。產(chǎn)于四川、貴州、云南、廣西[2]。據(jù)前期的瑤藥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蘆山藤除了友誼關(guān)分布外，廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣的大多數(shù)地方也有分布。但是通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)瑤藥蘆山藤的化學(xué)成分、藥理活性、質(zhì)量控制等方面的相關(guān)報(bào)道、研究較少。梁爽等[3]從糯米風(fēng)75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個(gè)化合物。為了進(jìn)一步研究蘆山藤的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)利用已有的測定總黃酮方法，如陳凌霆等[4]采用超聲輔助顯色測定黃芪總黃酮含量對(duì)廣西瑤藥蘆山藤的總黃酮含量測定進(jìn)行研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SHIMADZU電子天平(AUY220)；紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司-TU-1901)；昆山市超聲儀器有限公司(KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器)。

1.2 藥品 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購買于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5981；藥材及鑒定蘆山藤：2019年購于廣西金秀縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒定為菊科植物巖穴千里光Cissampelopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉。實(shí)驗(yàn)室常用藥品，試劑，本實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取總黃酮 準(zhǔn)確稱取被粉碎蘆山藤2.000 g后于干燥錐形瓶中用70%乙醇(料液比1∶30)，60 ℃溫度下超聲提取30 min，超聲輔助乙醇提取法冷卻過濾，制得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，放入容量瓶(100 mL)中，加70%乙醇溶解后定容，即配成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)，放入冰箱備用。

2.3 確定最大吸收波長 顯色劑(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)顯色，顯色時(shí)間參考李敏等[5]研究，在空白組對(duì)照下，測得供試品溶液的最大吸收波長，在360～700 nm范圍內(nèi)最大吸收波長為406 nm。如圖1所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL，置于容量瓶(25 mL)，用70%乙醇稀釋至25 mL，加1.00 mLNaNO2溶液(5%)，搖勻，放置6 min，加入8%Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min，再加入10 mL 5%NaOH溶液，用70%乙醇定容，放置15 min用 0.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液組作為空白對(duì)照組，在406 nm波長中測定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，結(jié)果表明蘆丁在18.4～53.6 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。A=0.01288C+0.01587，r=0.9998。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密性實(shí)驗(yàn)的測定 精確量取上述供試品溶液2 mL，參照“2.4”項(xiàng)顯色及測定吸光度的方法制備，連續(xù)測定5次，RSD為0.90(n=5)，結(jié)果表明，該方法具有良好的精密度見表1。

表1 精密性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批蘆山藤藥材，按照供試品溶液制備的方法制備5份供試品溶液，各取2 mL，并按照“2.4”項(xiàng)的顯色方法制備后測定其吸光度，計(jì)算測得總黃酮的平均含量為13.48 mg/g，RSD為1.75，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該方法的重復(fù)性良好。見表2。

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測定 在室溫條件下，精確吸取供試品溶液1 mL并參照“2.4”項(xiàng)的方法制備顯色后測定其吸光度，分別在有光和無光的條件下，靜置不同時(shí)間后分別測定吸光度，結(jié)果見表3、表4。

表3 光線條件下穩(wěn)定性的測定

表4 無光條件下穩(wěn)定性的測定

由表3、表4可見，在有光和無光的條件下RSD(%)分別為2.4和2.85，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)在室溫條件中40 min內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 加樣回收率 實(shí)驗(yàn)精密吸取已知含量的蘆山藤供試品溶液6份，每份1 mL分別添加0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液4 mL按照“2.4”項(xiàng)的方法制備，顯色后測定其吸光度，并計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果平均回收率為99.0%，RSD為2.50%，表明該方法具有良好的回收率。見表5。

表5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品含量的測定 準(zhǔn)確稱取蘆山藤藥材粉末1 g，將這藥材分成3組，配制成供試品溶液按照“2.4”的顯色方法制備成供試品溶液：各精密量取2 mL上述制備成的供試溶液置于容量瓶(25 mL)中，加70%乙醇定容，加入顯色劑按(5%Na- NO2-8% Al(NO3)-5%NaOH)，在406 nm的波長下測定吸光度，并計(jì)算出蘆山藤總黃酮的含量。見表6。

表6 樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析表明，在顯色條件為5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH下，得廣西金秀縣蘆山藤總黃酮的平均含量為1.28%，實(shí)驗(yàn)回收率為99.0%。實(shí)驗(yàn)中精密度，重現(xiàn)性以及加樣回收率的RSD分別為0.90、1.75、2.50，穩(wěn)定性在有光和無光下的RSD為2.40、2.85都符合要求。

3 討論

瑤藥種類繁多，但是目前對(duì)瑤藥研究以及開發(fā)利用相對(duì)較少，而蘆山藤的研究更是缺乏，梁爽等[3]從糯米風(fēng)75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個(gè)化合物，主要為萜類、酚酸類、黃酮類等，其成分及藥理作用的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)蘆山藤的總黃酮進(jìn)行含量測定；而總黃酮具有較多功效和作用，李磊等[6]研究表明黃芩總黃酮具有顯著的降血脂作用；對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用, 如紀(jì)影實(shí)等[7]研究表明山楂葉總黃酮能夠降低細(xì)胞膜的損傷,具有膜穩(wěn)定性的作用，其能夠提高機(jī)體清除自由基的能力,而且能顯著降低血清中的肌酸激酶以及乳酸脫氫酶的活性。其還具有抗炎作用，柴玲等[8]研究表明擬草果可顯著下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)。所以該實(shí)驗(yàn)的研究不但能夠促進(jìn)瑤藥的發(fā)展，而且能促進(jìn)蘆山藤在降血脂、抗炎等方面開發(fā)和利用。本實(shí)驗(yàn)在已有的測定總黃酮實(shí)驗(yàn)的條件下測定吸光度，其最大吸收波長為406 nm，線性方程為A=0.01288C+0.01587，總黃酮的回收率為99.0%，相對(duì)偏差RSD為2.50。實(shí)驗(yàn)表明，該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率、精密度均符合含量測定要求，操作簡單，結(jié)果可靠。該研究可以為蘆山藤開發(fā)與利用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。