艾粉及常見混偽品的紫外-可見-近紅外指紋圖譜鑒別研究

李 超， 李孟芝， 崔占虎， 王 旭， 黃顯章

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 南陽(yáng) 473000；2.福建農(nóng)林大學(xué) 福建 福州 350002)

0 引言

艾葉為菊科植物艾ArtemisaargyiLevl et Vant的干燥葉[1]，其性溫，味苦、辛，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血等功效[2,3]。艾葉即可內(nèi)服又可外用，以其為原料制成的艾絨是中醫(yī)臨床施灸的主要材料，效果較為顯著[4,5]。隨著對(duì)艾葉研究的深入以及禽畜飼料添加劑“禁抗”的需要，艾粉已然成為替代抗生素的理想原料中藥材。艾粉作為飼料添加劑有利于禽畜的生長(zhǎng)發(fā)育和提高機(jī)體抗病能力，并顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[6-9]，其開發(fā)和使用前景廣闊。

近年來(lái)，艾產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展帶來(lái)了艾葉資源需求量的激增，其價(jià)格不斷攀升，以致艾粉摻假現(xiàn)象凸顯，嚴(yán)重影響了艾粉作為飼料添加劑的安全性和有效性。因此，簡(jiǎn)單快捷的艾粉及其常見混偽品的鑒別方法亟待探索和建立。

到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)艾葉的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用等方面[10-14]，但對(duì)艾粉及常見混偽品的鑒別方法尚未研究，本研究結(jié)果將為艾粉的質(zhì)量控制提供一種新的思路和方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料

1.1 儀器與試劑

紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(3600 Plus，日本島津)；萬(wàn)分之一分析天平(MS-TS，德國(guó)梅特勒)；超聲波清洗儀(SY- 3200 T，上海聲源)；甲醇、乙酸乙酯及石油醚(分析純，天津科密歐)；超純水(ULUP自制)。

1.2 樣品采集

艾葉樣品按照“Z”字采樣法于2018年端午前后在河南省湯陰縣伏道鎮(zhèn)周邊采集；混偽品樣品采自伏牛山樺樹盤林場(chǎng)，采樣方法為隨機(jī)采樣法；提取揮發(fā)油后的艾葉樣品參照水蒸氣蒸餾法完成。以上材料經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院黃顯章副教授鑒定為菊科蒿屬植物艾(Artemisiaargyilevl et Vant)、菊科火絨草屬植物薄雪火絨草(LeontopodiumjaponicumMiq)、菊科蒿屬植物水蒿(ArtemisiaselengensisTurcz)、菊科蒿屬植物野艾蒿(ArtemisialavandulaefoliaDC)、豆科落花生屬植物落花生(ArachishypogaeaLinn) 及菊科豚草屬豚草(AmbrosiaartemisiifoliaL)。

2 方法

2.1 供試樣品的制備

將艾葉、艾桿、提油后的艾葉、薄雪火絨草、水蒿、野艾蒿、豚草、花生殼等樣品分別去雜、挑選、粉碎、混勻。制成供試樣品8類，分別為：純艾粉、艾粉+水蒿粉(1∶1)、艾粉+薄雪火絨草粉(1∶1)、艾粉+野艾蒿粉(1∶1)、艾粉+花生殼粉(1∶1)、艾粉+豚草粉(1∶1)、艾粉+提油后的艾葉粉(1∶1)、艾粉+艾桿粉(1∶1)。將上述8種供試品各稱取0.2 g(每種供試品稱取4份)，分別精密加入純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得32份供試品溶液，超聲90 min，穩(wěn)定后過濾，濾液備用。

2.2 測(cè)試條件

紫外-可見-近紅外指紋圖譜的測(cè)定于南陽(yáng)理工學(xué)院河南省方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持溫度在20～25 ℃，濕度在30%～40%。以純艾葉樣品為基準(zhǔn)，以純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯為背景進(jìn)行參比，并調(diào)整基線，穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定掃描波長(zhǎng)為：190～1500 nm，狹縫為1.0 nm，采樣間隔為0.2 nm，測(cè)定重復(fù)試驗(yàn)3次，以其均值作為檢測(cè)結(jié)果，并以其吸收峰數(shù)考察4種溶劑對(duì)艾粉及其混偽品化學(xué)成分的提取效果并進(jìn)行記錄(已去除噪音背景和閾值異常的干擾波段)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾葉純水提取液(A)在200～1400 nm之間噪音和干擾較少，但此區(qū)域的圖譜幾乎沒有吸收峰的存在，在進(jìn)一步分析其數(shù)據(jù)后，未能發(fā)掘有效信息，故后續(xù)試驗(yàn)予以舍去。甲醇提取液(B)、石油醚提取液(C)、乙酸乙酯提取液(D)分別在200～1200 nm、200～800 nm及200～1400 nm的紫外-可見-近紅外圖譜中吸收峰較多，且受到干擾較小，故選用甲醇、石油醚和乙酸乙酯為提取溶劑進(jìn)行下一步分析。

2.3 最佳稱樣量的確定

準(zhǔn)確稱取純艾葉樣品0.1 g、0.2 g、0.25 g、0.5 g、1.0 g各3份，分別加入甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得15份艾葉樣品試液，超聲提取時(shí)間為90 min，過濾。結(jié)果顯示，稱樣量為0.1 g透光率過大，吸收峰也不穩(wěn)定；而稱樣量為0.2 g、0.25 g、0.5 g和1.0 g時(shí)吸收峰數(shù)和吸收強(qiáng)度較為理想，且差異不明顯，故將最佳稱樣量設(shè)定為0.2 g。

2.4 最佳提取時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取多份0.2 g純艾葉樣品，分別加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯，超聲提取，時(shí)間分別設(shè)為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，提取后過濾。結(jié)果顯示，提取時(shí)間為30 min和60 min時(shí)出峰產(chǎn)生漂移，90 min、120 min、150 min較為穩(wěn)定且吸收峰數(shù)和吸收強(qiáng)度差異不明顯，故將最佳提取時(shí)間確定為90 min。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度的考察

以純艾葉樣品為研究對(duì)象，準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品多份，分別加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯后，超聲提取90 min，分別制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液，平行測(cè)定5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其RSD均小于0.52%，即精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性的考察

以純艾葉樣品為研究對(duì)象，按照2.5.1節(jié)中方法制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液，分別放置0 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、24.0 h后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其RSD均小于1.08%，即樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性的考察

以純艾葉樣品為研究對(duì)象，準(zhǔn)確稱量艾葉樣品5份，按照2.5.1節(jié)中方法制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其RSD均小于0.83%，即重復(fù)性良好。

3 結(jié)果與分析

艾粉與7種常見混偽品(艾葉+水蒿打粉、艾葉+薄血火絨草打粉、艾葉+花生殼打粉、艾葉+野艾蒿打粉、艾葉+豚草打粉、艾葉+提油后艾葉打粉、艾葉+艾桿打粉)的甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的紫外-可見-近紅外指紋圖譜見圖1。由圖1可知，同一溶劑提取的艾粉及混偽品的紫外-可見-近紅外指紋圖譜相似度較高，不能直觀地通過圖譜中的峰位、峰強(qiáng)及峰數(shù)等參數(shù)對(duì)其進(jìn)行區(qū)分和鑒別。

3.1 紫外-可見-近紅外指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

相似度評(píng)價(jià)體系是指將所提取到的相似度較高的吸收峰采用正態(tài)檢驗(yàn)法進(jìn)行識(shí)別，并對(duì)組內(nèi)吸收峰波長(zhǎng)極差值與該組和相鄰組的平均波長(zhǎng)差值大小進(jìn)行比較。本研究首先借助origin分析軟件(9.0，OriginLab公司)拾取特征峰值，結(jié)果顯示，甲醇提取液的特征峰有12組(524 nm、553 nm、625 nm、756 nm、760 nm、763 nm、774 nm、777 nm、782 nm、787 nm、792 nm、795 nm)，石油醚提取液的特征峰有23組(252 nm、258 nm、265 nm、300 nm、320 nm、341 nm、360 nm、363 nm、462 nm、522 nm、549 nm、556 nm、565 nm、578 nm、584 nm、587 nm、591 nm、631 nm、635 nm、639 nm、642 nm、692 nm、697 nm)，乙酸乙酯提取液的特征峰有18組(381 nm、 447 nm、521 nm、549 nm、624 nm、718 nm、725 nm、732 nm、738 nm、755 nm、763 nm、766 nm、772 nm、778 nm、781 nm、787 nm、791 nm、796 nm)。以純艾粉的均值特征峰值作為對(duì)照，將7種混偽品進(jìn)行相似度對(duì)比，分析結(jié)果見表1。

表1 艾粉及混偽品的特征峰和全譜相似度評(píng)價(jià)

從表1可以看出，純艾粉與其混偽品的特征峰在3種提取液中的相似度普遍較高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光譜特征峰的相似度評(píng)價(jià)不能有效地對(duì)純艾粉及其混偽品進(jìn)行區(qū)分。鑒于上述結(jié)果，本研究嘗試采用全譜相似度評(píng)價(jià)代替共有特征峰相似度評(píng)價(jià)以探索艾粉與混偽品之間的差異，即以共有模式建立純艾粉的對(duì)照?qǐng)D譜，以均值作為對(duì)照?qǐng)D譜的吸收強(qiáng)度，分析結(jié)果亦見表1。從表1可以看出，純艾粉與其混偽品的圖譜在3種提取液中的相似度較高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，即借助全光譜的相似度評(píng)價(jià)也不能對(duì)純艾粉及其混偽品進(jìn)行區(qū)分。以上結(jié)果表明，特征峰及全光譜相似度評(píng)價(jià)體系均不能對(duì)艾粉及其混偽品進(jìn)行區(qū)分和鑒別，應(yīng)進(jìn)一步考慮其他計(jì)量學(xué)方法挖掘潛在和有效的差異。

3.2 純艾粉及其混偽品的主成分分析

主成分分析是利用降維的方式將原始的多個(gè)變量通過線性變換轉(zhuǎn)化為新的少數(shù)綜合指標(biāo)的分析方法，即從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)的幾個(gè)主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，該方法具有信息損失少、相關(guān)最優(yōu)和回歸最優(yōu)等特點(diǎn)。

在艾粉與混偽品的光譜波段中，選取干擾小、指紋差異大的波段作為分析對(duì)象，即甲醇提取液波段350～800 nm、石油醚提取液200～700 nm及乙酸乙酯提取液波段250～800 nm，并組成相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣，借助SPSS軟件(SPSS 19.0，USA)和SIMCA-P軟件(Simca-p 12，Sweden)進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表2。從表2中可以看出，甲醇提取液中共提取5個(gè)主成分(特征值大于1)，累計(jì)可信度為99.56%；石油醚提取液中共提取5個(gè)主成分，累計(jì)可信度為99.65%；乙酸乙酯提取液中共提取5個(gè)主成分，累計(jì)可信度為99.75%。以上較高的累計(jì)可信度，說(shuō)明所提取的主成分可替代原始光譜信息進(jìn)行進(jìn)一步的分析和挖掘。

表2 主成分的特征值及累計(jì)可信度

圖2 艾粉及混偽品的不同溶劑提取液PCA得分圖

圖2為艾粉及其混偽品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散點(diǎn)圖，從該散點(diǎn)圖中可以看出，甲醇提取液的主成分分類效果欠佳，艾粉及混偽品的分布無(wú)序且分散，存在多處交叉和超越置信閾值，無(wú)法達(dá)到理想的分類效果；石油醚提取液的主成分分類效果較為理想，除艾葉+艾桿與艾葉+薄雪火絨草出現(xiàn)部分交叉外，艾粉及混偽品的分布相對(duì)獨(dú)立且集中；乙酸乙酯提取液的主成分分類效果相對(duì)最為理想，艾粉及混偽品的分布相對(duì)獨(dú)立且集中，沒有出現(xiàn)交叉混亂，象限內(nèi)分布也比較均勻。因此，基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光譜技術(shù)適用于艾粉及其混偽品的鑒別與分類，下一步將以乙酸乙酯提取液的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和分析。

3.3 偏最小二乘判別分析

在3.2節(jié)基礎(chǔ)上，將艾粉及其混偽品的乙酸乙酯提取液光譜數(shù)據(jù)代入SIMCA軟件進(jìn)行PLS-DA分析。在PLS模型構(gòu)建中，將艾粉及混偽品樣品數(shù)據(jù)設(shè)置為“class 1～class 8”，自動(dòng)擬合后進(jìn)行交叉驗(yàn)證及預(yù)測(cè)因變量的變化。結(jié)果顯示，PLS模型共提取到9個(gè)主成分，其變量的累積R2Y值和Q2值分別達(dá)到98.80%和95.56%，說(shuō)明該模型的擬合效果較好(見表3)。隨機(jī)選取艾粉及其混偽品樣品借助PLS模型進(jìn)行預(yù)測(cè)(已移除觀測(cè)值)，結(jié)果顯示艾粉及其混偽均被正確分類。以上結(jié)果表明，乙酸乙酯提取液光譜數(shù)據(jù)結(jié)合PLS模型可以有效地對(duì)艾粉及其混偽品進(jìn)行分類。

表3 基于PLS的解釋變量和預(yù)測(cè)變量

4 討論和結(jié)論

近年來(lái)，中藥指紋圖譜技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，符合中藥整體觀念和模糊性特點(diǎn)，并能系統(tǒng)地探尋中藥成分的種類和含量分布規(guī)律，可用于中藥材的產(chǎn)地、部位及真?zhèn)舞b別。本研究通過紫外-可見-近紅外指紋圖譜技術(shù)依次考察了純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯等提取液對(duì)艾粉及其常見混偽品的提取效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇、石油醚及乙酸乙酯為提取溶劑的光譜數(shù)據(jù)較為豐富，圖譜吸收峰多，且受到干擾小。在初步的相似度分析中，借助origin拾取特征峰值，甲醇提取液的特征峰有12組，石油醚提取液的特征峰有23組，乙酸乙酯提取液的特征峰有18組，以純艾粉的均值特征峰值作為對(duì)照，結(jié)果顯示純艾粉與其混偽品的特征峰在3種提取液中的相似度普遍較高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光譜特征峰的相似度評(píng)價(jià)不能有效的對(duì)純艾粉及其混偽品進(jìn)行分類。鑒于特征峰分析的失敗，又嘗試采用全譜相似度評(píng)價(jià)代替共有特征峰相似度評(píng)價(jià)以探索艾粉與混偽品之間的差異，分析結(jié)果表明，純艾粉與其混偽品的圖譜在3種提取液中的相似度較高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，以上結(jié)果表明，特征峰及全光譜相似度評(píng)價(jià)體系均不能對(duì)艾葉及其混偽品進(jìn)行區(qū)分和鑒別。在主成分分析中，通過構(gòu)建艾粉及其混偽品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)甲醇提取液的主成分分類效果欠佳，艾粉及混偽品的分布無(wú)序且分散，無(wú)法達(dá)到理想的分類效果；石油醚提取液的主成分分類效果較為理想，但是艾葉+艾桿與艾葉+薄雪火絨草出現(xiàn)部分交叉；而乙酸乙酯提取液的主成分分類效果較為理想，艾粉及混偽品的分布相對(duì)獨(dú)立且集中，說(shuō)明基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光譜數(shù)據(jù)適用于艾粉及其混偽品的鑒別與分類。在主成分分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建PLS模型，自動(dòng)擬合后進(jìn)行交叉驗(yàn)證及預(yù)測(cè)因變量的變化，結(jié)果顯示PLS模型變量的累積R2Y值和Q2值分別達(dá)到98.80%和95.56%，說(shuō)明該模型的擬合效果較好，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示艾粉及其混偽均被正確分類。以上結(jié)果表明，乙酸乙酯提取液光譜數(shù)據(jù)結(jié)合PLS模型可以有效地對(duì)艾粉及其混偽品進(jìn)行分類。

綜上所述，紫外-可見-近紅外指紋圖譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合可用于艾粉及其混偽品的分類與鑒別，且此方法操作簡(jiǎn)便，可為艾粉及其他添加劑的等同性研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和有益參考。