一株產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌株的鑒定和發(fā)酵優(yōu)化

張旭松，高 鵬，黃天悅，陳 斐，郭佳強，曾 鑫，陳孝平

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

ε-聚賴氨酸是1977 年日本的Shima 和Sakait在白色鏈霉菌的發(fā)酵液發(fā)現(xiàn)的一種對德拉根道夫試驗呈陽性的化合物，隨著對該物質(zhì)研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)是由25～35 個L-賴氨酸單體經(jīng)過α-COOH 和ε-NH2縮聚而成的一種同型氨基酸聚合物，分子量約為3 500～4 500 Da。由于其肽鍵異于α-聚賴氨酸聚合物中的肽鍵，所以將這種物質(zhì)稱為ε-聚賴氨酸［1］。ε-聚賴氨酸的結(jié)構(gòu)如圖1 所示。ε-聚賴氨酸純品外觀為堿白色至淡黃色粉末，略帶苦味、吸水性強、溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸在121 ℃下處理60 min 仍不會被降解，該物質(zhì)的等電點為9.0，所以該物質(zhì)受pH 的影響較?。?］。截至目前，相關(guān)研究還沒有發(fā)現(xiàn)其具有確切的三維結(jié)構(gòu)。ε-聚賴氨酸作為一種聚合物，歸類于非晶體，因此它沒有確切的熔點，當溫度超過250 ℃，便開始軟化并分解，紅外光譜分析表明，ε-聚賴氨酸在1 680～1 640 nm 和1 580 ～1 520 nm 區(qū)間時有強吸收峰［2-3］。

ε-聚賴氨酸具有抑菌譜廣、水溶性好、安全性高、熱穩(wěn)定性好和抑菌pH 范圍廣等特點逐漸地受到食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)的關(guān)注［5-6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸可綠色降解，可食用，對人體本身和其它動物均無毒副作用，該物質(zhì)也不會在人體內(nèi)積累。早已在韓國、日本、美國等國家應(yīng)用于食品防腐，隨后中國也批準ε-聚賴氨酸作為食品防腐劑［7-8］。ε-聚賴氨酸還可以應(yīng)用農(nóng)產(chǎn)品生長和保鮮［9-12］，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，例如用于干擾素誘導(dǎo)劑、藥物載體、藥物緩釋劑、生物傳感器［13-14］、可生物降解性ε-聚賴氨酸樹脂制備等［15-17］。隨著ε-聚賴氨酸在更加廣泛的領(lǐng)域使用，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量需求越來越高，所以提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量就成了亟待解決的問題之一。篩選到新的菌種以及優(yōu)化發(fā)酵的最適培養(yǎng)基是提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量的重要前期工作。本實驗室保存有一株新產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌株，本研究對菌株的基本生理生化指標開展檢測，并在搖瓶水平響應(yīng)面優(yōu)化獲得該菌株的最優(yōu)配方和發(fā)酵參數(shù)。

圖1 ε-聚賴氨酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 ε-polylysine structure

1 實驗部分

1.1 材 料

菌種：白色鏈霉菌（st10），由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸銨10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，12 水磷酸氫二鈉3.58 g/L，pH=6.8。

固體培養(yǎng)基：高氏1 號固體培養(yǎng)基，改良M3G固體培養(yǎng)基（甘油為碳源），M3G 固體培養(yǎng)基（葡萄糖為碳源），查氏培養(yǎng)基，gibbons 改良固體培養(yǎng)基，貝納特培養(yǎng)基。

1.3 分析方法

1.3.1 菌株的生長曲線以及在不同固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài) 菌種活化：取實驗室-20 ℃下保藏在冷凍甘油管中的菌種1 環(huán)接入貝納特培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h，革蘭氏染色鏡檢無誤后用作活化菌種。

種子培養(yǎng)：取一環(huán)活化后的孢子接種于裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)（250 mL 三角瓶裝液量50 mL，180 r/min，30 ℃，恒溫振蕩培養(yǎng)36 h）。

搖瓶發(fā)酵：在250 mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，種子液以3%（體積比）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃，恒溫震蕩培養(yǎng)。

菌株在不同培養(yǎng)基上的生長：用種子發(fā)酵液分別涂布以下培養(yǎng)基：高氏1 號固體培養(yǎng)基，改良M3G 固體培養(yǎng)基（甘油為碳源），M3G 培養(yǎng)固體培養(yǎng)基（葡萄糖為碳源），查氏培養(yǎng)基，gibbons 改良固體培養(yǎng)基，貝納培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后觀察生長情況。

菌生長曲線：將M3G 液體培養(yǎng)基分裝到若干50 mL 的小錐形瓶中，每個錐形瓶中裝30 mL 培養(yǎng)基，接種量為3%（體積比），在條件為180 r/min，30 ℃的搖床中培養(yǎng)，每隔5 h，將1 錐形瓶中菌液進行抽濾，然后將所有抽濾所得菌體進行冷凍干燥后稱量，得到菌的生長曲線。

1.3.2 ε-聚賴氨酸標準曲線制作和產(chǎn)物的鑒定 標準曲線的制備：配制2 mg/mL ε-聚賴氨酸母液，用0.7 mmol/L 磷酸緩沖液（pH=6.9）稀釋成為0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.11，0.12 mg/mL 的ε-PL 標準溶液，分別量取各標準液0.2 mL以磷酸緩沖液為對照加入0.8 mL 0.5 mmol/L甲基橙，30 ℃振蕩反應(yīng)30 min 后，8 000 r/min 離心5 min，取上清液稀釋8 倍在465 nm 波長處測定吸光度。以ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，制作標準曲線。

ε-PL 的測量：將離心除菌的發(fā)酵液進行稀釋，然后取0.2 mL 的稀釋液加入0.8 mL 0.5 mmol/L 的甲基橙溶液，在30 ℃，震蕩反應(yīng)30 min，反應(yīng)液在8 000 r/min 的條件下離心5 min，取上清液稀釋適當倍數(shù)在465 nm 波長處測量吸光度，然后根據(jù)標準曲線計算ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量。

顏色反應(yīng)：Dragendorff 試劑會與ε-聚賴氨酸發(fā)生特異的淡黃色沉淀，可用于定性檢測發(fā)酵液中是否含有ε-聚賴氨酸。

薄層層析：吸取1 mL 液體純化產(chǎn)物至耐熱玻璃管，加入1 mL 濃鹽酸，鹽酸終濃度為6 mol/L，密封后121℃烘箱水解24 h。薄層色譜的展開劑為V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（吡啶）∶V（水）=4∶1∶1∶2，質(zhì)量分數(shù)0.2%茚三酮乙醇溶液為顯色劑，毛細管點適量樣品，進行室溫層析，展開劑前沿距硅膠板頂端1 cm 處時取出硅膠板，溶劑室溫揮發(fā)后噴灑顯色劑，30 ℃培養(yǎng)箱顯色后分析。

Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳檢測［18］：用改良tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳方法檢測發(fā)酵液和ε-聚賴氨酸標準品中目標蛋白的表達，并對其進行蛋白質(zhì)分子量分析。

1.3.3 合適的碳氮源選擇 本實驗首先進行了單因素的實驗，單因素主要做了碳源和氮源，兩個因素篩選，確定碳源、氮源的最佳種類，根據(jù)文獻得知ε-聚賴氨酸的分泌與pH 有關(guān)，所以同時分別研究了有機氮源酵母和無機氮源硫酸銨對于發(fā)酵中pH 及菌株繁殖的影響。

碳源單因素實驗：以葡萄糖、檸檬酸、麥芽糖、纖維素、淀粉、甘油為碳源，碳源濃度均為50 g/L，其余成分濃度為酵母粉5 g/L，硫酸銨10 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，12 水磷酸氫二鈉3.58 g/L，pH=6.8，接種量為3%（體積分數(shù)）進行發(fā)酵，從30 h 開始后每隔5 h 測量ε-聚賴氨酸的濃度。

氮源的單因素實驗：以酵母粉、玉米粉、大豆蛋白、尿素、氯化銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源，氮源質(zhì)量濃度均為10 g/L，其余成分為甘油50 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，12 水磷酸氫二鈉3.58 g/L，pH=7.0，接種量為3%（體積分數(shù)）進行發(fā)酵，每隔10 h測量發(fā)酵液的pH 值及ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，在60 h的時候測量發(fā)酵液中菌體的重量以及ε-聚賴氨酸的濃度。

混合氮源對發(fā)酵的影響：將發(fā)酵液中的硫酸銨與酵母粉的質(zhì)量比分別定為3∶1，2∶2，1∶1，1∶2，1∶3，其余成分為甘油50 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，12 水磷酸氫二鈉3.58 g/L，pH=6.8，接種量為3%（體積分數(shù)）進行發(fā)酵，每隔10 h 測量發(fā)酵液的pH 值及ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，分析實驗結(jié)果。

1.3.4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計 Plackett-Burman 篩選法采用兩水平方法進行實驗設(shè)計，該方法適合從較多的影響因素中分析出不同的因素對研究目標的影響程度，能以最少試驗次數(shù)使因素的效果得到更好的估計。設(shè)計的N 次實驗至多可研究（N-1）個因素，其中（N-4）個實際因素，3 個虛構(gòu)變量用以估計誤差。每個因素取高低兩個水平，兩水平取值一般高水平為低水平的1～2 倍，試驗中因素分別為pH，甘油，酵母粉，硫酸銨，硫酸鎂，硫酸鐵，硫酸鋅，磷酸二氫鉀，分別用X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8 表示，X9，X10，X11 為虛構(gòu)變量。1.3.5 爬坡實驗 根據(jù)PB 試驗結(jié)果設(shè)計最陡爬坡試驗路徑，以計算出的步長梯度減少酵母膏和硫酸銨在培養(yǎng)基中的濃度，并按一定的梯度增加甘油在培養(yǎng)基中的濃度，其余5 個因素均取初始濃度，發(fā)酵60 h 后檢測發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的濃度，從而確定3個因素的最適合濃度作為響應(yīng)面中心點。1.3.6 Box-Behnken 設(shè)計 Box-Behnken 設(shè)計一般用于分析2～5 個因素對于主效應(yīng)影響的優(yōu)化試驗。在Box-Behnken 設(shè)計前進行PB 試驗篩選，將篩選得到的對發(fā)酵液ε-聚賴氨酸產(chǎn)量影響顯著的因素作為Box-Behnken 設(shè)計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，根據(jù)相應(yīng)的試驗表進行試驗后，使用Design-Expert 軟件對試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，從而能得到最優(yōu)發(fā)酵配方。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子生物學(xué)鑒定及型態(tài)學(xué)特征結(jié)果

菌株的16s rRNA 經(jīng)過BLAST 比對后，發(fā)現(xiàn)st10 與鏈霉菌屬的多個種的16s rRNA 序列相似性 達 到 99%。 如 圖 2 所 示，菌 株 st10 與NR024723.1 streptomyces albulus strain IMC s-0802和MN611985.1streptomyces platensis strainYBQ90在同一個分支上，同源，因此確定st10 菌株為以上鏈霉菌屬中的一個種。如圖3 所示，結(jié)合菌株st10 的菌絲體不分隔，不斷裂為桿狀體，孢子成鏈狀符合鏈霉菌屬（Streptomyces）特征。菌株在甲基藍固體培養(yǎng)基生長產(chǎn)生的透明圈表明菌株分泌酸性物質(zhì)，符合分泌ε-聚賴氨酸的特征。

圖2 16s rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16s rRNA

圖3 st10 菌株的不同形態(tài)：（a）菌株在甲基藍培養(yǎng)基上的生長，（b）菌株形成的孢子，（c）液體培養(yǎng)基中菌形態(tài)Fig.3 Different morphologies of st10 strain：（a）growth of strain on methyl blue medium，（b）spores of the strain，（c）morphology of bacteria in liquid medium

2.2 菌株的生長曲線及其在不同固體培養(yǎng)基上的生長

如圖4 所示，菌的生長曲線說明，菌的生長對數(shù)期在10～40 h 之間，之后逐漸達到平衡期。如圖5 與表1 所示，菌株在不同培養(yǎng)基上的生長情況說明菌株對不同的營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率不一樣，其中可以明顯看出該菌株對甘油的利用效果最好，在貝納特培養(yǎng)基很容易形成褐色的孢子。而在其它的培養(yǎng)基中的生長旺盛程度與生長狀態(tài)都很差，這與碳源的單因素試驗得出的結(jié)論是一樣，這說明，該菌株不管在固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基中，最適合生長的碳源均為甘油。

圖4 菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of bacteria

2.3 標準曲線和產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

標準曲線如圖6所示，R2=0.994，線性較好。圖7（b）表明配制Dragendorff 試劑加入到發(fā)酵上清液中出現(xiàn)明顯的淡黃色沉淀，與特異檢測結(jié)果相一致。圖7（a）薄層層析結(jié)果顯示產(chǎn)物以及標準品的水解液的成分層析位置與單體賴氨酸是一致的，說明產(chǎn)品為賴氨酸單體的復(fù)合物。圖7（c）tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示發(fā)酵液與標準品的條帶位置是一致的，說明發(fā)酵產(chǎn)物與購買的標準品的分子量相近，低于5 000 Da，發(fā)酵液與標準品的條帶相似，分子量為一個范圍值，該結(jié)果與目前的大多數(shù)菌株分泌的ε-聚賴氨酸性質(zhì)相似。

圖5 st10 在不同固體培養(yǎng)基上的生長照片：（a）高氏1 號，（b）M3G（甘油為碳源），（c）查氏，（d）M3G（葡萄糖為碳源），（e）貝納特，（f）gibbonsFig.5 Growth pictures of st10 on different solid media：（a）coles No.1，（b）M3G（glycerol as carbon source），（c）chaffs，（d）M3g（glucose as carbon source），（e）Beinart，（f）gibbons

表1 菌株不同固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Tab.1 Growth status of strains on different solid media

圖6 測量ε-聚賴氨酸的標準曲線Fig.6 Standard curve for ε-polylysine

圖7 ε-聚賴氨酸鑒定圖：（a）薄層層析，（b）顏色反應(yīng)，（c）tricine-SDS-PAGE 電泳Fig.7 Identification diagrams of ε-polylysine：（a）thin-layer chromatography，（b）colour reaction，（c）tricine-SDS-PAGE electrophoresis

2.4 單因素實驗結(jié)果

如圖8（a）所示，不同的碳源實驗表明，適合菌株的較好碳源為甘油和葡萄糖，其對甘油的利用效果更好，更有利于前期菌的增殖，以及后期ε-聚賴氨酸的合成，對于檸檬酸，麥芽糖，淀粉，纖維素，這4 種碳源的利用率很低，后期的發(fā)酵液的混濁程度低，說明菌的濃度很低。根據(jù)圖4 生長曲線和檢測發(fā)現(xiàn)菌生長到30 h 左右達到平衡期才能檢測到ε-聚賴氨酸。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸的分泌與發(fā)酵液的pH 有關(guān)系。而氮源與發(fā)酵液的pH 和菌體的增殖均有復(fù)雜的關(guān)系。實驗中氮源的發(fā)酵實驗表明在單獨的氮源中基本都不能檢測到ε-聚賴氨酸，如圖8（b）所示，顯示檢測到ε-聚賴氨酸的氮源是因為尿素、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨中的銨根離子會對檢測產(chǎn)生干擾。如圖8（c）所示菌株沒有分泌ε-聚賴氨酸的原因為硝酸銨、硫酸銨、氯化銨雖然能極大降低發(fā)酵液的pH，但是菌達不到一定的密度，所以菌體也不會分泌ε-聚賴氨酸。如圖8（d）所示大豆蛋白胨，酵母粉有機氮源會促進菌的增殖，但是不利于pH 的降低，不能使發(fā)酵液pH 環(huán)境降到4 左右，所以也不能檢測到ε-聚賴氨酸，這說明該菌株與大部分產(chǎn)ε-聚賴氨酸株相似，只有菌濃達到一定的密度，而且在pH=4 左右時才會分泌ε-聚賴氨酸。雖然硫酸銨相對于硝酸銨，氯化銨可以使菌量得到一定的增殖，但是與有機氮源酵母粉和大豆蛋白相比依然較差，由于干擾因素玉米粉不能完全溶于水中，所以玉米粉培養(yǎng)基中菌量是不準確的。綜合有機氮源與無機氮源的特點，后期的發(fā)酵均采用有機氮源和無機氮源相結(jié)合來促進菌體的增殖和ε-聚賴氨酸分泌。

圖8 不同碳源氮源對發(fā)酵的影響：（a）不同碳源的發(fā)酵產(chǎn)量，（b）不同氮源的發(fā)酵產(chǎn)量，（c）不同氮源的pH 值，（d）不同氮源菌量Fig.8 Effects of different carbon and nitrogen sources on fermentation：（a）fermentation yields of different carbon sources，（b）fermentation yields of different nitrogen sources，（c）pH values of different nitrogen sources，（d）mass of bacteria in different nitrogen sources

2.5 混合氮源

如圖9（a）所示，通過有機氮源與無機氮源的不同配比發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)m（酵母粉）∶m（硫酸銨）=1∶2 和m（酵母粉）∶m（硫酸銨）=1∶3 的時候pH 下降的最快，但是最終的pH 與初始的氮源配比沒有關(guān)系，最終的pH 均穩(wěn)定在3.0 左右，這說明該菌株能進行pH 環(huán)境的自我調(diào)控，最終將pH 穩(wěn)定在適當?shù)乃?。如圖9（b）所示，不同氮源中ε-聚賴氨酸的檢測發(fā)現(xiàn)m（酵母）∶m（硫酸銨）為1∶2 的時候ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量最高為0.42 g/L，所以ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量與混合氮源的比例和種類均有關(guān)系。ε-聚賴氨酸產(chǎn)量曲線也說明由于初期銨根離子的影響會影響檢測，但隨著時間的變化由于銨根離子的消耗導(dǎo)致測量回歸正常。

圖9 混合氮源對pH 和產(chǎn)量的影響：（a）混合氮源的pH，（b）混合氮源的產(chǎn)量Fig.9 Effects of mixed nitrogen sources on pH values and yields：（a）pH values of mixed nitrogen sources，（b）yields of mixed nitrogen sources

2.6 優(yōu)化實驗結(jié)果

2.6.1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計結(jié)果與分析Plackett- Burman 試驗結(jié)果如表2 所示，得到的數(shù)據(jù)輸入到Design-Expert 軟件中進行回歸分析，得到每個影響因素的偏回歸系數(shù)和對發(fā)酵產(chǎn)量的顯著性，以及它們在發(fā)酵中的影響比重。結(jié)果顯示如表3 所示，甘油、酵母粉、硫酸銨對發(fā)酵產(chǎn)量的影響占比位于前三，其中正效應(yīng)因素為甘油，負效應(yīng)因素為酵母粉和硫酸銨，貢獻占比分別為21.78%，33.29%，28.48%。

表2 Plackett-Burman 試驗設(shè)計結(jié)果Tab.2 Plackett-Burman experiment design and response values

表3 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Tab.3 Significance analyses of partial regression coefficients and influence factor

2.6.2 響應(yīng)面中心點的確定 爬坡實驗如表4 所示，酵母膏、硫酸銨、以及甘油的質(zhì)量濃度分別為4，7，55 g/L時ε-聚賴氨酸的質(zhì)量濃度最大為0.71 g/L。此時m（酵母膏）∶m（硫酸銨）=1∶1.8，將此時的質(zhì)量濃度作為響應(yīng)面的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計及其結(jié)果Tab.4 Design and results of steepest climb test g/L

2.6.3 培養(yǎng)基最佳成分的確定 響應(yīng)面實驗結(jié)果如表5 所示，將得到的發(fā)酵產(chǎn)量結(jié)果用Design-Ex‐pert 軟件進行響應(yīng)面分析得到方程模型，響應(yīng)曲面以及等高線圖。利用Design-Expert 軟件擬合得到的回歸方程為：R1=0.78+0.026A+0.079B-0.082C+9.850AB+0.044AC-0.015BC-0.12A2-0.20B2-0.12C2。方程中A，B，C 分別表示酵母膏、硫酸銨和甘油的質(zhì)量濃度，R2=92%顯示回歸擬合較好。由回歸方差分析表6 可以看出，該回歸模型顯著（p=0.004 6<0.050 0），失擬項顯著，所以此模型可以用來進行發(fā)酵產(chǎn)量的預(yù)測。對方程模型進行分析得到模型的最優(yōu)配方及對應(yīng)極值點，即酵母粉、硫酸銨和甘油的質(zhì)量濃度依次為4.05，7.63，53.26 g/L，此時響應(yīng)面會達到一個最大值，即這時發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸有最高預(yù)測產(chǎn)量為0.807 g/L。

模型極值點的驗證：為了驗證在酵母粉，硫酸銨，甘油的質(zhì)量濃度依次為4.05，7.63，53.26 g/L 時的最大預(yù)測值，將此質(zhì)量濃度下的培養(yǎng)基進行3 次平行發(fā)酵，60 h 后測量發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的濃度，計算3 次平行發(fā)酵產(chǎn)量的平均值為0.724 g/L，與模型極值0.807 g/L 相差較小。此時實驗室搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)配方為酵母粉4.05 g/L，硫酸銨7.63 g/L，甘油53.26 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，硫酸鋅0.04 g/L，磷酸二氫鉀1.36 g/L，12 水磷酸氫二鈉3.58 g/L，pH=6.8。

表5 Box-Behnken 試驗設(shè)計表及其結(jié)果Tab.5 Box-Behnken experiments design and response values g/L

表6 回歸分析結(jié)果Tab.6 Results of regression equation analysis

圖10（a）和圖10（b）中可以看出在以甘油為中心點時硫酸銨和酵母粉的交互作用比較明顯。圖10（c）和圖10（d）中可以看出在以硫酸銨為中心點時甘油與酵母粉的交互影響顯得平緩，這可能是因為計算的步長較小導(dǎo)致的。圖10（e）和圖10（f）表明在以酵母粉為中心點時甘油與硫酸銨的交互影響也比較顯著。

圖10 響應(yīng)面三維圖與等高線圖：（a，b）酵母粉與硫酸銨對ε-聚賴氨酸產(chǎn)量交互影響，（c，d）酵母粉與甘油對ε-聚賴氨酸產(chǎn)量交互影響，（e，f）甘油與硫酸銨對ε-聚賴氨酸產(chǎn)量交互影響Fig.10 Three-dimensional response surface and contour plots：（a，b）effects of yeast powder and ammonium sulfate on ε-polylysine yield，（c，d）effects of yeast powder and glycerol on ε-polylysine yield，（e，f）effects of glycerol and ammonium sulfate on ε-polylysine yield

3 結(jié) 論

通過對該新菌株的生理生化的檢測以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分析表明該菌屬于白色鏈霉菌屬，經(jīng)過一系列發(fā)酵產(chǎn)物的分析檢測說明發(fā)酵產(chǎn)物為ε-聚賴氨酸，其分子量在5 000 Da 以下，與大部分的產(chǎn)ε-聚賴氨酸的菌株產(chǎn)物是一樣的，但是發(fā)酵產(chǎn)量屬于中等級別產(chǎn)量菌株。經(jīng)過單因素的實驗表明在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中最適合菌株生長的碳源均為甘油，在液體培養(yǎng)基中適合促進發(fā)酵ε-聚賴氨酸產(chǎn)生的最佳氮源為硫酸銨與酵母粉的混合氮源，無機氮源硫酸銨利于PH 的降低，有機氮源酵母粉利于菌株的大量繁殖，兩者共同作用于pH 與菌量的增長來共同促進產(chǎn)物的生成。響應(yīng)面的實驗結(jié)果確定了碳源和氮源的最適質(zhì)量濃度為酵母粉4.05 g/L，硫酸銨7.63 g/L，甘油53.26 g/L，該條件下的ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量為0.724 g/L，略低于模型值，這些數(shù)據(jù)對ε-聚賴氨酸測量，發(fā)酵罐小試，菌株的改造等后續(xù)內(nèi)容奠定了基礎(chǔ)。