高通量基因測序在血液腫瘤臨床應(yīng)用的質(zhì)量管理現(xiàn)狀及展望

吳祁生 王芳 聶代靜 周曉蘇 陳佳琦，劉紅星，，*

血液腫瘤是發(fā)生于造血或淋巴組織的具有高度異質(zhì)性的疾病，其臨床診療需要結(jié)合病理、血細胞形態(tài)、免疫表型、細胞遺傳、分子生物學(xué)和臨床表現(xiàn)進綜合分析。世界衛(wèi)生組織（world health or-ganization，WHO）的《造血與淋巴組織腫瘤分類》［1-2］與美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national compre-hensive cancer network，NCCN）的血液腫瘤臨床診療指南［3-5］都越來越多納入了具有臨床診斷分型和/或預(yù)后意義的基因變異指標，包括基因突變、融合基因及基因異常表達等。這些基因變異在血液腫瘤的診斷分型、預(yù)后分層、治療指導(dǎo)、微小殘留病監(jiān)測和耐藥突變監(jiān)測等方面有重要臨床應(yīng)用價值［1-5］。下一代高通量基因測序（next generation se-quencing，NGS）可一次對多個腫瘤相關(guān)基因、全外顯子或基因轉(zhuǎn)錄本進行檢測，具有通量高、靈敏度高、成本低等優(yōu)勢［6-7］。

血液腫瘤臨床診療對NGS 的應(yīng)用有著迫切的需求。相對于病理機制研究和治療手段的巨大進步，血液腫瘤的實驗室檢測嚴重滯后，尤其是NGS的應(yīng)用方面。不同于傳統(tǒng)的分子診斷技術(shù)，血液腫瘤NGS 技術(shù)流程復(fù)雜，除核酸提取、PCR 擴增、產(chǎn)物分析等步驟，還有文庫構(gòu)建、文庫富集和上機測序過程，更有測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析［8-9］。這套復(fù)雜的系統(tǒng)對“人、機、料、法、環(huán)”各方面的質(zhì)量管理和保證提出了更高的要求［10］。本文基于NGS 在血液腫瘤臨床應(yīng)用中的質(zhì)量管理要素現(xiàn)狀提出見解，并做以展望，以期為血液腫瘤NGS 臨床應(yīng)用的規(guī)范化起到正向作用。

1 “人”

NGS 技術(shù)操作步驟多、程序復(fù)雜，需不同崗位的專業(yè)人員分工協(xié)作，包括做“濕實驗”的操作人員、“干實驗”的生物信息分析人員和報告分析解讀人員等。雖然不同的崗位人員需要具備不同的技術(shù)能力，但又非截然分開，需要實驗室負責人統(tǒng)籌分配和崗位間的互相配合。國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心2019年白血病融合基因BCR-ABL1的室間質(zhì)評活動數(shù)據(jù)顯示，95%的做血液腫瘤基因檢測的實驗室為血液科自建實驗室［11］。

開展血液腫瘤NGS 檢測的實驗室應(yīng)配備獲得國家要求的相應(yīng)資質(zhì)的專業(yè)人員（如醫(yī)師、技師和研究員等系列），實驗室負責人或技術(shù)負責人應(yīng)有全面的NGS 知識和質(zhì)量管理能力，人員能力和數(shù)量應(yīng)滿足所開展檢測項目的要求。目前除少數(shù)血液病?？苹蛱厣t(yī)院外，血液科自建實驗室基本都存在專業(yè)人員配置和崗位資質(zhì)考核等方面的欠缺。另外，國家和行業(yè)層面尚無針對血液腫瘤NGS“濕/干實驗”的專業(yè)技術(shù)人員的能力評估和培訓(xùn)，臨床實驗室也欠缺相應(yīng)的制度。目前血液腫瘤NGS 檢測均是使用實驗室自建方法（laboratory developed tests，LDTs），“濕/干實驗”項目研發(fā)人員的短缺也是臨床實驗室常態(tài)。當前血液腫瘤NGS檢測專業(yè)技術(shù)人員的培養(yǎng)和儲備尚顯薄弱，有待進一步的行業(yè)建設(shè)和發(fā)展。

2 “機”

目前國內(nèi)使用的NGS 儀器主要為Illumina 測序平臺、Ion Torrent 半導(dǎo)體測序平臺和華大基因的CG 測序平臺［7］。除高通量基因測序儀外，開展血液腫瘤NGS 檢測的實驗室還應(yīng)配備滿足所開展檢測項目需求的其他儀器設(shè)備，如超凈臺、生物安全柜、純水儀、離心機、移液器、冰箱、PCR 儀和生物分析儀等。有能力開展血液腫瘤NGS 檢測的實驗室，應(yīng)根據(jù)所開展項目合理選擇測序平臺和相關(guān)輔助設(shè)備，還應(yīng)考慮標本類型、標本量、項目內(nèi)涵、所需測序通量、周轉(zhuǎn)時間等因素。

當前臨床實驗室購置的高通量測序儀，大多數(shù)為尚未經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局（national medical product administration，NMPA）批準的儀器，需要實驗室進行確認試驗，以證明可滿足臨床預(yù)期用途。同時，實驗室應(yīng)建立儀器使用、維護和校準程序，并在日常工作中例行維護和定期校準，以保證儀器設(shè)備的正常運行，儀器設(shè)備維護和校準應(yīng)保存相應(yīng)記錄［12］。

3 “料”

不同于實體腫瘤的取材困難，血液腫瘤的標本類型有骨髓、外周血和淋巴結(jié)等，樣本取材和保存相對容易，易獲得高質(zhì)量的核酸樣本。這對開展NGS 檢測是很大的優(yōu)勢。實驗室應(yīng)對樣本的采集容器、采集量、保存和運輸條件等進行確認，以保證樣本質(zhì)量、避免交叉污染。實驗室應(yīng)做好樣本不合格率、樣本容器錯誤率、標本類型錯誤率等質(zhì)量指標記錄［13］。只有采集到符合質(zhì)量要求的樣本，才能為后續(xù)的NGS“濕實驗”和得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)打好基礎(chǔ)。

在血液腫瘤領(lǐng)域，目前國內(nèi)尚無已通過NMPA 審批的成套的商品化NGS 檢測試劑。如何嚴謹負責地研發(fā)和建立LDTs 項目，并進行性能評價（包括性能確認和驗證），是開展NGS 項目的臨床實驗室必須解決的首要問題［14］。設(shè)計不合理或結(jié)果不可靠的LDTs 項目不僅不能發(fā)揮應(yīng)有的臨床價值，甚至可能造成NGS 推廣應(yīng)用的障礙。目前已有血液?？苹蛱厣珜嶒炇议_始積極進行LDTs 的性能確認工作，這是令人欣慰的事。但是對于大多數(shù)臨床實驗室，建立血液腫瘤NGS-LDTs 項目的全流程工作，包括項目設(shè)計、技術(shù)路線選擇和試劑性能評價等，仍然存在很大挑戰(zhàn)。由于高建設(shè)門檻，很多醫(yī)院沒有能力開展NGS 檢測項目，這部分檢測需求被轉(zhuǎn)移到有能力的第三方獨立實驗室。

4 “法”

開展血液腫瘤NGS 檢測，臨床實驗室應(yīng)通過試劑方法建立和性能確認的過程，建立及完善整個檢測系統(tǒng)（包括“干/濕”實驗流程），明確日常檢測的質(zhì)量控制標準及關(guān)鍵點，形成檢測操作全過程的標準程序文件，并明確檢測系統(tǒng)的性能指標和檢測局限性［15-16］。血液腫瘤NGS-LDTs 項目的全流程性能評價是人、機、料、法、環(huán)等要素的全面評價，相應(yīng)的指標包括精密度、準確度、分析敏感性、分析特異性和可報告范圍等［17-18］。

與其他實體腫瘤相比，血液腫瘤的發(fā)生率相對較低，臨床血液病實驗室可能在人力、物力和財力上得到的支持有限。因此，首先需要清楚本實驗室使用NGS 的臨床預(yù)期用途是什么？比如融合基因篩查對白血病的診療、危險度分層和預(yù)后判斷都有重要的意義，但用逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR 進行有限數(shù)量的融合基因篩查會漏檢未涵蓋在檢測范圍內(nèi)的融合基因，只能解決部分問題［19-20］。使用轉(zhuǎn)錄組基因測序（RNA sequencing，RNA-seq）［21］，可接近全面地分析血液腫瘤中各種可能存在的融合轉(zhuǎn)錄本，同時還能顯示基因變異的表達量［15］。如果將RNA-seq 融合基因篩查的LDTs 應(yīng)用于臨床檢測，就必須對該檢測系統(tǒng)進行性能評價，用客觀數(shù)據(jù)證實其可顯著提高融合基因篩查的陽性率。

除了性能評價外，血液腫瘤NGS 臨床檢測還面臨著無商品化室內(nèi)質(zhì)量控制品（internal quality control，IQC）和室間質(zhì)量評價計劃（external quali-ty assessment，EQA）的難題。臨床血液病實驗室需主動進行室內(nèi)質(zhì)量控制，以監(jiān)控每一次NGS 檢測結(jié)果，并且進行周期性評價，以保證檢測系統(tǒng)的精密度。有少數(shù)臨床血液病實驗室參加了國家衛(wèi)健委臨檢中心的“全國實體腫瘤體細胞突變高通量測序檢測室間質(zhì)量評價”項目，以考核所開展的NGS 項目的結(jié)果準確性。但是，血液腫瘤與實體腫瘤的體細胞突變頻率、樣本類型和處理方式均有很大不同，針對實體腫瘤設(shè)計的EQA 計劃并不完全適合血液腫瘤。臨床實驗室還可選擇與已獲得能力認可或使用相同測序平臺的外部實驗室進行NGS 項目的實驗室間比對，以達到能力驗證的目的。

5 “環(huán)”

開展血液腫瘤NGS 臨床檢測的實驗室應(yīng)根據(jù)擬開展的檢測項目數(shù)量、所用技術(shù)流程、測序平臺和標本量進行實驗室環(huán)境設(shè)計。實驗室應(yīng)至少設(shè)置5個功能區(qū)：試劑存儲和準備區(qū)、樣本與文庫制備區(qū)、文庫擴增與檢測區(qū)、上機測序區(qū)、數(shù)據(jù)分析和報告解讀區(qū)［12］。對開展測序深度及檢測限有很大差別的NGS 測序項目，實驗室宜設(shè)置不同的樣本制備和文庫制備區(qū)域，以防止交叉污染發(fā)生。實驗室環(huán)境需注意通風、潔凈度、溫濕度、震動和光照等要求，以保證儀器設(shè)備的正常運行和實驗過程的穩(wěn)定性。

6 小結(jié)和展望

血液腫瘤標本容易獲得，進行NGS 檢測有著先天的優(yōu)勢。自從“精準醫(yī)學(xué)（precision medi-cine）”的概念提出以來，血液腫瘤的精準醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用也走在各種腫瘤的前列。NGS 已在血液腫瘤臨床診療方面顯示出很好的應(yīng)用價值，例如：用RNA-seq 較為全面分析常見和少見型融合基因，用于血液腫瘤有明確意義的突變基因的靶向測序，用于指導(dǎo)個體化用藥的藥物基因組分析，用于血液腫瘤遺傳病基因突變篩查等。

NGS 提供了分析基因變異的強大工具，但檢測系統(tǒng)的復(fù)雜性增加了NMPA 審核的難度，限制了其落地臨床檢測的速度。建立和使用NGS-LDTs 是一種可行的方案，但應(yīng)堅持嚴格的考查和準入標準，即有明確的臨床預(yù)期用途，在臨床應(yīng)用中始終基于醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)和數(shù)據(jù)支持。國內(nèi)血液腫瘤和分子診斷領(lǐng)域的專家們已經(jīng)開始商討和制定一些NGS 在血液腫瘤應(yīng)用方面規(guī)范化的專家共識或?qū)＜医ㄗh，這將有助于促進NGS 技術(shù)在臨床診療中的規(guī)范化應(yīng)用。