基于網(wǎng)絡藥理學結(jié)合細胞和分子實驗探究紫草素抗鼻咽癌的作用機制

郭興喆，白先愚，楊萌哲，成南南，徐寧，周守常，覃柳潔，焦愛軍

（1.廣西醫(yī)科大學 生命科學研究院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學 生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學 藥學院，廣西 南寧 530021）

0 引言

在我國，鼻咽癌是南方地區(qū)是最常見的惡性腫瘤之一[1]，全世界有超半數(shù)的鼻咽癌患者發(fā)生在中國，在西方學術(shù)界有“中國癌”之稱[2]。在廣西，鼻咽癌是排位在第四位的惡性腫瘤，近些年來，發(fā)病年齡趨于年輕化。醫(yī)院就診患者中大多數(shù)是中晚期，治療效果不好，20年前的5年生存率只有60%左右[3]。對于局部進展期鼻咽癌患者，目前以順鉑為基礎(chǔ)同步進行放化療作為標準治療。然而在化療過程中，部分患者對化療藥物耐受性差需降低化療劑量以降低藥物毒性甚至暫停治療。為了保證能夠按時完成治療，需探索新的同步化療藥物，減少治療期間的毒副反應的同時保證療效[4]。

紫草素是一種天然有機物，化學式為C16H16O5，英文名稱為Shikonin，是從天然植物宗阜根中提煉的紫紅色萘醌類化合物，具有滅菌、消炎、抗癌等作用。臨床用于治療肝硬化伴腹水以及急、慢性肝炎，局部還可應用修復傷口，促進創(chuàng)面瘢痕形成。有研究表明紫草素介導的PD-L1降解是通過下調(diào)NF-κB/CSN5和NF-κB/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達達到抗胰腺癌的作用[5]。這表明紫草素是良好的抗癌中藥單體。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法來分析預測紫草素對鼻咽癌的潛在靶點及相關(guān)信號通路，再通過實驗驗證其預測結(jié)果的有效性，從而為將來的臨床研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基于網(wǎng)絡藥理學的機制預測

1.1.1 化合物及鼻咽癌靶點的查詢及篩選

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索關(guān)鍵詞Shikonin得到其3D機構(gòu)圖，將3D結(jié)構(gòu)圖導入至Pharmmapper數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.htmL）中篩得到紫草素相關(guān)靶點。通過GeneCards數(shù) 據(jù) 庫（http://www.genecards.org/）搜索得到鼻咽癌相關(guān)靶點。通過venn在線平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制藥物和疾病靶點交集圖。

1.1.2 紫草素與鼻咽癌靶點PPI（protein-protein interaction）的網(wǎng)絡可視化構(gòu)建及分析

通過String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）將Venn圖取交集得到的基因輸入到String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。把得到的PPI網(wǎng)絡輸入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化。通過軟件中的Network Analysis plugin功能對可視化圖中的節(jié)點進行統(tǒng)計，并根據(jù)Degree值的大小而區(qū)分節(jié)點的生物功能。

1.1.3 GO功能和KEGG pathway 通路富集

通過David數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對紫草素與鼻咽癌靶點交集進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，用以說明相關(guān)靶點在基因功能和信號通路中的作用。GO功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）。通過在線作圖平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對富集分析結(jié)果進行可視化處理。

1.1.4 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡圖構(gòu)建

整合紫草素抗鼻咽癌的交集靶點和KEGG富集分析結(jié)果，并導入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建制作“化合物-疾病-靶點-通路”關(guān)系網(wǎng)絡圖。

1.2 實驗驗證

1.2.1 CCK-8法驗證紫草素對鼻咽癌細胞增殖的抑制作用

采用CCK-8法評價紫草素對CNE2 細胞增殖抑制作用，取在對數(shù)生長期的CNE2 細胞，用0.25%含EDTA的胰酶進行消化處理，重懸為單細胞懸液，以5000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁12 h，小心地吸出培養(yǎng)液，分別加入含紫草素的培養(yǎng)基100μL，濃度設為4umol/L，每組設3個復孔。在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24、48、72 h 后，吸出含紫草素的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，按照CCK-8使用說明書，每孔加入 100μL RPMI-1640 培養(yǎng)基和10μL CCK-8，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育80 min。用酶標儀檢測在450nm 波長下各孔的光密度（A），計算實驗組紫草素對細胞的抑制率并繪制細胞抑制率曲線。實驗重復3次。

細胞生存率＝(A 紫草素-A 空白)/(A 對照-A空白)

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期的CNE-2細胞，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×105/mL 接種于6孔板，每孔1.5mL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24h，藥物分組處理細胞結(jié)束后，收集細胞，各實驗組細胞用預冷的PBS緩沖液清洗3次，收集細胞后，加入預冷的細胞裂解液裂解細胞，混勻，超聲破碎細胞；細胞液于4℃以12000r/min，離心15min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中并用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDSPAGE電泳150V恒壓70min，WB 濕轉(zhuǎn)(0.45μm的PVDF膜) 270mA恒流65h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST漂洗3次后分別加入相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，室溫二抗反應1h，TBST漂洗3次后進行ECL顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，以內(nèi)參作對照，計算各處理組目的蛋白的表達情況。

1.2.3 統(tǒng)計學處理

通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，兩樣本均數(shù)比較使用t檢驗，組間均數(shù)比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡藥理學機制預測

2.1.1 紫草素潛在靶點預測

通過PubChem 分子庫獲得紫草素3D結(jié)構(gòu)。見圖1。將3D結(jié)構(gòu)導入至Pharmmapper數(shù)據(jù)庫中篩得到紫草素靶點并通過Uniplot數(shù)據(jù)庫取得基因名進行進一步校正，按照Norm Fit排序，選取前10個基因名稱和靶點。見表1。

表1 紫草素排名前十的潛在靶點

圖1 紫草素的3D結(jié)構(gòu)

2.1.2 紫草素與鼻咽癌相關(guān)的共同靶點

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得與鼻咽癌相關(guān)的基因靶點共有 1929個。將1929個鼻咽癌相關(guān)基因與184個藥物靶點基因取交集篩選出共同靶點109個，確定其為紫草素抗鼻咽癌的潛在靶點基因。見圖2。

圖2 紫草素抗鼻咽癌的潛在靶點

2.1.3 紫草素與鼻咽癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡

從分析蛋白來看，PPI 網(wǎng)絡是了解疾病中多種復雜蛋白質(zhì)相互交聯(lián)功能的基礎(chǔ)。因此，構(gòu)建了紫草素與鼻咽癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡。將109個交集靶點導STRING數(shù)據(jù)庫，獲得紫草素-鼻咽癌靶點蛋白質(zhì)互作信息，通過 cytoscage 3.6.1 軟件，獲得蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖。見圖3。

圖3 紫草素抗鼻咽癌PPI網(wǎng)絡圖

圖4 紫草素抗鼻咽癌GO功能富集分析

該網(wǎng)絡布局是根據(jù)節(jié)點的度值從小到大梯度按逆時針排序，黃色節(jié)點代表紫草素在鼻咽癌中的潛在靶點，內(nèi)部節(jié)點之間的線顯示不同蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系，度值最高的前70個節(jié)點。其中該網(wǎng)絡中度值最高的靶點為MAPK1，度值為63，其次為SRC、AKT1、MAPK14、ESR1、HSP90AA1、MAPK8、CASP3、IGF1、JAK2等，這些度值較高的靶蛋白可能是紫草素抗鼻咽癌的關(guān)鍵靶點。

2.1.4 GO 功能富集注釋

將疾病和藥物交集的 51 個共同靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，根據(jù)P≤0.01，共篩選出478個GO條目。包括 40條細胞組成(cellular component,CC)、74條分子功能(molecular function,MF）和364條生物過(biological process,BP)。結(jié)果表明，涉及蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性、AP結(jié)合蛋白、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、同蛋白結(jié)合蛋白、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、內(nèi)肽酶、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等分子功能；涉及多項生物調(diào)控機制，包括凋亡過程的負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、缺氧反應、蛋白質(zhì)水解、細胞遷移的正調(diào)控、MAPK級聯(lián)、信號轉(zhuǎn)導等生物過程；涉及細胞核、細胞質(zhì)、核質(zhì)等細胞組成。推測紫草素治療鼻咽癌可能與蛋白激酶活性、激酶活性、細胞因子活性、AP結(jié)合蛋白等物質(zhì)活性有關(guān)，涉及凋亡過程的負調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。

2.1.5 KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，共富集得到89條通路。根據(jù)P值排序，篩選出與鼻咽癌相關(guān)度最高的前16條通路。富集結(jié)果顯示在癌癥信號通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)等通路上富集較多。見圖5。

圖5 紫草素抗鼻咽癌KEGG富集結(jié)果

2.1.6 構(gòu)建紫草素抗鼻咽癌的“藥物-靶點-疾病-通路”網(wǎng)絡模型

構(gòu)建“藥物-靶點-疾病-通路”網(wǎng)絡模型，可直觀的展示紫草素與鼻咽癌靶點及通路之間的相互作用以及關(guān)鍵途徑。見圖6。圖中左側(cè)40個黃色節(jié)點代表紫草素抗鼻咽癌交集的靶點，根據(jù)節(jié)點的degree值按逆時針從小到大梯度排列，右側(cè)16個綠色節(jié)點則對應了KEGG富集結(jié)果中的16條通路，節(jié)點之間的連線顯示不同靶點與通路之間相互作用關(guān)系，涉及的關(guān)鍵基因包括：MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8、EGFR、IGF1R、IGF1、MAPK14等。

圖6 “藥物－靶點－疾?。贰本W(wǎng)絡圖

2.2 實驗驗證

2.2.1 CCK8細胞毒性實驗

結(jié)果如圖7所示，與對照組比較，CNE2細胞增殖抑制率隨著紫草素濃度的升高及作用時間的延長明顯升高，作用24、48、72h的半抑制濃度（IC50）分別為5.48、4.76、2.36μmol/L。

圖7 紫草素對鼻咽癌CNE2增殖的影響

2.2.2 Western blot實驗檢測紫草素對p-ERK和ERK蛋白表達的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，4μmol/L濃度的紫草素實驗組ERK和p-ERK表達量顯著低于空白對照組（P<0.01）。見圖8。

圖8 紫草素對CNE-2細胞MAPK/ERK信號通路通路蛋白的影響

3 討論

中藥單體在腫瘤治療中所突出的顯著療效，使得近些年來在中藥單體對相關(guān)腫瘤防止的研究上成為熱門焦點[6]，是未來的研究方向和新的探索領(lǐng)域。新近的相關(guān)研究表示，紫草素對多種癌癥腫瘤均有顯著的抑制作用[7-9]，其在抑制鼻咽癌細胞增殖也有了一些研究成果，如邢亮等[10]使用紫草素作用于人胚鼻咽上皮HNE2細胞和鼻咽癌CNE2細胞后，實驗結(jié)果顯示紫草素可明顯抑制HNE2細胞和鼻咽癌CNE2細胞株的增殖。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學進行深入研究，先通過預測紫草素抗鼻咽癌作用靶點，分析其潛在的信號通路和生物過程，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病-通路”模型，推測出紫草素抗鼻咽癌的作用機制，最后對預測結(jié)果進行相關(guān)實驗驗證。紫草素“藥物-靶點-疾病-通路”網(wǎng)絡顯示MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8等度值相對較高，是紫草素治療鼻咽癌的潛在靶點，結(jié)合KEGG通路富集分析顯示MAPK/ERK信號通路是紫草素作用于鼻咽癌的關(guān)鍵通路。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在多數(shù)人體細胞中都存在，通過把細胞外化學信號傳遞至細胞，引起細胞內(nèi)部一系列生物學反應，如細胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等過程，具有十分關(guān)鍵的作用。MAPK/ERK信號通路參與細胞分化、增殖、凋亡和血管生成等調(diào)節(jié)，在肝癌、結(jié)直腸和子宮內(nèi)膜癌[11-14]等多種癌癥發(fā)揮關(guān)鍵作用，是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路之一。在MAPK/ERK信號通路中，ERK蛋白是極其重要的通路蛋白之一，ERK蛋白是絲/蘇氨酸激酶，可以通過磷酸化絲/蘇氨酸發(fā)揮生物學作用。ERK蛋白在絲裂原刺激作用下接受上游分子的級聯(lián)信號，然后通過轉(zhuǎn)位進入胞核。此外，ERK蛋白除了可以磷酸化胞質(zhì)蛋白外，還可以磷酸化部分核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如c-myc、ATF2、c-fos、c-Jun、Elk-1分子等，從而調(diào)控細胞的增殖、凋亡、分化等生物學活動。因而ERK1和ERK2蛋白在MAPK/ERK信號通路處于信息傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其表達水平的下調(diào)，可直接影響細胞的增殖和凋亡。鄭懿等人[15]的研究表示可通過下調(diào) CCND1 基因的表達來抑制 ERK/MAPK 信號通路從而增進細胞的凋亡，對宮頸癌化療敏感性的提高有明顯作用；楊瑋蔚[16]等的研究也表示RACK1可通過激活ERK1/2信號通路，抑制食管鱗癌Eca109細胞株的增殖，促進其凋亡，對食管癌的發(fā)生發(fā)展有更進一步的價值。因此本研究通過Western blot實驗驗證這條可能性最大的通路，顯示出了紫草素對ERK1和ERK2蛋白表達具有制作用，證實通過網(wǎng)絡藥理學的預測，紫草素對鼻咽癌通過MAPK/ERK信號通路發(fā)揮作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學靶點通路預測結(jié)合細胞實驗、分子實驗等對紫草素治療鼻咽癌進行了系統(tǒng)性的比較分析，通過實驗發(fā)現(xiàn)了紫草素對鼻咽癌的抑制作用并驗證了其作用機制，為之后鼻咽癌的臨床治療及實驗研究提供了依據(jù)和方向。