熒光染色與過碘酸希夫染色對真菌性角膜炎診斷效果的比較

杜滿 張莉 李鵬 齊洪梅 鹿秀海

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 山東省眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，濟(jì)南 250021

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是一種嚴(yán)重的致盲眼病，常有植物外傷史。目前FK組織病理學(xué)檢查主要采用的染色方法為蘇木精-伊紅染色和特殊染色。蘇木精-伊紅染色在大部分真菌不著色，診斷比較困難，主要用于觀察角膜受感染的病理變化。因此特殊染色在真菌感染診斷中十分必要[1]。過碘酸希夫染色可使真菌細(xì)胞壁顯示紅色，利于觀察，這種方法可顯示大部分真菌。但是在日常工作中發(fā)現(xiàn)，某些FK的病原菌在過碘酸希夫染色中會著色不良或者不著色，且容易與變性的基質(zhì)纖維混淆，另外，在檢查角膜病灶切除標(biāo)本或者菌絲含量較少的組織時易漏診。隨著熒光顯微鏡的普及，熒光染色也被應(yīng)用到真菌的檢測和診斷中，熒光染色液能與真菌細(xì)胞壁的纖維素、幾丁質(zhì)和其他含β-1，4-糖苷鍵的碳水化合物緊密結(jié)合，在紫外激發(fā)光(UA濾鏡)下菌絲細(xì)胞壁及孢子細(xì)胞壁均呈亮藍(lán)綠色，背景呈黑色，真菌的形態(tài)特征十分清晰，不易漏診[2]。國外實驗室早已將熒光顯微鏡用于FK等疾病病原真菌的檢測[3]，但國內(nèi)尚未將此檢查作為常規(guī)的檢查方法，而且一些特殊菌種所致的FK，過碘酸希夫染色效果較差，容易漏診。本研究對臨床上采集的FK標(biāo)本分別進(jìn)行熒光染色和過碘酸希夫染色，比較2種方法的診斷效率。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月至2019年5月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院就診且角膜刮片或真菌培養(yǎng)陽性的FK患者147例的角膜標(biāo)本147份，其中行穿透角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty，PKP)患者84例，板層角膜移植術(shù)(lamellar keratoplasty，LKP)患者42例，病灶切除患者21例。147例患者中有146例行角膜刮片病原學(xué)檢查均為陽性，1例未行角膜刮片檢查，同時所有標(biāo)本均行真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查。選取11例單純皰疹病毒性角膜炎活檢組織作為陰性對照。本研究經(jīng)山東省眼科醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：SDSYKYY-2016012)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

角膜組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明和浸蠟，4 μm厚切片，切片經(jīng)二甲苯充分脫蠟至水。標(biāo)本除行常規(guī)蘇木精-伊紅染色外，再分別進(jìn)行真菌熒光染色和過碘酸希夫染色。

1.2.1真菌熒光染色 直接向標(biāo)本上滴加1滴真菌熒光染色液(江蘇諾鬲生物科技有限公司)，染色液以覆蓋或淹沒整個標(biāo)本為準(zhǔn)，使染料與標(biāo)本充分結(jié)合，持續(xù)染色1 min；蓋上蓋玻片，吸去多余染液。熒光顯微鏡下真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光。

1.2.2過碘酸希夫染色 向標(biāo)本上滴加1滴過碘酸染色10 min，水洗，希夫染液(糖原染色試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)避光浸染20 min，傾去染液，直接滴加偏重亞硫酸鈉作用1 min，共2次，流水沖洗10 min，蘇木素淡染，脫水、透明、封固。置于光學(xué)顯微鏡下觀察，真菌菌絲和孢子呈紫紅色染色為陽性染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。本研究中計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示。2種染色方法陽性率的比較，以及不同手術(shù)方式切除FK角膜組織2種染色方法的陽性率比較均采用配對卡方檢驗(McNemar's test)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真菌熒光染色及過碘酸希夫染色鏡下特點

真菌熒光染色組織標(biāo)本菌絲結(jié)構(gòu)清晰，可見橫隔、分枝，角膜基質(zhì)呈淡藍(lán)色，背景呈黑色。過碘酸希夫染色角膜基質(zhì)呈粉紅色(圖1)。

圖1 真菌過碘酸希夫染色和熒光染色鏡下特點 A：真菌菌絲和孢子呈紫紅色，角膜基質(zhì)呈粉紅色(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：熒光染色可見真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光，菌絲結(jié)構(gòu)清晰，可見橫隔、分枝，角膜基質(zhì)呈淡藍(lán)色，背景呈黑色(×400，標(biāo)尺=100 μm)Figure 1 Fungal samples after periodic acid Schiff staining and fluorescence staining under fluorescence microscope A:PAS stained fungal hyphae and spores were purplish red,and corneal stroma was pink (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,fungal hyphae and spores were bright blue-green fluorescence,and mycelial structure was clear to see transverse septum and branches,and corneal stroma was light blue,and background was black (×400,bar=100 μm)

2.2 真菌熒光染色與過碘酸希夫染色的陽性率比較

過碘酸希夫染色的陽性率為60.5%(89/147)，真菌熒光染色的陽性率為79.6%(117/147)，熒光染色法診斷FK的陽性率高于過碘酸希夫染色法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.00，P<0.01)(表1)，2種染色方法的特異性均為100%。PKP手術(shù)切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為85.7%(72/84)，過碘酸希夫染色的陽性率為65.5%(55/84)，熒光染色的陽性率明顯高于過碘酸希夫染色，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.00，P<0.01)；LKP手術(shù)切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為71.4%(30/42)，過碘酸希夫染色的陽性率為52.4%(22/42)，熒光染色的陽性率明顯高于過碘酸希夫染色，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.00，P<0.01)；病灶切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為71.4%(15/21)，過碘酸希夫染色的陽性率為57.1%(12/21)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.30，P=0.25)(表2)。11例陰性對照行熒光染色和過碘酸希夫染色結(jié)果均為陰性。

表1 2種染色方法診斷FK的結(jié)果比較Table 1 Comparison of the diagnostic results of FK by two staining methods染色方法總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)過碘酸希夫染色1478958熒光染色14711730χ2值28.00P值<0.01 注:(配對卡方檢驗) FK:真菌性角膜炎 Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis

表2 不同手術(shù)方式切除FK角膜組織2種染色方法的陽性率比較Table 2 Comparison of the positive rates of two staining methods for resected corneal tissue with FK by different surgical methods染色方法PKPLKP病灶切除總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)過碘酸希夫染色84552942222021129熒光染色84721242301221156χ2值17.008.001.30P值<0.01<0.010.25 注:(配對卡方檢驗) FK:真菌性角膜炎;PKP:穿透角膜移植術(shù);LKP:板層角膜移植術(shù) Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis;PKP:pentrating keratoplasty;LKP:lamellar keratoplasty

2.3 不同真菌菌株標(biāo)本間真菌熒光染色與過碘酸希夫染色的比較

真菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本共119例，陽性率為81.0%(119/147)。經(jīng)鑒定共23種(屬)真菌，較常見的真菌有黃曲霉復(fù)合群、茄病鐮刀菌復(fù)合群、層生鐮刀菌和鏈格孢霉，分別占31.9%(38/119)、17.6%(21/119)、10.1%(12/119)和9.2%(11/119)。不同菌種所致角膜真菌感染的標(biāo)本熒光染色和過碘酸希夫染色的陽性例數(shù)不同，其中茄病鐮刀菌復(fù)合群、譎詐腐霉菌、煙曲霉復(fù)合群、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌熒光染色的陽性例數(shù)分別為19、5、5、1、1和1例，過碘酸希夫染色的陽性例數(shù)分別為11、0、3、0、0和0例。譎詐腐霉、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌行過碘酸希夫染色均未見菌絲或孢子，其中譎詐腐霉感染的角膜可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞，譎詐腐霉經(jīng)熒光染色后，可見平行于角膜基質(zhì)內(nèi)生長的菌絲，菌絲較粗且分支少，菌絲的熒光較其他菌種弱。煙曲霉復(fù)合群、刺盤孢和構(gòu)巢曲霉行過碘酸希夫染色后，菌絲染色較淡且結(jié)構(gòu)欠清晰，較易漏診，而經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強，形態(tài)特征明顯、清晰，不易漏診(表3,圖2)。

表3 FK的真菌培養(yǎng)、過碘酸希夫染色及熒光染色結(jié)果比較Table 3 Comparision of fungal culture,periodic acid Schiff staining and fluorescence staining results in FK真菌感染類型總例數(shù)不同方法檢測真菌感染的陽性標(biāo)本例數(shù)過碘酸希夫染色熒光染色黃曲霉復(fù)合群382729茄病鐮刀菌復(fù)合群211119層生鐮刀菌1279鏈格孢霉1199譎詐腐霉菌505煙曲霉復(fù)合群535鐮刀菌屬434輪枝鐮刀菌444刺盤孢323近平滑念珠菌222肉色鐮刀菌222構(gòu)巢曲霉111季也蒙假絲酵母101尖端賽多孢111離孺孢霉100木霉101鋪葉沼蘭褐鶯真菌101雙胞鐮刀菌111藤倉鐮刀菌復(fù)合群111新月彎孢霉100中介彎孢霉111帚枝霉111無孢霉100合計11976100 注:FK:真菌性角膜炎 Note:FK:fungal keratitis

圖2 不同菌株的PAS和熒光染色結(jié)果 A：譎詐腐霉感染的角膜可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：譎詐腐霉經(jīng)熒光染色后，可見平行于角膜基質(zhì)內(nèi)生長的菌絲，菌絲較粗分支少，菌絲的熒光較弱(×400，標(biāo)尺=100 μm) C：煙曲霉復(fù)合群經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) D：煙曲霉復(fù)合群經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm) E：刺盤孢經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) F：刺盤孢經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm) G：構(gòu)巢曲霉經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) H：構(gòu)巢曲霉經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm)Figure 2 PAS staining and fluorescence staining results of different strains A:More round or long strip spaces parallel to the corneal stroma were observed in the cornea infected by Pythium insidiosum,and infiltrated inflammatory cells were fewer in the tissue (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the hyphae of Pythium insidiosum growing parallel to the corneal stroma had few thick branches and weak fluorescence (×400,bar=100 μm) C:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus fumigatus complex was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the hyphae fluorescence of Aspergillus fumigatus complex was strong,and the morphological characteristics were obvious and clear (×400,bar=100 μm) E:After PAS staining,the hyphae staining of Colletotrichum was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the hyphae of Colletotrichum had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm) G:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus nidulans was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the hyphae of Aspergillus nidulans had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm)

2.4 真菌與其他物質(zhì)的鑒別診斷

熒光染色液除與真菌細(xì)胞壁的成分結(jié)合生成復(fù)合物，在紫外激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光外，病變角膜組織中的炎癥細(xì)胞、變性的膠原纖維、活化的角膜基質(zhì)細(xì)胞以及切片上的雜質(zhì)均可與熒光染液結(jié)合，產(chǎn)生強弱不等的熒光。角膜組織中浸潤的炎癥細(xì)胞需與念珠菌的孢子相鑒別，后者體積較大，一般在基質(zhì)層間成簇分布，產(chǎn)生的熒光比炎癥細(xì)胞強且孢子壁的熒光強于孢子中央，而炎癥細(xì)胞的表現(xiàn)卻相反，中間的細(xì)胞核呈現(xiàn)較明亮的熒光，細(xì)胞膜的熒光不明顯，結(jié)合常規(guī)蘇木精-伊紅染色則較容易識別炎癥細(xì)胞。感染性角膜組織基質(zhì)纖維變性、水腫、排列紊亂，此時變性的膠原纖維也可與熒光染液結(jié)合發(fā)出熒光，鏡下表現(xiàn)為異常彈性樣組織的圈狀或絲狀熒光，但此結(jié)構(gòu)為實心，未見分隔，與真菌呈中空的菌絲壁不同，而且比真菌菌絲細(xì)。角膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核呈長橢圓形，細(xì)胞質(zhì)少，常位于板層纖維間，與板層纖維平行排列，基質(zhì)細(xì)胞的熒光強度比真菌弱，對照常規(guī)蘇木精-伊紅染色切片容易區(qū)別。熒光染色制片過程中，可能混入棉絮或其他纖維性雜質(zhì)，此時雜質(zhì)與熒光染液結(jié)合常發(fā)出強烈的熒光，亮度強于真菌菌絲，但根據(jù)熒光物質(zhì)的形態(tài)及其與組織標(biāo)本的關(guān)系一般可以做出判斷(圖3)。

圖3 真菌與其他物質(zhì)的鑒別診斷 A：角膜組織中浸潤的炎癥細(xì)胞(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：熒光染色可見炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)比較明亮的熒光，細(xì)胞膜的熒光不明顯(×400，標(biāo)尺=100 μm) C：念珠菌在角膜基質(zhì)間成簇分布，體積比炎癥細(xì)胞大(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) D：熒光染色可見念珠菌的熒光比炎癥細(xì)胞強且孢子壁的熒光強于孢子中央(×400，標(biāo)尺=100 μm) E：變性的角膜基質(zhì)纖維，纖維排列紊亂(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) F：熒光染色可見變性的膠原纖維與熒光染液結(jié)合，鏡下表現(xiàn)為異常彈性樣組織的圈狀或絲狀熒光(×400，標(biāo)尺=100 μm) G：角膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核呈長橢圓形，細(xì)胞質(zhì)少(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) H：熒光染色可見基質(zhì)細(xì)胞熒光較真菌弱(×400，標(biāo)尺=100 μm) I：熒光染色可見制片過程中混入的纖維性雜質(zhì)，雜質(zhì)與熒光染液結(jié)合發(fā)出強烈的熒光，亮度強于真菌菌絲(×200，標(biāo)尺=200 μm)Figure 3 Antidiastole of fungi and other substances A:Infiltrated inflammatory cells in corneal tissue (HE ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the nucleus of inflammatory cells showed bright fluorescence,but the fluorescence of cell membrane was not obvious (×400,bar=100 μm) C:Candida showed cluster distribution among the corneal stroma,and the volume of Candida was larger than the inflammatory cells (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the fluorescence of Candida was stronger than the inflammatory cells,and the fluorescence of the spore wall of Candida was stronger than that of spore centre (×400,bar=100 μm) E:Denatured corneal stroma fibers with a disordered fiber arrangement (HE ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the denatured collagen fiber bounded to the fluorescence dye and appeared as abnormal elastic tissue with a circular or filamentous fluorescence under microscope (×400,bar=100 μm) G:The nucleus of corneal stroma cells was long oval and the cytoplasm was little (HE ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the fluorescence of stroma cells was weaker than fungi (×400,bar=100 μm) I:After fluorescence staining,the fibrous impurities that mixed in the preparation process showed strong fluorescence after combination with the fluorescence dye,and the fluorescence was stronger than the fungal hyphae (×200,bar=200 μm)

3 討論

隨著FK臨床診療經(jīng)驗的積累和實驗室檢查技術(shù)的提高，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有70多種真菌可引起角膜感染[4]，在不同國家及地區(qū)引起FK的菌種差別較大，氣候寒冷地區(qū)及發(fā)達(dá)國家以白念珠菌為主，氣候溫暖或炎熱地區(qū)及發(fā)展中國家以鐮刀菌和曲霉菌為主[5]。本研究中共有147例FK患者行真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性119例，陽性率為81.0%，較常見的致病菌為黃曲霉復(fù)合群、茄病鐮刀菌復(fù)合群、層生鐮刀菌及鏈格孢霉，與以往報道基本一致[6]。

如何快速、準(zhǔn)確地診斷FK對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。角膜刮片氫氧化鉀(KOH)濕片檢查和真菌培養(yǎng)是較常用的實驗室檢查方法，KOH濕片檢查方法簡單，通過刮取病變處角膜組織后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的KOH溶解雜質(zhì)，于光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示陽性率為60.0%～81.0%[7-11]，但受限于角膜取材質(zhì)量及檢查人員的診斷水平，存在一定的假陰性結(jié)果，而且對于角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)的真菌性角膜感染，由于病灶位于角膜深層，表層刮片一般找不到真菌。真菌培養(yǎng)是診斷角膜真菌感染較可靠的方法，不僅可以明確真菌感染，還可以對菌種進(jìn)行鑒定和藥敏分析，但真菌培養(yǎng)的陽性率偏低，約為50%[12-14]，而且培養(yǎng)時間長。激光掃描共焦顯微鏡是一種無創(chuàng)性、高分辨率的活體檢查方法，其分辨率理論上可達(dá)1 μm，可以在細(xì)胞水平上對角膜進(jìn)行觀察，在診斷角膜疾病中得到廣泛應(yīng)用[15-16]，但是病變進(jìn)展以及抗真菌藥物的應(yīng)用可使菌絲變得不典型，從而影響診斷的準(zhǔn)確性。

病理檢查是疾病診斷的重要方法，組織病理學(xué)常規(guī)染色方法對真菌著色能力差，常難以分辨，在日常工作中常利用特殊染色來幫助識別真菌。過碘酸希夫染色是常用的特殊染色方法，其原理是過碘酸氧化真菌細(xì)胞壁上的多糖，使醛基游離，無色品紅可與游離的醛基結(jié)合生成復(fù)合物而被顯色。真菌熒光染色液利用特異性的熒光標(biāo)志物共價結(jié)合在β-糖苷基團(tuán)，形成β多糖-熒光素復(fù)合物并發(fā)出特異熒光[17]。真菌細(xì)胞壁所含的多糖類物質(zhì)，如幾丁質(zhì)和葡聚糖，是一類典型的β-型多糖，熒光素與真菌細(xì)胞壁的多糖特異性結(jié)合，形成強的熒光復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察，可以清晰地顯示真菌的形態(tài)。本研究中所使用的真菌熒光染色液操作簡單、省時，石蠟組織標(biāo)本充分脫蠟后滴加1滴熒光染液，1 min后便可在熒光顯微鏡下觀察到染色結(jié)果。本研究中收集的147例真菌感染角膜組織分別行過碘酸希夫染色和熒光染色，結(jié)果顯示熒光染色法診斷FK的陽性率高于過碘酸希夫染色法，與閻艷等[18]的研究結(jié)果一致。真菌熒光染色法可以快速、準(zhǔn)確地診斷FK，對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

真菌感染所致的角膜潰瘍由于菌絲侵犯角膜深度不同會采取不同的手術(shù)方式，本研究中根據(jù)不同手術(shù)方式分為PKP標(biāo)本、LKP標(biāo)本和病灶切除標(biāo)本。本研究結(jié)果顯示，不同手術(shù)方式切除的標(biāo)本應(yīng)用熒光染色更容易識別組織中的少量菌絲，染色后與背景對比鮮明，容易辨別，彌補了過碘酸希夫染色法在菌絲含量較少時敏感性低的不足。

過碘酸希夫染色法可以顯示大部分的真菌[19]，但是我們在日常工作中發(fā)現(xiàn)部分真菌會出現(xiàn)染色不良或者不著色的情況。本研究中真菌培養(yǎng)結(jié)果陽性者為119例，通過研究不同菌種過碘酸希夫染色和熒光染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄病鐮刀菌復(fù)合群、譎詐腐霉、煙曲霉復(fù)合群、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌行熒光染色的陽性例數(shù)明顯高于過碘酸希夫染色，其中譎詐腐霉、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌過碘酸希夫染色均未檢出菌絲或孢子。本研究中譎詐腐霉所致的FK共5例，過碘酸希夫染色均未著色，可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞，熒光染色可顯示真菌的形態(tài)，但是菌絲的熒光較其他菌種弱，這可能與細(xì)胞壁中缺乏幾丁質(zhì)有關(guān)[20]。煙曲霉復(fù)合群、刺盤孢和構(gòu)巢曲霉行過碘酸希夫染色后雖然可以觀察到菌絲，但是菌絲染色較淡且結(jié)構(gòu)欠清晰，較易漏診，經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強，形態(tài)特征明顯、清晰，不易漏診。由此可見，真菌熒光染色可彌補過碘酸希夫染色的不足，提高真菌的檢出率。但熒光染色液不僅可以與真菌細(xì)胞壁結(jié)合發(fā)出熒光，還可以與組織中的其他成分結(jié)合產(chǎn)生強弱不等的熒光，所以在診斷FK時需要仔細(xì)辨別，可以結(jié)合過碘酸希夫染色或蘇木精-伊紅染色結(jié)果綜合判斷分析。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示熒光染色診斷FK的敏感性高，特異性強，判斷直觀且操作簡便，對目前絕大多數(shù)FK致病菌種有良好的染色效果，熒光顯微鏡的普及可以使該方法得到進(jìn)一步的推廣。由于不同真菌菌株的標(biāo)本量有限，無法對不同真菌菌株標(biāo)本間2種染色的陽性率進(jìn)行統(tǒng)計分析，后期還需增大樣本量進(jìn)一步驗證。熒光染色法對其他病原體感染導(dǎo)致的角膜炎是否有診斷價值仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突