不同基因型毛白楊同源重組變異研究

耿喜寧，蘆特，杜康，楊珺，康向陽

研究報告

不同基因型毛白楊同源重組變異研究

耿喜寧1,2,3,4，蘆特1,2,3，杜康1,2,3，楊珺1,2,3，康向陽1,2,3

1. 北京林業(yè)大學(xué)，北京市林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083 2. 北京林業(yè)大學(xué)，林木育種國家工程實驗室，北京 100083 3. 北京林業(yè)大學(xué)，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083 4. 平頂山學(xué)院，河南省生態(tài)經(jīng)濟型木本植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，平頂山 467000

同源重組是生物遺傳變異的重要來源。受檢測方法限制，高等植物同源重組發(fā)生及其產(chǎn)物——異源雙鏈DNA(heteroduplex DNA, hDNA)鮮有報道。本研究采用構(gòu)建抑制減數(shù)后分離群體檢測同源重組產(chǎn)物hDNA的方法，以2個母本來源的基于抑制減數(shù)后分離獲得的毛白楊()雜種三倍體群體為研究材料，利用篩選出的110個簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記開展毛白楊不同基因型個體間9條染色體上hDNA發(fā)生及其遺傳變異研究。結(jié)果表明，2個毛白楊雌株hDNA發(fā)生頻率介于8.5%~87.2%之間，且hDNA發(fā)生頻率與距著絲粒距離呈正相關(guān)關(guān)系，但同一染色體平均hDNA發(fā)生頻率與染色體長度無相關(guān)關(guān)系；絕大多數(shù)的染色體檢測出1~3次重組事件，少數(shù)檢測出4次重組事件，極少數(shù)檢測到5次重組事件；不同毛白楊基因型個體間同一染色體上hDNA發(fā)生頻率總體相差不大，而在一些特定SSR位點間hDNA發(fā)生頻率存在較大差異；與青楊雜種‘哲引3號’楊(בZheyin3#’)相比，檢測到的同源重組次數(shù)及hDNA發(fā)生頻率和發(fā)生位置均存在較大差異。本研究首次對2個基因型毛白楊同源重組發(fā)生特征及其變異進行了研究，為揭示高等植物同源重組特點、種間和種內(nèi)同源重組差異等提供了重要見解。

毛白楊；基因型；異源雙鏈DNA；三倍體；同源重組

在減數(shù)分裂期間，同源重組通過形成交叉互換(crossovers, COs)確保同源染色體的正確分離[1]，同時，使同源染色體間DNA雙鏈發(fā)生交換和基因轉(zhuǎn)換，形成異源雙鏈DNA(heteroduplex DNA, hDNA)而導(dǎo)致等位基因的重組，因此同源重組對于遺傳多樣性形成及物種進化等具有重要影響[2]。

作為一次減數(shù)分裂完成的產(chǎn)物——四分體是研究減數(shù)重組的理想型材料。酵母()在完成減數(shù)分裂后形成的四核子囊，保留了減數(shù)分裂后同源重組的完整信息，使得在酵母中進行同源重組研究[3,4]具有不可比擬的優(yōu)勢。擬南芥()突變體使花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)育而來的4個成熟花粉互不分離[5]，再結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，可實現(xiàn)植物同源重組的研究[6~9]。借助于單細(xì)胞分離和單細(xì)胞基因組擴增技術(shù)，研究人員對分離后的玉米()、大麥()四分體進行了減數(shù)重組的研究[10,11]。Dong等[12]提出了一種通過阻止同源重組產(chǎn)物——hDNA減數(shù)后分離，進而采用共顯性簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記從DNA水平直接鑒定高等植物同源重組的新方法，首次對楊屬()植物同源重組模式及其特點進行了研究，結(jié)果表明同源重組產(chǎn)物hDNA發(fā)生頻率在青楊雜種‘哲引3號’楊(בZheyin3#’)中介于5.3%~76.6%之間?；诟咄繙y序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜的方法，研究人員發(fā)現(xiàn)同源重組發(fā)生在玉米不同基因型間具有一定差異[13]。而Dong等[12]研究僅涉及1個青楊雜種‘哲引3號’楊的同源重組特征，迄今未見有關(guān)楊屬植物種間及種內(nèi)不同基因型之間同源重組變異的研究報道。

本研究基于抑制減數(shù)后分離并結(jié)合共顯性SSR分子標(biāo)記實現(xiàn)同源重組產(chǎn)生的hDNA檢測策略[12]，以2個源于胚囊染色體加倍的毛白楊×銀腺楊(()×(×))全同胞雜種三倍體群體為材料，選擇與Dong等[12]開展青楊雜種‘哲引3號’楊hDNA發(fā)生規(guī)律研究中同樣的1~8號染色體以及可能為性染色體的楊樹19號染色體(chromosome 19, Chr.19)[14,15]為對象，篩選與青楊雜種‘哲引3號楊’同源重組研究[12]相近數(shù)量的SSR標(biāo)記對開展2個不同基因型毛白楊同源重組特征研究，探討植物種內(nèi)不同基因型之間同源重組變異特點，為揭示植物同源重組發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的實驗材料為本實驗室前期以毛白楊雌株3532(2=2x=38)和3119(2=2x=38)為母本，以銀腺楊YX1為父本，通過高溫處理誘導(dǎo)胚囊染色體加倍獲得的2個三倍體群體[16]。隨機選取2個三倍體群體的部分株系為研究材料，其中3532×YX1雜交組合包括45個三倍體子代，3119×YX1雜交組合包括47個三倍體子代。

1.2 同源重組產(chǎn)物hDNA檢測方法

楊屬植物屬蓼型胚囊植物，在胚囊發(fā)育期，功能大孢子需要經(jīng)歷3次有絲分裂，形成7-細(xì)胞8核的成熟配子體。施加高溫處理誘導(dǎo)胚囊染色體加倍，即抑制減數(shù)后分離的結(jié)果(post-meiotic segregation restitution, PMR)[17,18]，使獲得的楊樹三倍體細(xì)胞中的兩套來源于母本的染色體保存了減數(shù)分裂期間發(fā)生的同源重組信息，即同源重組產(chǎn)物hDNA。

根據(jù)Dong等[12]提出的hDNA檢測策略，即在已經(jīng)完成減數(shù)分裂的胚囊發(fā)育期，施加理化處理，使攜帶同源重組產(chǎn)物hDNA的姊妹染色單體不能進行正常的有絲分裂而共存于一個2配子中，再授以單倍型異性配子，獲得異源三倍體子代；篩選母本處于雜合狀態(tài)且與父本有差異的多態(tài)性共顯性SSR分子標(biāo)記對三倍體進行遺傳信息分析，根據(jù)2配子是否保留母本的雜合遺傳信息即可判斷在該檢測位點上是否有同源重組產(chǎn)物hDNA的產(chǎn)生。

1.3 DNA提取與SSR分子標(biāo)記

利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，進行父母本和三倍體子代葉片基因組DNA的提取。TP-M13-SSR PCR技術(shù)[19]通過在上游引物引入一段通用的M13接頭序列，可以使用熒光修飾的M13引物令擴增出的特異的PCR產(chǎn)物帶上熒光，從而通過毛細(xì)管電泳進行檢測。這種方法在較大程度上解決了分析通量較低、擴增產(chǎn)物檢測流程繁瑣、數(shù)據(jù)記錄工作量過大等一系列問題。本研究根據(jù)該方法共需要3種引物，包括5′端接有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)的上游引物，普通下游引物以及標(biāo)有熒光(ROX、FAM、TAMRA、HEX)的M13引物。PCR體系如下：ddH2O 7.2 μL，20 ng/μL模板DNA 2 μL，PCR Mix 10 μL (天根生化科技(北京)有限公司)，10 μmol/L上游引物(5′端接有M13序列) 0.08 μL，10 μmol/L下游引物 0.32 mL，10 μmol/L M13熒光引物 0.4 μL。PCR擴增程序如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，待測引物的最適退火溫度30 s，72℃ 30 s，25個循環(huán)；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，8個循環(huán)；72℃ 8 min，4℃保存。父母本以及三倍體子代的PCR產(chǎn)物委托北京睿博興科生物科技有限公司在ABI- 3730XL基因分析儀上進行測試，其結(jié)果應(yīng)用GeneMarker 1.75軟件[20]進行讀取及分析。

1.4 多態(tài)性引物篩選

本研究中的SSR引物有3種來源：(1)國際楊樹基因組協(xié)會(InternationalGenome Consortium)公布的楊樹SSR數(shù)據(jù)庫(IPGC; http://www.ornl.gov/ sci/ipgc/ssr_resource.htm)中所有SSR引物(以GCPM、ORPM、PMGC開頭)；(2)毛果楊()基因組開發(fā)的部分SSR引物[21](以LG開頭)；(3)實驗室毛白楊mRNA-sequence開發(fā)的部分SSR引物(以PTSSR、MB開頭)，將3種來源的SSR引物與毛果楊基因組v3.0 (http://www.phytozome. net/poplar)進行比對，對SSR引物屬于Chr.01~08和Chr.19上游引物5′端加以M13磷熒光染料標(biāo)記，所有引物(上游引物、下游引物和M13熒光標(biāo)記引物)委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。應(yīng)用上述引物，以毛白楊雌株3532、3119與銀腺楊YX1的DNA為模板進行TP-M13- SSR PCR (方法見1.3)，篩選在母本中處于雜合狀態(tài)且與父本有差異的SSR多態(tài)性引物。

1.5 重組事件的計數(shù)與統(tǒng)計

以位于一條染色體上的所有SSR檢測位點處hDNA的產(chǎn)生與否為依據(jù)，對該條染色體上發(fā)生同源重組事件的次數(shù)進行統(tǒng)計分析。以相鄰SSR位點間hDNA形成與否來確定同源重組事件是否發(fā)生，當(dāng)在一條染色體上hDNA在相鄰兩SSR位點都產(chǎn)生時，判定在這2個檢測位點區(qū)間發(fā)生了一次同源重組事件。此外，由于著絲粒附近發(fā)生hDNA的頻率低，以著絲粒附近為區(qū)分，單獨統(tǒng)計重組事件，即分布在著絲粒兩側(cè)的2個SSR位點均產(chǎn)生hDNA時，記為2次同源重組兩次事件。

1.6 統(tǒng)計與分析

根據(jù)異源三倍體的等位基因配置(abc、abd、aac、bbc、aad和bbd共6種等位基因配置)，hDNA頻率計算如下：

其中，表示hDNA頻率；N表示在某一位點上傳遞母本雜合性基因型信息的三倍體數(shù)量；N和N表示在該位點上傳遞母本純合基因型信息的三倍體數(shù)量。

為了描述一條染色體上在不同標(biāo)記處的hDNA頻率，利用Origin 2018 (OriginLab Cor., Northampton, MA, USA)繪制hDNA發(fā)生頻率曲線、頻率分布圖和相關(guān)線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源重組檢測適宜引物篩選

通過對上述3種來源的SSR引物與毛果楊基因組v3.0(Phytozome v3.0; http://www. phytozome.net)進行比對，確定每對SSR引物所在的染色體信息。剔除掉產(chǎn)物片段過小(<110 bp)的引物，在楊樹Chr.01~08和Chr.19上共獲得SSR引物1849對。

進一步對這1849對SSR引物進行篩選，獲得母本毛白楊處于雜合狀態(tài)且與父本銀腺楊有差異的多態(tài)性SSR引物110對(每條引物的名稱、所在染色體的具體位置及其在父母本中分別獲得產(chǎn)物片段的大小等具體信息見附表1)。每條染色體上獲得的多態(tài)性SSR引物為8~16對，其中Chr.07上獲得的多態(tài)性引物最少，為8對；Chr.01和Chr.04上獲得的多態(tài)性引物最多，為16對(表1)。這些標(biāo)記數(shù)量與青楊雜種‘哲引3號’楊hDNA發(fā)生頻率研究[12]中所用的數(shù)量相差不大，便于之后的楊樹不同種間的同源重組對比研究。

對篩選出的多態(tài)性SSR引物進一步分析，可以將這些引物分為兩種類型：第一種為父母本無共同等位基因，以引物GCPM_3971-1 (圖1A)為例，在母本3119和3532中，等位基因的配置是雜合的，具有193 bp和211 bp 2個位點(分別以“a”、“b”表示)，而父本YX1的等位基因配置也是雜合的，有202 bp和218 bp 2個位點(分別以“c”、“d”表示)。PMR型三倍體子代T1、T2中遺傳了母本的雜合位點，其遺傳配置分別為“abc”和“abd”；PMR型三倍體子代T3、T4、T5、T6中遺傳了母本的純合位點，且在子代中表現(xiàn)出劑量效應(yīng)(母本的峰高，即擴增量，約為父本的2倍)，其遺傳配置分別為“aac”、“bbc”、“aad”和“bbd”。第二種為母本檢測到多態(tài)性的雜合基因型，但母本、父本有一共同等位基因，以引物GCPM_124 (圖1B)為例，在母本3119和3532中，等位基因的配置是雜合的，具有207 bp和210 bp 2個位點(分別以“a”、“b”表示)，而父本YX1的等位基因配置也是雜合的，具有201 bp和210 bp 2個位點(以“c”、“b”表示)。PMR型三倍體子代T1、T2中遺傳了母本的雜合位點，其遺傳配置分別為“abc”和“abb”；PMR型三倍體子代T3、T4、T5、T6中遺傳了母本的純合位點，且在子代中表現(xiàn)出劑量效應(yīng)(母本的峰高約為父本的2倍或子代只有一個條帶)，其遺傳配置分別為“aab”、“bbb”、“aac”和“bbc”。而ab型2雌配子(三倍體子代T1和T2)檢測到了母本毛白楊雌株3119和3532的所有雜合性信息，則表明毛白楊雌株3119和3532大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時在該SSR位點處通過同源重組形成了hDNA。

2.2 不同基因型毛白楊同源重組特點

進一步利用篩選出的SSR標(biāo)記，在來源于PMR型2配子的三倍體群體中，利用公式(1)計算在Chr.01~08和Chr.19不同位置上發(fā)生同源重組而產(chǎn)生的hDNA頻率(圖2)。

表1 多態(tài)性SSR引物與楊樹基因組的BLAST分析

圖1 鑒定毛白楊hDNA的SSR位點毛細(xì)管電泳圖

A：引物GCPM_3971-1在親本和6個三倍體子代中的擴增結(jié)果；B：引物GCPM_124在親本和6個三倍體子代中的擴增結(jié)果。

2.2.1 不同基因型毛白楊hDNA發(fā)生頻率

在檢測的9條染色體上，不同基因型毛白楊hDNA發(fā)生頻率的結(jié)果如圖2所示，不同SSR位點處發(fā)生的hDNA頻率不同。其中，在毛白楊雌株3119中，GCPM_3408 (處于Chr.01上20.668 Mb)與GCPM_2453-1 SSR標(biāo)記位點間的hDNA頻率最小，在47株P(guān)MR三倍體中檢測到只有4株源自ab型2雌配子，即8.5%的大孢子母細(xì)胞在GCPM_3408與GCPM_2453-1 SSR標(biāo)記位點間發(fā)生了重組事件并產(chǎn)生hDNA。而在MB70130(處于Chr.19上15.319 Mb)與MB125779 SSR標(biāo)記位點間卻有41株P(guān)MR型異源三倍體檢測到源自ab型2雌配子，即87.2%的大孢子母細(xì)胞在這個位點發(fā)生了重組事件并產(chǎn)生hDNA。這2個SSR位點處產(chǎn)生的hDNA頻率相差10.0倍以上。

圖2 在9條染色體不同位置上檢測到的hDNA頻率(%)

A~I分別表示Chr.01~08和Chr.19上的hDNA發(fā)生頻率(%)?；疑珔^(qū)域為假定著絲粒區(qū)，前8條染色體的著絲粒位置由毛果楊不同組織的甲基化程度推測得到[22]，Chr.19的著絲粒位置在5.3~6.7 Mb[23]。

在毛白楊雌株3532中，GCPM_3408 (處于Chr.01上20.668 Mb)與GCPM_2453-1 SSR標(biāo)記位點間、GCPM_2768 (處于Chr.02上20.942 Mb)與PTSSR2445 SSR標(biāo)記位點間的hDNA發(fā)生頻率最小，在45株P(guān)MR三倍體中檢測到只有7株源自ab型2雌配子(圖2)，即15.6%的大孢子母細(xì)胞在這2個位點發(fā)生了重組事件并產(chǎn)生hDNA。而在MB70130 (處于Chr.19上15.319 Mb)與MB125779引物位點間卻有39株P(guān)MR型異源三倍體被檢測到源自ab型2雌配子，即86.7%的大孢子母細(xì)胞在該位點發(fā)生了重組事件并產(chǎn)生hDNA。這2個SSR位點處產(chǎn)生的hDNA頻率相差5.6倍。

在大多數(shù)SSR位點間，在2個基因型毛白楊雌株hDNA發(fā)生頻率相差不大。但是在一些特定SSR位點間，2個基因型毛白楊雌株hDNA頻率發(fā)生頻率差異較大，如在Chr.01的PTSSR1686 (42.469 Mb)與GCPM_1263-1的SSR標(biāo)記位點間，雌株3119產(chǎn)生的hDNA頻率為68.1%，而雌株3532為35.6%。

在Chr.01~08上，毛白楊2個基因型雌株hDNA最大發(fā)生頻率分別為76.6%、82.2%，最小發(fā)生頻率分別為8.5%、15.6%，與青楊雜種‘哲引3號’楊最大、最小hDNA發(fā)生頻率(76.6%、5.3%)相比[12]，毛白楊表現(xiàn)出了更高的hDNA發(fā)生頻率。

2.2.2 hDNA發(fā)生頻率與標(biāo)記距著絲粒距離相關(guān)分析

由圖2可知，在不同染色體上，2個基因型雌株的hDNA發(fā)生頻率表現(xiàn)出了不同的發(fā)生模式。雖然在相同的SSR位點上，hDNA發(fā)生頻率在2個基因型雌株上具有差異，但2個基因型雌株hDNA發(fā)生頻率在同一條染色體上具有相近的趨勢，即在近著絲粒區(qū)域，兩種基因型雌株的hDNA發(fā)生頻率均呈現(xiàn)出最低，隨著位點與著絲粒距離增加，hDNA的發(fā)生頻率也增大。

對2個基因型雌株的SSR位點距著絲粒距離與hDNA發(fā)生頻率進行線性回歸分析(圖3)，結(jié)果表明在兩種基因型中的9條染色體上，位點距著絲粒距離與hDNA發(fā)生頻率之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，即hDNA發(fā)生頻率隨位點與著絲粒距離增大而增加。

2.2.3 hDNA發(fā)生頻率與染色體長度相關(guān)分析

對9條染色體上平均hDNA發(fā)生頻率與染色體長度之間進行相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這9條染色體上，兩種基因型雌株均不存在顯著正相關(guān)(圖4)，這說明染色體長度與平均hDNA發(fā)生頻率無關(guān)。

圖3 hDNA頻率(%)及檢測位點距著絲粒間距離的相關(guān)分析

A~I分別表示Chr.01~08和Chr.19上的hDNA發(fā)生頻率(%)與檢測位點距著絲粒間距離的線性回歸。

2.3 不同基因型毛白楊重組發(fā)生次數(shù)分析

根據(jù)本研究1.5描述的統(tǒng)計方法，以Chr.04為例，5株P(guān)MR型三倍體上檢測位點的hDNA發(fā)生情況如圖5所示，A~E分別表示Chr.04上發(fā)生了0~4次。

依據(jù)檢測位點上的hDNA發(fā)生與否得出9條染色體上的重組事件發(fā)生次數(shù)，在毛白楊雌株3119中，Chr.03、06、08發(fā)生0~3次重組事件，Chr.01、02、04、05、07、19上發(fā)生0~4次重組事件(圖6)。在毛白楊雌株3532中，Chr.02、03、08上發(fā)生0~3次重組事件，Chr.04、05、06、07和19上發(fā)生0~4次重組事件，只有Chr.01發(fā)生0~5次(圖6)。

圖4 染色體長度與hDNA平均頻率(%)間關(guān)系

另一方面，對毛白楊雌株3119為母本的47株P(guān)MR型雜種三倍體在檢測的9條染色體(共計423條染色體)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明1~3次重組事件在檢測的9條染色體上發(fā)生比例最高，共計94.8% (計401條染色體)；而檢測到的最大重組事件次數(shù)是4次，發(fā)生了11次，占比2.6% (計11條染色體)，分別發(fā)生在Chr.01、Chr.02、Chr.04、Chr.05、Chr.07和Chr.19上；未檢測到重組事件的染色體占比2.6% (計11條染色體) (圖6)。

對毛白楊雌株3532為母本的45株P(guān)MR型雜種三倍體在檢測的9條染色體(共計405條染色體)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明1~3次重組事件在檢測的9條染色體上發(fā)生比例最高，占比總計94.1% (計381條染色體)上；而4次重組事件發(fā)生在總計3.0%的染色體(計12條染色體)；而檢測到的最大重組事件次數(shù)是5次，占比0.2%，僅在Chr.01上發(fā)生1次；未檢測到重組事件的染色體占比2.7%(計11條染色體) (圖6)。在兩種基因型雌株中，未檢測到重組事件可能與SSR引物的覆蓋密度不足有關(guān)。

圖5 重組次數(shù)統(tǒng)計模型示意圖

A~E分別表示Chr.04上發(fā)生了0~4次重組事件。藍(lán)色點表示該位點未產(chǎn)生hDNA，紅色表示產(chǎn)生hDNA，黃色橢圓為著絲粒。

圖6 Chr.01~08和Chr.19上2個基因型毛白楊個體重組事件的比例

A~I分別表示Chr.01~08和Chr.19上的重組事件比例。

3 討論

在毛白楊Chr.01~08和Chr.19的所有檢測SSR位點中，兩種基因型個體雌配子形成過程中同源重組導(dǎo)致hDNA發(fā)生頻率不同，分別介于8.5%~87.2%、15.6%~86.7%之間。hDNA發(fā)生頻率與SSR位點所處的染色體位置有關(guān)。此外，從2個群體的92株三倍體所代表的雌配子中9條染色體上的同源重組事件分析上看，大多數(shù)的染色體至少經(jīng)歷了1~3次重組事件，少部分染色體經(jīng)歷了4~5次重組事件。

3.1 楊樹同源重組頻率變異

從hDNA發(fā)生頻率來看，Dong等[12]利用SSR標(biāo)記檢測PMR型青楊雜種‘哲引3號’楊的hDNA發(fā)生頻率介于5.3%~76.6%之間。利用與上述研究相當(dāng)數(shù)量的SSR標(biāo)記，本研究發(fā)現(xiàn)毛白楊的hDNA發(fā)生頻率在8.5%~87.2%之間，略高于青楊雜種‘哲引3號’的hDNA發(fā)生頻率，這可能與物種間的差異有關(guān)。毛白楊的2個基因型個體在GCPM_3408與GCPM_ 2453-1 SSR標(biāo)記位點間(Chr.01)上均表現(xiàn)出最低hDNA發(fā)生頻率，分別為8.5%、15.6%。且hDNA最高發(fā)生頻率的SSR位點在2個基因型個體中相同。另一方面，從hDNA發(fā)生的染色體水平上看，在毛白楊2個基因型個體中，9條染色體上hDNA平均發(fā)生頻率基本一致，分別為51.2%、51.4%，其中最高分別為64.1%、60.0%；最低分別為42.4%、45.6%。這些可能與種內(nèi)的重組發(fā)生的保守性有關(guān)。

在毛白楊2個基因型個體中，hDNA發(fā)生頻率與SSR所在染色體位置有關(guān)，即檢測位點距著絲粒距離越近，hDNA發(fā)生頻率越低，與‘哲引3號’楊以及其他植物的相關(guān)研究結(jié)果一致[12,24,25]。這應(yīng)該是近著絲粒區(qū)域富集轉(zhuǎn)座子和短序列重復(fù)，其甲基化程度較高，使得重組在近著絲粒區(qū)受到抑制的緣故[26]。楊樹種內(nèi)不同基因型個體之間也存在一定的變異，2個基因型個體在Chr.04上的平均hDNA發(fā)生頻率為46.1%、59.6%，在Chr.07上分別為60.6%、45.8%；甚至在特定檢測位點上hDNA發(fā)生頻率存在較大差異，如在Chr.01的PTSSR1686與GCPM_ 1263-1 SSR標(biāo)記位點間，毛白楊雌株3119產(chǎn)生的hDNA發(fā)生頻率為68.1%，而毛白楊雌株3532為35.6%。造成楊樹種間以及同種內(nèi)不同基因型個體間在染色體相同區(qū)域hDNA發(fā)生頻率差異的重要原因與染色體結(jié)(knob)、易染色質(zhì)區(qū)、高度重復(fù)序列等一些抑制同源重組發(fā)生的染色體結(jié)構(gòu)分布區(qū)分布等有關(guān)[13,27]。

有研究表明，聯(lián)會復(fù)合體長度與染色體交換頻率有關(guān)[28~31]。在高等植物中，聯(lián)會復(fù)合體長度與基因組大小[32]、染色體物理長度[10,33]存在正相關(guān)關(guān)系。本研究對染色體物理長度與hDNA頻率進行了相關(guān)分析，但結(jié)果表明其相關(guān)性并未達(dá)到顯著水平(圖4)，與水稻()中的相關(guān)研究結(jié)果類似[24]，與青楊雜種‘哲引3號’楊的研究結(jié)果相一致[12]。此外，以往的研究結(jié)果表明只有染色體的長度較大時，聯(lián)會復(fù)合體的長度與染色體物理長度才可能存在相關(guān)，而較短的染色體并未表現(xiàn)出類似規(guī)律[34,35]。而在楊樹染色體中，只有Chr.01長度約為50.5 Mb，相對較大，其他18條染色體長度介于12.9~27.9 Mb之間。因此，本研究中大多數(shù)染色體較短，也可能是導(dǎo)致hDNA頻率與染色體長度不相關(guān)的主要原因。

3.2 楊樹同源重組事件

在減數(shù)分裂過程中，同源染色體間發(fā)生的聯(lián)會對減數(shù)分裂I的正確分離具有重要作用，同源重組事件在該過程中至少發(fā)生一次[36~38]。其中在擬南芥[39]中，Chr.04上COs發(fā)生次數(shù)均不超過3次。水稻中，12條染色體的COs平均在1.9~3.8次[24]。玉米的單細(xì)胞測序結(jié)果表明在Chr.01~10上發(fā)生了0~4次COs[10,40]，同樣，對大麥的四分體單細(xì)胞及雙單倍體群體測序的結(jié)果表明在Mb分辨率下重組事件發(fā)生了0~4次[11]。董春波[41]利用SSR標(biāo)記在青楊雜種三倍體群體Chr.01~08上檢測到最高發(fā)生6次重組事件，但大部分染色體僅檢測到1~3次的同源重組事件，占89.89%。本研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的染色體至少經(jīng)歷了1~3次重組事件，與上述研究結(jié)果相似。少數(shù)的染色體至少經(jīng)歷了4~5次同源重組事件，其中5次同源重組事件只發(fā)生在毛白楊雌株3532中的Chr.01上，毛白楊雌株3119最多發(fā)生了4次重組事件，這可能與重組事件的發(fā)生在種內(nèi)具有差異有關(guān)[42]。毛白楊同源重組事件發(fā)生次數(shù)略低于青楊雜種‘哲引3號’，檢測到的同源重組事件發(fā)生次數(shù)最多的所在染色體與青楊雜種‘哲引3號’(Chr.06)的并不相同。這種結(jié)果可能與影響同源重組的基因組修飾在不同物種中存在差異有關(guān)[2]。

本研究結(jié)果表明毛白楊減數(shù)分裂中具有較高的DNA重組頻率發(fā)生，給子代帶來更多的遺傳變異，從而有利于物種加快進化以適應(yīng)多變的環(huán)境；另一方面，不同基因型個體間重組頻率存在著差異，這種差異對育種中親本選配具有重要意義[43]。然而，影響毛白楊不同基因型間同源重組頻率差異的遺傳機制仍需進一步深入研究和解析。

附錄：

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

[1] Cromie GA, Smith GR. Branching out: meiotic recom-bination and its regulation., 2007, 17(9): 448–455.

[2] Melamed-Bessudo C, Shilo S, Levy AA. Meiotic recombination and genome evolution in plants., 2016, 30: 82–87.

[3] Mancera E, Bourgon R, Huber W, Steinmetz LM. Genome-wide survey of post-meiotic segregation during yeast recombination., 2011, 12(4): R36.

[4] Martini E, Borde V, Legendre M, Audic S, Regnault B, Soubigou G, Dujon B, Llorente B.Genome-wide analysis of heteroduplex DNA in mismatch repair-deficient yeast cells reveals novel properties of meiotic recombination pathways., 2011, 7(9): e1002305.

[5] Preuss D, Rhee SY, Davis RW. Tetrad analysis possible inwith mutation of the quartet () genes., 1994, 264(5164): 1458–1460.

[6] Francis KE, Lam SY, Harrison BD, Bey AL, Berchowitz LE, Copenhaver GP.Pollen tetrad-based visual assay for meiotic recombination in., 2007, 104(10): 3913–3918.

[7] Sun YJ, Ambrose JH, Haughey BS, Webster TD, Pierrie SN, Mu?oz DF, Wellman EC, Cherian S, Lewis SM, Berchowitz LE, Copenhaver GP. Deep genome-wide measurement of meiotic gene conversion using tetrad analysis in., 2012, 8(10): e1002968.

[8] Berchowitz LE, Copenhaver GP. Fluorescenttetrads: a visual assay for quickly developing large crossover and crossover interference data sets., 2008, 3(1): 41–50.

[9] Yelina NE, Ziolkowski PA, Miller N, Zhao XH, Kelly KA, Mu?oz DF, Mann DJ, Copenhaver GP, Henderson IR. High-throughput analysis of meiotic crossover frequency and interference via flow cytometry of fluorescent pollen in., 2013, 8(11): 2119– 2134.

[10] Li X, Li L, Yan JB. Dissecting meiotic recombination based on tetrad analysis by single-microspore sequencing in maize., 2015, 6: 6648.

[11] Dreissig S, Fuchs J, Himmelbach A, Mascher M, Houben ASequencing of single pollen nuclei reveals meiotic recombination events at megabase resolution and circumvents segregation distortion caused by postmeiotic processes., 2017, 8: 1620.

[12] Dong CB, Mao JF, Suo YJ, Shi L, Wang J, Zhang PD, Kang XY. A strategy for characterization of persistent heteroduplex DNA in higher plants., 2014, 80(2): 282–291.

[13] Bauer E, Falque M, Walter H, Bauland C, Camisan C, Campo L, Meyer N, Ranc N, Rincent R, Schipprack W, Altmann T, Flament P, Melchinger AE, Menz M, Moreno- González J, Ouzunova M, Revilla P, Charcosset A, Martin OC, Sch?n CC. Intraspecific variation of recombination rate in maize., 2013, 14(9): R103.

[14] Yin TM, Difazio SP, Gunter LE, Zhang XY, Sewell MM, Woolbright SA, Allan GJ, Kelleher CT, Douglas CJ, Wang MX, Tuskan GA. Genome structure and emerging evidence of an incipient sex chromosome in., 2008, 18(3): 422–430.

[15] Kersten B, Pakull B, Fladung M. Genomics of sex determination in dioecious trees and woody plants., 2017, 31(4): 1113–1125.

[16] Kang N, Bai FY, Zhang PD, Kang XY. Inducing chromosome doubling of embryo sac inwith high temperature exposure for hybrid triploids., 2015, 37(2): 79–86.康寧, 白鳳瑩, 張平冬, 康向陽. 高溫誘導(dǎo)胚囊染色體加倍獲得毛白楊雜種三倍體. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 37(2): 79–86.

[17] Li YH. Chromosome doubling of female gametes in white poplars[Dissertation]. Beijing Forstry University, 2007.李艷華. 白楊雌配子染色體加倍技術(shù)研究[學(xué)位論文]. 北京林業(yè)大學(xué), 2007.

[18] Wang J. Techniques of polyploid induction inspp. (Section)[Dissertation]. Beijing Forstry University, 2009.王君. 青楊派樹種多倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究[學(xué)位論文]. 北京林業(yè)大學(xué), 2009.

[19] Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments., 2000, 18(2): 233–234.

[20] Hulce D, Li X, Snyder-Leiby T, Johathan LC. GeneMarker? Genotyping Software: Tools to increase the statistical power of dna fragment analysis., 2011, 22(Suppl.): S35–S36.

[21] Yin TM, Zhang XY, Gunter LE, Li SX, Wullschleger SD, Huang MR, Tuskan GA. Microsatellite primer resource fordeveloped from the mapped sequence scaffolds of the Nisqually-1 genome., 2009, 181(2): 498–503.

[22] Vining KJ, Pomraning KR, Wilhelm LJ, Priest HD, Pellegrini M, Mockler TC, Freitag M, Strauss SH. Dynamic DNA cytosine methylation in thegenome: tissue-level variation and relationship to gene expression., 2012, 13: 27.

[23] Xin HY, Zhang T, Han YH, Wu YF, Shi JS, Xi ML, Jiang JM. Chromosome painting and comparative physical mapping of the sex chromosomes inand., 2018, 127(3): 313– 321.

[24] Si WN, Yuan Y, Huang J, Zhang XH, Zhang YC, Zhang YD, Tian DC, Wang CL, Yang YH, Yang SH. Widely distributed hot and cold spots in meiotic recombination as shown by the sequencing of rice F2plants., 2015, 206(4): 1491–1502.

[25] Wijnker E, Velikkakam James G, Ding J, Becker F, Klasen JR, Rawat V, Rowan BA, de Jong DF, de Snoo CB, Zapata L, Huettel B, de Jong H, Ossowski S, Weigel D, Koornneef M, Keurentjes JJ, Schneeberger K. The genomic landscape of meiotic crossovers and gene conversions in., 2013, 2: e01426.

[26] Henderson IR. Control of meiotic recombination frequency in plant genomes., 2012, 15(5): 556–561.

[27] Yelina N, Diaz P, Lambing C, Henderson IR. Epigenetic control of meiotic recombination in plants., 2015, 58(3): 223–231.

[28] Kleckner N, Storlazzi A, Zickler D. Coordinate variation in meiotic pachytene SC length and total crossover/ chiasma frequency under conditions of constant DNA length., 2003, 19(11): 623–628.

[29] Ruiz-Herrera A, Vozdova M, Fernández J, Sebestova H, Capilla L, Frohlich J, Vara C, Hernández-Marsal A, Sipek J, Robinson TJ, Rubes J. Recombination correlates with synaptonemal complex length and chromatin loop size in bovids-insights into mammalian meiotic chromosomal organization., 2017, 126(5): 615–631.

[30] Quevedo C, Del Cerro AL, Santos JL, Jones GHCorrelated variation of chiasma frequency and synaptonemal complex length in., 1997, 78(5): 515–519.

[31] Lynn A, Koehler KE, Judis L, Chan ER, Cherry JP, Schwartz S, Seftel A, Hunt PA, Hassold TJ. Covariation of synaptonemal complex length and mammalian meiotic exchange rates., 2002, 296(5576): 2222–2225.

[32] Anderson LK, Stack SM, Fox MH, Zhang CS. The relationship between genome size and synaptonemal complex length in higher plants., 1985, 156(2): 367–378.

[33] Giraut L, Falque M, Drouaud J, Pereira L, Martin OC, Mézard C. Genome-wide crossover distribution inmeiosis reveals sex-specific patterns along chromosomes., 2011, 7(11): e1002354.

[34] Basheva EA, Bidau CJ, Borodin PM. General pattern of meiotic recombination in male dogs estimated by MLH1 and RAD51 immunolocalization., 2008, 16(5): 709–719.

[35] Mancera E, Bourgon R, Brozzi A, Huber W, Steinmetz LM. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non- crossovers in yeast., 2008, 454(7203): 479–485.

[36] Page SL, Hawley RS. Chromosome choreography: the meiotic ballet., 2003, 301(5634): 785–789.

[37] Jones GH. The control of chiasma distribution., 1984, 38: 293–320.

[38] Ritz KR, Noor MAF, Singh ND. Variation in recombination rate: adaptive or not?., 2017, 33(5): 364– 374.

[39] Drouaud J, Mercier R, Chelysheva L, Bérard A, Falque M, Martin O, Zanni V, Brunel D, Mézard C. Sex-specific crossover distributions and variations in interference level alongchromosome 4., 2007, 3(6): e106.

[40] Luo C, Li X, Zhang QH, Yan JB. Single gametophyte sequencing reveals that crossover events differ between sexes in maize., 2019, 10(1): 785.

[41] Dong CB. Analysis of homologous recombination chara-cteristics and 2n gamete heterozygosity in[Dissertation]. Beijing Forestry University, 2015.董春波. 楊樹同源重組特點及2n配子雜合性分析[學(xué)位論文]. 北京林業(yè)大學(xué), 2015.

[42] Yang SH, Yuan Y, Wang L, Li J, Wang W, Liu HX, Chen JQ, Hurst LD, Tian DC. Great majority of recombination events inare gene conversion events., 2012, 109(51): 20992–20997.

[43] Hadad RG, Pfeiffer TW, Poneleit CG. Repeatability and heritability of divergent recombination frequencies in the Iowa Stiff Stalk Synthetic (L.)., 1996, 93(5–6): 990–996.

Variation of homologous recombination inwith different genotypes

Xining Geng1,2,3,4, Te Lu1,2,3, Kang Du1,2,3, Jun Yang1,2,3, Xiangyang Kang1,2,3

Homologous recombination is an important source of biological genetic variation. Limited by detection methods, there are only a few reports on the homologous recombination in high plants and its product - heteroduplex DNA (hDNA). In the present study, applying the strategy of detecting hDNA by constructing populations from inhibited post-meiotic segregation, two hybrid triploid populations were constructed from two maternal parents inby inhibiting post-meiotic segregation. One hundred and ten simple sequence repeat (SSR) markers were used to study the occurrence and variation of hDNA on nine chromosomes inwith different genotypes. The results showed that the frequencies of hDNA between two female parents inranged from 8.5% to 87.2%. The hDNA frequency was positively correlated to the distance from the centromere, but the average hDNA frequency on a chromosome had no correlation with the chromosome length. One to 3 times recombination events were detected on most chromosomes, and only a few four- or five-times recombination events were detected. The overall frequencies of hDNA on the same chromosome in two genotypic individuals were roughly similar, while the hDNA frequencies varied greatly at specific SSR loci. Compared withpoplar hybrid,‘Zheyin3#’, detection of homologous recombination times and the frequency and location of hDNA were largely different. This study is the first to describe the characteristics and variations of homologous recombination inwith two different genotypes, which will provide valuable insights for exploring the characteristics and variations of homologous recombination among interspecies and intraspecies in higher plant.

; genotype; heteroduplex DNA; triploid; homologous recombination

2020-07-06;

2021-01-05

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31470667)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31470667)]

耿喜寧，博士，講師，研究方向：林木遺傳育種。E-mail: geng_xn@yeah.net

康向陽，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：林木遺傳育種。E-mail: kangxy@bjfu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-205

2021/1/22 11:04:58

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210122.0900.004.html

(責(zé)任編委: 黃勛)