炎性腸病易感基因GPR35在腸炎發(fā)生發(fā)展中的功能研究

鄭燕森，卓林剛，李大力，劉明耀

研究報告

炎性腸病易感基因在腸炎發(fā)生發(fā)展中的功能研究

鄭燕森，卓林剛，李大力，劉明耀

華東師范大學生命科學學院生命醫(yī)學研究所，上海調(diào)控生物學重點實驗室，上海 200241

炎性腸病在全球范圍內(nèi)發(fā)生極其普遍，具有反復發(fā)作、難以治愈的特點，也是誘發(fā)結(jié)直腸癌的高風險因素之一。腸炎的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)，有報道發(fā)現(xiàn)位于基因座上的多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點rs4676410、rs3749171和rs3749172與腸炎敏感性高度相關(guān)，但是基因在腸炎的發(fā)生發(fā)展進程中的功能及相關(guān)機制尚沒有明確結(jié)論。為了研究在腸炎中的作用，首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠，隨后利用DSS誘導的腸炎模型評價在腸炎發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠在體重變化、DAI評分、腸上皮損傷以及炎性細胞浸潤等腸炎相關(guān)指標顯著低于野生型小鼠。為了研究腸炎相關(guān)SNP突變對GPR35活性的影響，首先根據(jù)rs3749171和rs3749172SNP位點突變信息構(gòu)建GPR35-T108M和GPR35-S294R兩種突變型受體，其次通過多種下游信號通路活性測試，發(fā)現(xiàn)兩種突變均能夠增強GPR35受體活性。最后通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)相較于野生型小鼠，敲除小鼠腸上皮Erk1/2磷酸化水平增加，表明敲除后可能通過上調(diào)Erk1/2信號通路的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人類腸炎易感的rs3749171和rs3749172位點可能通過激活GPR35及下游信號通路的方式促進腸炎的發(fā)生發(fā)展，為炎性腸病的治療提供了潛在的藥物作用靶點。

rs3749171；rs3749172；；腸炎；動物模型

炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種全世界范圍內(nèi)高發(fā)的腸道系統(tǒng)炎癥，分為克羅恩病(Crohn disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)兩種疾病亞型，可導致腹瀉、直腸出血、腹痛和營養(yǎng)不良等癥狀[1]。此外，IBD是結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的主要危險因素，IBD患者的結(jié)腸癌發(fā)病率是普通人群的18倍[2~4]。鑒于全世界范圍內(nèi)IBD的發(fā)病率不斷增加并帶來巨額的醫(yī)療負擔，腸炎已成為目前亟需解決的公共健康問題。因此，開展腸炎發(fā)病機制的研究及開發(fā)IBD治療藥物靶點對腸炎的預防及治療方面有著極其重要的意義。

目前研究已發(fā)現(xiàn)，腸炎發(fā)病主要是由于吸煙、肥胖、飲食習慣等外界環(huán)境因素及腸炎易感基因和等遺傳因素導致腸內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)破壞，腸上皮屏障功能缺失以及先天/適應性免疫系統(tǒng)功能紊亂等功能障礙，最終導致腸炎的發(fā)生發(fā)展[5~7]。鑒于基因突變在腸炎發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)已被應用于腸炎發(fā)病風險預測及機制研究中[8]。通過對與炎性腸病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點調(diào)研，本課題組前期發(fā)現(xiàn)3個獨立的報導均表明位于基因座的SNP位點與腸炎高度相關(guān)，但是并未研究清楚是否發(fā)生活性突變及表達水平變化[9~11]。在dbSNP數(shù)據(jù)庫分析上述SNP位點可以發(fā)現(xiàn)：rs4676410和rs3749172位點在亞洲群體出現(xiàn)頻率較高，GWAS統(tǒng)計出現(xiàn)頻率分別為30.6% (樣本量124)及74.1% (樣本量324)，而對應的歐美群體中為19.5% (樣本量97104)及54.6% (樣本量123608)；而rs3749171位點在歐美群體中GWAS統(tǒng)計出現(xiàn)頻率16.8% (樣本量95590)高于亞洲群體相關(guān)位點出現(xiàn)頻率4.3% (樣本量140)[12]。其中rs4676410位于內(nèi)含子區(qū)域，可能通過影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方式影響目的基因的表達[9]；而rs3749171和rs3749172位于編碼區(qū)，導致GPR35發(fā)生T305M和S294R位點氨基酸突變，可能會對GPR35受體活性產(chǎn)生影響[10,11]。

GPCR家族作為最大的一類細胞膜受體家族，能夠?qū)飧袘?、信息素、激素、神?jīng)遞質(zhì)在內(nèi)的多種刺激產(chǎn)生反應并調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移以及應激反應，與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13]。是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)樣受體亞群[14]。在外周血白細胞、脾臟、小腸、結(jié)腸和胃等多個組織器官及細胞類群中表達較高，且被證明可能參與哮喘、心血管疾病、腸炎、糖尿病等一系列疾病的發(fā)生發(fā)展，但具體功能及機制尚未研究清楚[14]。目前為止，在腸炎的病理進程中的作用及機制依舊沒有確定的結(jié)論。GPR35的激動劑包括犬尿酸，LPA，Zaprinast以及雙羥萘酸，但是不同激動劑在腸炎發(fā)生發(fā)展進程中的作用完全相反：有研究證明社交壓力帶來的犬尿酸積累能夠通過GPR35促進腸炎的發(fā)生發(fā)展，而雙羥萘酸可以通過促進腸上皮粘膜修復的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展[15,16]。鑒于激動劑相關(guān)的研究無法證明在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用，構(gòu)建基因突變小鼠，并在敲除動物模型水平上進行腸炎模型構(gòu)建將有助于明確在腸炎發(fā)生發(fā)展中的功能，鑒定新的藥物作用靶標。

在腸炎的發(fā)病進程中，GPCR下游信號通路如ERK1/2、RHOA及AKT等信號通路等在腸炎發(fā)生發(fā)展中能夠起到重要的作用[17]。ERK1/2信號通路在腸上皮組織的激活能夠促進腸上皮粘膜修復，進而保護腸道組織免受腸炎癥狀侵襲[18]。有研究顯示GPR35能夠通過下游Gq、Gi/o、G12/13以及β-arrestin分子調(diào)控下游ERK1/2和 AKT等信號通路活性。在DSS誘導腸炎模型中，是否能夠通過調(diào)控ERK1/2信號通路活性調(diào)節(jié)腸炎發(fā)病進程成為需要研究的重點。本研究將從細胞及動物模型兩個方面探究腸炎相關(guān)SNP位點對活性水平的調(diào)控及在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機制，為腸炎易感基因的鑒定、腸炎發(fā)生發(fā)展機制的探索以及后續(xù)腸炎治療藥物靶點開發(fā)打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

人源有兩個轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，根據(jù)文獻查閱及序列比對，選擇亞型作為后續(xù)研究蛋白，cDNA全長930 bp，蛋白全長309 aa。根據(jù)人源cDNA序列設計反轉(zhuǎn)錄引物及突變引物，引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。利用點突變試劑盒的方法構(gòu)建GPR35 T108M，S294R突變載體，最后將GPR35 WT，T108M及S294R序列利用常規(guī)分子生物學技術(shù)克隆至pcDNA3.1載體(V79020，Thermo Fisher，美國)中，用于后續(xù)活性研究。引物序列見表1。

表1 GPR35野生型及突變型克隆引物序列

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293T細胞購買自上海中科院。將狀態(tài)良好的293T細胞接種到含10%胎牛血清，l%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將細胞放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度到達90%后，利用1：3的比例傳代培養(yǎng)。待細胞密度達到60%~70%后，利用轉(zhuǎn)染試劑PEI將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞到細胞內(nèi)。其中，質(zhì)粒與PEI按照1∶3的比例混合加入細胞培養(yǎng)基中，8 h后換新鮮培養(yǎng)基。24~48 h后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒蛋白表達水平達到高峰且效果持續(xù)到72~96 h。

1.3 β-arrestin招募檢測

本實驗主要參照Mitsuru Hattoriw論文中的方法檢測野生型及突變型GPR35受體招募β-arrestin能力[19]。將GPR35、GPR35T08M、GPR35S294R序列克隆至ELuC載體中。293T細胞密度達到60%后，利用PEI將GPR35-ELucC和ELucC-ARRB2轉(zhuǎn)染到細胞中。24 h后將細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后進行β-arrestin招募實驗。將不同濃度Zaprinast及熒光素酶底物加入培養(yǎng)基中，利用酶標儀檢測細胞生物熒光強度。

1.4 鈣流檢測實驗

將GPR35，GPR35T08M，GPR35S294R質(zhì)粒與Gq質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293T細胞中，24 h后將細胞接種到96孔板中，每孔2×104個細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，加入不同濃度的Zaprinast，利用Fluo-8鈣流檢測試劑盒檢測各組細胞中鈣流活性。

1.5 CRE熒光素酶報告系統(tǒng)檢測

將GPR35、GPR35T08M、GPR35S294R質(zhì)粒及CRE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293T細胞中，24 h后將細胞接種于96孔板，每孔2×104個細胞。待細胞貼壁后，加入不同濃度Zaprinast至培養(yǎng)基中，24 h后根據(jù)Dual Luciferase Reporter Assay System操作說明書，利用酶標儀檢測各組細胞熒光強度。

1.6 Gpr35敲除小鼠構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)sgRNA設計原則，針對鼠源基因第6個外顯子部分通過Zhang lab (http://crispr.mit.edu)網(wǎng)站設計sgRNA靶點。sgRNA序列為sgRNA1：GGGCCTGCTGCTCAACAGCGT GG, sgRNA2：CTATATGACCAACCTGGCTGTGG。sgRNA引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。利用顯微注射技術(shù)將sgRNA及Cas9蛋白注射進受精卵中，并將存活的受精卵移植到假孕受體母鼠內(nèi)，至母鼠生產(chǎn)得到F0代。提取小鼠組織DNA進行PCR鑒定，檢測Cas9敲除效果并繁殖獲得敲除小鼠。

1.7 DSS小鼠腸炎模型構(gòu)建

利用3%硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium, DSS)飼喂6~8周同窩小鼠5天。每日稱重小鼠體重，觀察小鼠糞便粘稠程度及便血情況。5天后將3%DSS水替換成正常的飲用水。第7天利用CO2窒息法處死小鼠，解剖并測量小鼠結(jié)腸長度，收集小鼠結(jié)腸組織用于后續(xù)實驗。

1.8 實時熒光定量PCR分析

依照Trizol試劑盒說明書提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，分光光度儀檢測RNA濃度。利用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將定量RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。依照TaKaRa實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR)檢測各類炎癥因子表達水平。qPCR引物見表2。

1.9 HE染色

新鮮小鼠結(jié)腸組織利用5%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯，石蠟包埋。樣品蠟塊組利用切片機切片，厚度為5 μm。利用蘇木精/伊紅對石蠟切片進行染色，染色結(jié)果采用顯微鏡進行觀察拍照。

表2 qPCR引物

1.10 免疫組化及免疫熒光染色

利用S-P法對小鼠結(jié)腸石蠟切片進行免疫組化及免疫熒光染色。應用BrdU抗體(ab6326，abcam，美國)，Lysosome抗體(ab24170，Abcam，美國)，稀釋比例分別為1∶500，1∶300。隨后利用DAB顯色，蘇木精復染細胞核，普通光學顯微鏡下觀察并記錄染色結(jié)果。免疫熒光實驗中F4/80抗體(70076T，CST，美國)稀釋濃度為1∶200，二抗為綠色熒光標記二抗，DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.11 Western blotting (WB)分析

結(jié)腸組織利用液氮研磨粉碎組織，利用RIPA加蛋白酶磷酸酶抑制劑(100×)裂解組織蛋白。BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將等量蛋白樣品上樣，PAGE膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜中。ERK1/2 (9102S，CST，美國)，p-ERK1/2 (8544S，CST，美國)抗體濃度為1∶1000，β-actin (3700T，CST，美國)抗體濃度為1∶5000。熒光標記羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶5000。利用Odyssey成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.12 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GPR35相關(guān)腸炎SNP位點將導致GPR35編碼蛋白突變或表達水平變化

針對基因座上腸炎相關(guān)的SNP位點進行位置分析發(fā)現(xiàn)：rs4676410位點位于第5個內(nèi)含子的位置，而rs3749171和rs3749172位點位于的編碼區(qū)(圖1 A)。對這3個SNP位點進行分析可以發(fā)現(xiàn)：rs46776410位點在基因內(nèi)含子區(qū)域，在UCSC Genome Browser網(wǎng)站查詢這個位點時發(fā)現(xiàn)rs4676410位點位置存在一個EH38E2090026遠端增強子結(jié)構(gòu)序列。rs4676410位點有可能導致表達水平變化[8]。rs3749171和rs3749172 SNP位點位于編碼區(qū)上，根據(jù)對序列比對發(fā)現(xiàn)這兩個SNP位點會造成GPR35蛋白在108位置的蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?T108M)，294位置的絲氨酸突變?yōu)榫彼?S294R)[10,11]。這個突變可能會導致GPR35蛋白結(jié)構(gòu)上的改變，影響GPR35蛋白的受體活性進而調(diào)控腸炎的發(fā)生發(fā)展(圖1 B)。因此，基于腸炎相關(guān)SNP位點在基因座位置的分析可以推測GPR35活性或表達水平變化是導致腸炎的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。

2.2 Gpr35敲除小鼠構(gòu)建

為了進一步探究在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了敲除小鼠模型。如圖所示，在第6個外顯子的編碼區(qū)域選擇兩個靶點，并設計相應sgRNA (圖2 A)。將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9蛋白通過顯微注射的方法注入受精卵，并將受精卵移植到假孕小鼠體內(nèi)。最終，在F0代中得到了5只成功敲除的小鼠.通過測序分析發(fā)現(xiàn)這5只小鼠體內(nèi)包含10種不同的突變形式(圖2 B)。后續(xù)在F1代中尋找能夠穩(wěn)定遺傳的突變個體，選擇3號小鼠(缺失104 bp)后代相互交配，最終獲得純合突變小鼠開展后續(xù)研究(圖2C)。

2.3 Gpr35敲除不會引起自發(fā)腸炎

成功構(gòu)建敲除小鼠后，首先對敲除小鼠進行生理觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠外形、生長速度、體長等沒有明顯缺陷。接下來對小鼠小腸，結(jié)腸切片染色觀察發(fā)現(xiàn)：敲除小鼠在腸上皮完整性方面與野生型小鼠并無差異(圖3 A)。小腸上皮隱窩中潘氏細胞(lysosome免疫組化標記)平均數(shù)目(WT組平均4.5±1.0個；–/–組平均4.6±1.2個，=0.804)，絨毛上杯狀細胞(Alcian blue染色標記)平均數(shù)目(WT平均16.2±2.6個，–/–組平均16.6± 2.3個，=0.7845)及結(jié)腸上皮每個視野內(nèi)杯狀細胞(Alcian blue染色標記)(WT平均68.6±11.25個，–/–組平均66.4±13.6個，=0.8234)，及位置與野生型小鼠無明顯差異(圖3 B，C)。這說明敲除后在正常狀態(tài)下不會造成腸上皮完整性破壞及自發(fā)腸炎的發(fā)生。

圖1 腸炎相關(guān)SNP位點分析

A：腸炎相關(guān)SNP位點位置分析；B：rs3749171，rs3749172位點造成GPR35氨基酸突變位置分析。

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Gpr35敲除小鼠

A：構(gòu)建敲除小鼠的sgRNA靶點序列。下劃線表示sgRNA序列，藍色字體表示PAM序列；B：F0代小鼠靶點附近的基因組測序分析結(jié)果；C：3號F0代小鼠(104 bp缺失)與野生型小鼠產(chǎn)生的F1代雜合子小鼠相互交配后F2代小鼠的基因型鑒定，野生型條帶為396 bp，敲除條帶為282 bp，WT為野生型，HZ為雜合子，HO為純合子。

2.4 Gpr35敲除能夠減緩DSS誘導腸炎模型發(fā)生發(fā)展

隨后，利用DSS誘導的腸炎模型研究在腸道完整性被破壞并發(fā)炎癥的狀況下是否參與到腸炎發(fā)生發(fā)展的進程中。利用3%DSS替代飲用水，5天后替換為純凈水構(gòu)建小鼠DSS腸炎模型，兩組小鼠在第8天時CO2窒息處死小鼠，解剖并測量兩組小鼠結(jié)腸長度，取部分結(jié)腸組織用于HE染色，免疫組化染色及免疫熒光分析。在建模期間觀察記錄敲除小鼠及野生型小鼠體重變化，糞便硬度及便血情況。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導下敲除組的小鼠在第8天時平體重下降水平明顯低于野生型組小鼠(WT組平均體重比重78.6±6.0%，Gpr35組平均比重91.1±4.4%，<0.001) (圖4 A)；與此相對應的，小鼠日常活動指數(shù)(disease activity index，DAI)也顯示出Gpr35小鼠腸炎嚴重程度弱于野生型小鼠(WT組DAI分數(shù)6.3±1.1，–/–組DAI分數(shù)3.2± 1.3，<0.001) (圖4 B)；在DSS誘導的腸炎模型中，結(jié)腸縮短程度也是評價腸炎表型的方法，對兩組小鼠結(jié)腸長度進行測量可以發(fā)現(xiàn)野生型小鼠組結(jié)腸長度遠低于敲除小鼠組(WT組平均長度4.9± 0.5 cm，–/–組平均5.7±0.3 cm，<0.01) (圖4 C)。對兩組小鼠結(jié)腸部位切片分析可以發(fā)現(xiàn)：野生型小鼠組中結(jié)腸組織腸上皮結(jié)構(gòu)破壞程度，總體潰瘍面積以及炎癥細胞浸潤水平遠高于敲除小鼠組 (圖4 D)。而相應的組織學評分也證明敲除小鼠組腸炎表型更輕微(WT組組織評分分數(shù)6.6±1.3，–/–組組織評分4.0±0.8,<0.01) (圖4 E)。

隨后利用qPCR檢測兩組小鼠結(jié)腸炎癥因子表達水平，結(jié)果顯示敲除小鼠組結(jié)腸組織腸炎相關(guān)炎癥因子如(WT組1.0±0.14，Gpr35組0.3±0.15，<0.001)，(WT組1.0±0.13，Gpr35組0.25±0.1，<0.001)(WT組1.0±0.19，Gpr35組0.4±0.08，<0.001)以及(WT組1.0±0.12，Gpr35組0.67±0.29，<0.05)表達水平低于野生型小鼠組，同時的表達量高于野生型小鼠(WT組1.0±0.23，Gpr35組3.12±0.77，<0.001) (圖5 A)。對結(jié)腸組織進行F4/80免疫熒光結(jié)果顯示，敲除組小鼠結(jié)腸粘膜巨噬細胞浸潤數(shù)目顯著低于野生型組小鼠(WT組平均每個視野52.5±7.2個巨噬細胞，–/–組平均每個視野22±3.2個巨噬細胞，<0.001) (圖5 B)。相應的，BrdU免疫組化染色也證明在敲除小鼠在DSS誘導的腸炎進程中腸上皮細胞也保持著較高的增殖水平(WT組平均每個視野87±11.6個BrdU陽性細胞，–/–組平均每個視野141±15.4個陽性細胞，<0.001) (圖5 C)。上述結(jié)果均證明敲除后能夠顯著抑制DSS誘導的腸炎模型發(fā)生發(fā)展。

圖3 自然狀態(tài)下Gpr35敲除小鼠與野生型小鼠小腸，結(jié)腸上皮完整性及功能細胞染色分析

A：小鼠小腸，結(jié)腸HE染色；B：小腸lysosome免疫組化染色(截圖部分為隱窩區(qū)域放大圖)及小腸，結(jié)腸Alcian blue染色，標尺長度200 μm；C：各組細胞染色計數(shù)統(tǒng)計分析。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；為無顯著水平差異。

圖4 DSS誘導腸炎模型體重變化，DAI指數(shù)，結(jié)腸長度及HE染色分析

利用3%DSS水溶液飼喂兩組小鼠，第5天換成正常飲用水，第8天處死小鼠取材。實驗期間觀察小鼠體重變化等各項指標。A：兩組小鼠每日體重變化(以第1天體重為基準)；B：兩組小鼠每日DAI活動指數(shù)評分；C：第8天實驗中止后小鼠結(jié)腸長度測量；D：HE檢測兩組小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)，標尺長度2000 μm；E：組織學評分評價兩組小鼠腸上皮損傷水平。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；*:<0.05, **:<0.01, ***:<0.001。

2.6 Gpr35敲除能夠激活ERK1/2信號通路通路抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展

ERK1/2信號通路是GPCR下游重要的信號通路組成部分，GPCR能夠通過Gi/o，Gs及β-arrestin 等第二信使因子調(diào)控ERK1/2信號通路[20]。WB檢測兩組小鼠結(jié)腸組織中Erk1/2及p-Erk1/2表達水平發(fā)現(xiàn)：相較于野生型小鼠組，敲除后能夠顯著促進結(jié)腸上皮細胞Erk1/2磷酸化水平(圖6)。這說明敲除后能夠通過上調(diào)下游Erk1/2相關(guān)信號通路活性的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展。

2.7 rs3749171和rs3749172位點突變增強GPR35受體活性

為了探究上述兩個SNP突變對GPR35受體活性的影響，構(gòu)建了GPR35，GPR35T108M及GPR35S294R表達載體。利用Zaprinast作為GPR35受體激動劑，分別采用鈣流檢測(GPR35下游Gq相關(guān)信號通路)，β-arrestin招募(GPR35下游β-arrestin招募相關(guān)信號通路)以及CRE熒光素酶報告系統(tǒng)(cAMP響應元件、GPR35下游Gi/o和Gs共同調(diào)節(jié)的信號通路) 3種方式研究突變對GPR35受體活性的影響。結(jié)果表明：GPR35T108M，GPR35S294R突變體的受體活性在不同濃度Zaprinast刺激下，下游信號通路活性如鈣流響應強度(圖7 A)，β-arrestin招募水平(圖7 B)以及下游CRE表達抑制(圖7 C)方面均強于野生型GPR35 (表3)。這些結(jié)果提示rs3749171與rs3749172SNP位點突變能夠增強GPR35對不同濃度Zaprinast激動劑敏感性及下游信號通路活性。

圖5 DSS誘導腸炎模型中炎癥因子表達水平，巨噬細胞浸潤水平及細胞增殖分析

A：qPCR分析兩組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達水平；B：免疫熒光染色分析巨噬細胞在兩組小鼠腸上皮粘膜中浸潤水平，標尺長度100 μm；C：免疫組化分析兩組小鼠腸上皮增殖水平，標尺長度200 μm。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；*:<0.05, ***:<0.001。

圖6 Gpr35敲除對DSS誘導腸炎模型中Erk1/2信號通路活性影響

A：WB分析兩組小鼠結(jié)腸Erk1/2及p-Erk1/2蛋白表達水平；B:灰度分析兩組小鼠p-Erk1/2表達量占總體Erk1/2蛋白比例。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；**:<0.01。

圖7 rs3749171與rs3749172突變位點對GPR35受體活性影響分析

A：鈣流檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下鈣流響應強度；B：β-arrestin招募實驗檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下熒光強度；C：CRE熒光素酶報告系統(tǒng)檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下CRE轉(zhuǎn)錄活性。為無顯著性差異，*:<0.05, ***:<0.001。

表3 GPR35、GPR35T108M及GPR35S294R受體活性變化(歸一化處理)統(tǒng)計及顯著性分析

value指GPR35T108M，GPR35S294R與GPR35受體活性對比顯著性分析結(jié)果。

3 討論

腸炎是一種受多種機制調(diào)控的慢性炎癥疾病。目前腸炎的治療手段主要包括糖皮質(zhì)激素，炎癥因子抗體，以及菌群調(diào)節(jié)等方法。上述治療方法都能夠在一定程度上緩解腸炎表型，但是依舊存在治療價格高，見效慢，效果差等缺點[21~23]。因此，研究腸炎發(fā)生發(fā)展機制及治療靶點篩選依舊是一個很重要的課題。隨著基因組分析及測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究開始采用GWAS技術(shù)研究腸炎易感的SNP位點，并將其應用于腸炎風險預測及后續(xù)機制研究[8]。目前已經(jīng)篩選出上百個腸炎相關(guān)SNP位點，但是這些SNP位點調(diào)控基因表達，活性以及后續(xù)影響腸炎的發(fā)生發(fā)展的機制依舊需要大量的工作去驗證分析。

GPCR家族作為最大的一類細胞膜受體家族，能夠調(diào)控多種細胞生理進程[13]。30%的現(xiàn)代藥物以GPCR作為治療靶點，而作為GPCR家族成員的一員，具有巨大的研究意義及藥物開發(fā)前景[24]。在腸炎方面，GWAS研究分析證明基因座上多個SNP位點與腸炎發(fā)生高度相關(guān)，但是對于在腸炎發(fā)生發(fā)展進程中的作用一直沒有一個統(tǒng)一的認知[9,10,11,15]。本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠用于研究在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常情況下Gpr35小鼠腸上皮完整性及細胞構(gòu)成與野生型小鼠沒有差異，不會引起自發(fā)腸炎。但是在DSS腸炎誘導模型中，敲除小鼠在小鼠體重下降水平，DAI評分，結(jié)腸長度縮短程度，炎癥因子表達水平以及巨噬細胞浸潤等多個炎癥損傷評價標準遠低于野生型小鼠，這說明能夠促進腸炎的發(fā)生發(fā)展。而這個結(jié)果與社交壓力積累犬尿酸通過促進腸炎發(fā)生發(fā)展的研究中促進腸炎發(fā)生發(fā)展的研究結(jié)果一致[15]。而對于雙羥萘酸的矛盾性結(jié)果，有研究證明雙羥萘酸是人源GPR35特異激動劑，而對鼠源Gpr35基本沒有激動效果[25]。這個可以解釋雙羥萘酸在DSS小鼠腸炎模型中起到的保護作用這個矛盾的結(jié)果。因此，結(jié)合本文研究與文獻分析結(jié)果，最終可以確認在腸炎的發(fā)生發(fā)展的進程中起到促進作用。

本研究對腸炎SNP易感位點進行篩選，發(fā)現(xiàn)3個腸炎相關(guān)SNP位點位于基因范圍內(nèi)，其中rs3749171和rs3749172位于編碼區(qū)，最終導致GPR35突變。針對rs3749171位點，研究人員比對了不同種屬在該位置的氨基酸保守性，發(fā)現(xiàn)GPR35在108位置的蘇氨酸位點在不同種屬不具備進化保守性，這預示著GPR35T108M突變可能會導致GPR35活性的改變[10]。該突變位置在GPR35第3個跨膜區(qū)位置，該位點發(fā)生突變可能會導致GPR35受體識別部位空間位阻發(fā)生改變，導致GPR35對配體敏感性發(fā)生變化。對于rs3749172位點，研究人員也證明該位點突變與動脈粥樣硬化及冠狀動脈疾病風險具有相關(guān)性，而對其突變氨基酸位置進行分析則發(fā)現(xiàn)其突變位置位于GPR35的C末端，294位的絲氨酸突變?yōu)槔野彼峥赡芘cGPR35與下游G蛋白及β-arrestin結(jié)合活性產(chǎn)生影響最終導致GPR35受體活性改變[26]。

GPR35與炎癥及腸炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制目前主要是通過ERK1/2相關(guān)信號通路活性調(diào)節(jié)腸上皮損傷愈合能力以及通過鈣離子相關(guān)信號通路招募巨噬細胞等單核細胞遷移到炎癥部位[16,27]。而與之相對應的GPR35下游包括Gi/o，Gq在內(nèi)的小G蛋白激活以及β-arrestin招募相關(guān)[20,28,29]。本研究通過體外構(gòu)建GPR35、GPR35T108M、GPR35S294R表達載體，利用鈣流檢測，β-arrestin招募實驗以及CRE熒光素酶報告系統(tǒng)對其進行受體活性分析，最終證明rs3749171，rs3749172位點突變會導致GPR35受體活性增強，下游相關(guān)信號通路激活。最新的關(guān)于在結(jié)腸癌的研究中也證明了GPR35-T108M突變增強了GPR35調(diào)控下游Na/K-ATP酶的活性的能力[30]。結(jié)合前面的實驗結(jié)果，本研究能夠得到最終結(jié)論：腸炎相關(guān)SNP位點rs3749171和rs3749172能夠增強GPR35受體活性及下游相關(guān)信號通路進而促進腸炎的發(fā)生發(fā)展。而這個結(jié)果也與前文敲除動物模型結(jié)果一致，最終從動物模型及病人SNP相關(guān)易感群體分析兩個方向共同驗證了在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

ERK1/2信號通路是GPCR下游重要的信號通路組成部分，能夠調(diào)控細胞增殖，凋亡及遷移等細胞進程[20]。而對敲除小鼠腸炎模型腸上皮WB分析發(fā)現(xiàn)：相較于野生型小鼠，敲除后，小鼠結(jié)腸上皮細胞中ERK1/2磷酸化水平在腸炎發(fā)生過程中顯著上調(diào)。這說明能夠通過抑制ERK1/2信號通路的方式促進腸炎的發(fā)生發(fā)展。在腸炎病理進程中，腸上皮ERK1/2相關(guān)信號通路能夠通過調(diào)控腸上皮粘膜傷口愈合的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展[16,31]。這些研究與DSS腸炎模型中敲除小鼠腸上皮ERK1/2磷酸化水平上調(diào)的結(jié)果保護腸炎相關(guān)論證匹配。實驗結(jié)果與前人研究基礎相結(jié)合證明了能夠通過抑制下游ERK1/2相關(guān)信號通路活性的方式促進腸炎的發(fā)生發(fā)展。

在腸炎發(fā)生發(fā)展進程中，腸道菌群在其中起到了重要的作用。腸道菌群的多種代謝產(chǎn)物通過腸上皮細胞GPR43，TLR4等受體正向或負向調(diào)節(jié)腸上皮通透性及免疫反應強度，而腸道免疫系統(tǒng)則通過分泌抗菌肽，調(diào)節(jié)自身免疫活性的方式維持腸道內(nèi)菌群穩(wěn)定及腸道上皮通透性等生理狀態(tài)[32~34]。腸道菌群失衡及機體應對腸道菌群免疫反應失衡均會導致腸炎的發(fā)生發(fā)展[35]。在腸上皮細胞中高表達且能夠識別犬尿酸在內(nèi)的多種細菌代謝產(chǎn)物，調(diào)控下游相關(guān)信號通路活性變化[36,37]。這說明在腸道系統(tǒng)中能夠通過監(jiān)測各類細菌代謝產(chǎn)物濃度變化的方式調(diào)控下游信號通路激活/抑制程度，進而調(diào)節(jié)腸上皮通透性及下游免疫系統(tǒng)活性。在發(fā)生SNP相關(guān)突變后，GPR35識別犬尿酸等代謝物配體能力及激活下游信號通路的能力增強，并持續(xù)促進/抑制下游腸上皮細胞及免疫細胞抵抗細菌入侵的進程。在發(fā)生腸上皮損傷或菌群失調(diào)等特殊情況下，GPR35相關(guān)信號通路異常活化會導致免疫系統(tǒng)與菌群的平衡更容易被破壞，大概率提升腸炎發(fā)病幾率及腸炎嚴重程度。

綜上所述，本研究初步驗證了腸炎相關(guān)SNP位點rs3749171和rs3749172能夠上調(diào)GPR35受體活性，且GPR35激活能夠促進DSS誘導的腸炎的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果將為后續(xù)腸炎發(fā)生病機制及后續(xù)腸炎治療藥物的開發(fā)提供新的靶點。

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Inflammatory bowel disease susceptible genepromotes bowel inflammation in mice

Yansen Zheng, Lingang Zhuo, Dali Li, Mingyao Liu

Inflammatory bowel disease (IBD) has emerged as a public health challenge with high incidence, recurrence rates and low cure rate. Moreover, sustained inflammation increases the risk of colorectal cancer. The occurrence and progression of IBD are closely related to the genetic mutation. Previous genome-wide association studies (GWAS) analysis demonstrated that the susceptibility loci rs4676410, rs3749171, and rs3749172 in thegene locus increase the risk of IBD, but no direct evidence on the function ofin IBD progression has been shown. To investigate the role ofin IBD, CRISPR/Cas9 technology was employed to construct aknockout mouse strain. TheGpr35mice exhibited lower susceptibility to dextran sodium sulfate-induced IBD model than the wildtype group with a significant reduction in body weight loss, DAI score, intestinal epithelial injury, and macrophage cell infiltration. To explore how the IBD susceptibility loci rs3749171 and rs3749172 regulate GPR35 activity, two mutant forms of GPR35 (T108M and S294R) were constructed. By analyzing the activity of GPR35 downstream signaling pathway, the two mutation forms of GPR35 exhibited higher receptor activity to Zaprinast than the wildtype GPR35. Finally, the Western blotting analysis found an elevated phosphorylation level of ERK1/2 inGpr35colon epithelial after DSS treatment, demonstrating that the loss function ofalleviates the IBD syndrome by activating the ERK1/2 signaling pathway. In summary, the IBD susceptibility loci rs3749171 and rs3749172 may promote the disease progression by activating GPR35 activity, providing a potential drug target for the treatment of inflammatory bowel disease.

rs3749171; rs3749172;; IBD; animal model

2020-11-18;

2020-12-31

國家重點研發(fā)計劃基金項目(編號：2019YFA0110802)和國家自然科學基金面上項目(編號：81670470, 81873685)資助[Supported by grants from National Key R&D Program of China (No. 2019YFA0110802), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81670470, 81873685)]

鄭燕森，在讀博士研究生，專業(yè)方向：腸炎分子機制研究。E-mail: zhengysen@126.com

李大力，博士，教授，研究方向：動物模型構(gòu)建新技術(shù)開發(fā)及基因編輯技術(shù)在基因治療中的應用。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn劉明耀，博士，教授，研究方向：G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)及其信號轉(zhuǎn)導途徑在疾病發(fā)生過程中的作用。E-mail: myliu@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-392

2021/1/28 8:34:48

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210127.1133.001.html

(責任編委: 盧大儒)