伊立替康聯(lián)合X線照射對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

席棟賓，張懷霞，徐玉珩，劉 毅，張延英

1酒泉市人民醫(yī)院胃腸外科，甘肅 酒泉 735000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，甘肅 蘭州 730000

結(jié)直腸癌是世界上最常見的癌癥之一，也是與癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。近年來，盡管發(fā)達國家的結(jié)直腸癌發(fā)病率已開始下降，但發(fā)展中國家的結(jié)直腸癌發(fā)病率仍保持急劇上升的態(tài)勢［2］。外科手術(shù)是目前結(jié)直腸癌的主要治療手段，但術(shù)后往往因發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而影響預(yù)后［3-4］。遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，肝臟是結(jié)直腸癌患者最常見的轉(zhuǎn)移位點［1］。輔助放化療可以降低術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率、提高患者的長期生存率。伊立替康（CPT?11）是一種選擇性拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤治療，包括轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)患者以及惡化病例的治療。有研究報道，CPT?11 可抑制食管癌EC109 細(xì)胞增殖并具有放射增敏作用［5］，而有關(guān)伊立替康聯(lián)合X 線的聯(lián)合應(yīng)用對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT?116的作用研究尚未曾報道，故本實驗研究CPT?11 對人結(jié)腸癌細(xì)胞系體外增殖以及放射敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

HCT?116 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，CPT?11、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、普通RIPA 裂解液和AO 染色液均購自北京索萊寶科技有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，兔抗p53、p21 及內(nèi)參GAP?DH 抗體購自美國Immunoway公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Forma公司，酶標(biāo)儀購自美國BIO?RAD公司，全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)購自美國Protein Simple 公司，熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 HCT?116細(xì)胞的體外培養(yǎng)及傳代

HCT?116 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加入100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，每3 d傳代1 次，選對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗

常規(guī)消化對數(shù)期細(xì)胞后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個細(xì)胞密度接種到96孔板，每孔體積為200 μL。貼壁后，用不同濃度CPT?11（10、20、30、40、50 μg/mL）作用24 h 或單次不同劑量X 線（3、6、9、12、15 Gy）照射，每個劑量組3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。每孔加150 μL DMSO 并振蕩10 min。在酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定各孔吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.2.3 克隆形成實驗

常規(guī)消化對數(shù)期細(xì)胞后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制單細(xì)胞懸液，以每孔1 000個細(xì)胞密度接種到6 孔板，每孔體積為200 μL。貼壁后，6 Gy X線照射（照射組）或預(yù)先用10 μg/mL濃度CPT?11 作用24 h 后聯(lián)合6 Gy X 線照射（聯(lián)合處理組），繼續(xù)培養(yǎng)10 d 后，加入5 mL 甲醇固定10 min。加入適量0.1% 結(jié)晶紫染色15 min，在顯微鏡下計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。計算公式為：克隆形成率=（克隆形成平均數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白提取和全自動蛋白表達定量分析

常規(guī)收集3 組細(xì)胞，并用預(yù)冷PBS 洗1 遍，每瓶細(xì)胞加入200 μL RIPA 裂解液于冰上裂解10 min。將裂解后的樣品12 000g離心5 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。按照Wes 標(biāo)準(zhǔn)流程上機檢測，終濃度為1 mg/mL。

1.2.5 AO/EB實驗

常規(guī)消化對數(shù)期細(xì)胞后，接種到6 孔板。貼壁后，6 Gy X線照射（照射組）或預(yù)先用10 μg/mL濃度CPT?11 作用24 h 后聯(lián)合6 Gy X 線照射（聯(lián)合處理組）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入5 mL甲醇固定10 min。加入AO/EB 工作液，室溫避光染色20 min，倒置熒光顯微鏡下計數(shù)并拍照。吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，故細(xì)胞核呈綠色熒光；對于凋亡細(xì)胞，因染色質(zhì)固縮或斷裂形成凋亡小體，表現(xiàn)為黃綠色熒光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組細(xì)胞增殖率比較采用廣義線性模型分析，以劑量作為自變量，試驗組別作為分組因素，劑量和組別的乘積作為交互因素，對不同試驗組別得到的兩條直線的斜率進行比較，若交互項有統(tǒng)計學(xué)意義，說明自變量劑量對結(jié)果變量細(xì)胞增殖率的影響在不同組別中有差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPT?11對HCT?116細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT 法檢測10～50 μg/mL 的CPT?11 作用HCT?116 細(xì)胞后的增殖情況，結(jié)果顯示在此范圍內(nèi)呈劑量依賴性抑制細(xì)胞增殖（圖1）。根據(jù)以往的研究，CPT?11對HCT?116細(xì)胞的IC20為9.64 μg/mL，為避免CPT?11 的毒性作用，本實驗選擇10 μg/mL 進行后續(xù)研究。

圖1 不同濃度CPT?11對HCT?116細(xì)胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of different concentrations of CPT?11 on proliferation of HCT?116 cells

2.2 單次不同劑量X 線照射對HCT?116 細(xì)胞增殖的影響

對于經(jīng)10 μg/mL CPT?11 預(yù)處理24 h 的HCT?116 細(xì)胞和對照HCT?116 細(xì)胞分別給予3、6、9、12、15 Gy X線照射，恢復(fù)24 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組增殖抑制率大于照射組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.34，P＜0.001）。隨著照射劑量的增加，聯(lián)合處理組的增殖抑制作用更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 不同劑量X線照射對HCT?116細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect of different doses of X?ray irradiation on proliferation of HCT?116 cells

2.3 CPT?11 聯(lián)合X 線照射對HCT?116 細(xì)胞克隆形成的影響

通過克隆形成實驗，檢測對照組、照射組和聯(lián)合處理組集落形成情況，結(jié)果與對照組相比，照射組和聯(lián)合處理組的集落形成數(shù)量都明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且聯(lián)合處理組的集落形成數(shù)量少于照射組（P＜0.05，圖3）。

圖3 CPT?11聯(lián)合X線照射對HCT?116細(xì)胞克隆形成的影響Figure 3 Effect of CPT?11 combined with X?ray irradia?tion on colony formation of HCT?116 cells

2.4 CPT?11 聯(lián)合X 線照射對HCT?116 細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，照射組和聯(lián)合處理組的凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合處理組的凋亡率更高，明顯大于照射組（P＜0.05，圖4）。

圖4 CPT?11聯(lián)合X線照射對HCT?116細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of CPT?11 combined with X?ray irradia?tion on apoptosis of HCT?116 cells

2.5 CPT?11聯(lián)合X線照射對HCT?116細(xì)胞p21、p53表達的影響

X線照射后，恢復(fù)6 h，與對照組相比，照射組和聯(lián)合處理組的p21 和p53 蛋白均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合處理組的p21 和p53 蛋白水平高于照射組（P＜0.05，圖5）。

3 討論

圖5 CPT?11 聯(lián)合X 線照射對HCT?116 細(xì)胞p21、p53 表達的影響Figure 5 Effect of CPT?11 combined with X?ray irradia?tion on the expression of p21 and p53 in HCT?116 cells

CPT?11 是喜樹堿（camptothecin，CPT）的一種水溶性半合成衍生物。因為CPT?11 的廣泛抗腫瘤活性，臨床上用于肺癌、胃癌、卵巢癌和淋巴癌等多種腫瘤的治療［6］。在DNA復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄過程中，其通過與拓?fù)洚悩?gòu)酶?1（Topo?1）結(jié)合，共同形成DNA Topo?1復(fù)合物。在此過程中，CPT?11及活性代謝產(chǎn)物（SN?38）可以通過與該復(fù)合物結(jié)合，從而阻斷DNA 復(fù)制而達到抗腫瘤作用［7-8］。目前，CPT?11已獲批用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的輔助治療，而以往的多項研究也發(fā)現(xiàn)其聯(lián)合放療時能增加放療效果［5，9-11］。在伊立替康聯(lián)合放療治療小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的報道中，其可顯著降低患者的病死率，改善患者的生存狀況［11］，并且該治療方法的有效性和安全性均較高，可有效提高疾病控制率，減少不良反應(yīng)，提高患者的耐受程度。此外，CPT?11可有效抑制放療早期宮頸癌細(xì)胞的增殖，提高放療誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示宮頸腫瘤50%消退時間明顯縮短，腫瘤體積縮?。?］。大多數(shù)放療增敏劑的作用機制是，通過抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡來增強放射線對細(xì)胞的殺傷作用，故本研究進一步探討CPT?11聯(lián)合X 線照射對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT?116 增殖和凋亡的影響。

CPT?11 的主要不良反應(yīng)是骨髓抑制和胃腸道不良反應(yīng)，呈劑量依賴性，嚴(yán)重的腹瀉反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，在10～50 μg/mL 范圍內(nèi)，CPT?11呈濃度依賴的方式抑制HCT?116細(xì)胞增殖，與以往研究報道一致。為進一步研究CPT?11聯(lián)合X 線照射對HCT?116 細(xì)胞的放療增敏效果，本研究選擇10 μg/mL的CPT?11處理，約為CTP?11 對HCT?116 細(xì)胞的IC20濃度，毒性較輕。在MTT 實驗和克隆形成實驗中，與對照組和照射組相比，聯(lián)合處理組增殖率明顯提高，且隨著照射劑量的增加，聯(lián)合處理組的增殖抑制作用更加明顯。CPT?11 在較低濃度下即具有增殖抑制和放射增敏作用，提示其臨床應(yīng)用中可采用低濃度CPT?11 聯(lián)合X 線照射來提高結(jié)直腸癌的治療效果，既可以減輕不良反應(yīng)，還可以減輕患者負(fù)擔(dān)、提高生存率。

放射治療引起腫瘤細(xì)胞DNA 損傷進一步引起凋亡，是腫瘤治療的基本策略。為進一步研究CPT?11 聯(lián)合X 線照射對HCT?116 細(xì)胞凋亡的影響，AO/EB染色結(jié)果顯示聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率顯著提高，Western blot 檢測其p21和p53蛋白水平也高于照射組，進一步提示應(yīng)用CPT?11可增加HCT?116對X線照射的敏感性，誘導(dǎo)其凋亡。p53 是細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌基因，廣泛參與DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡等過程，對維持基因組的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要［12］。本研究中，HCT?116 細(xì)胞接受電離輻射及CPT?11處理后時，p53 能被迅速激活進而促進多種重要下游靶基因如p21 的激活，從而促進凋亡的發(fā)生。

綜上所述，CPT?11 可抑制食管癌HCT?116細(xì)胞增殖并具有放射增敏作用，同時誘導(dǎo)凋亡，為臨床上結(jié)腸癌的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。