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    白樺BpNAC012基因調(diào)控白樺木質(zhì)部發(fā)育表達譜分析

    2021-02-26 08:40:28郭依萍劉佳欣楊傳平
    植物研究 2021年2期
    關(guān)鍵詞:木質(zhì)部白樺細(xì)胞壁

    郭依萍 劉佳欣 于 穎 王 超 楊傳平

    (林木遺傳育種國家重點實驗室,東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱 150040)

    NAC 基因是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一,其命名是由矮牽牛基因NAM[1]以及擬南芥基因ATAF 和CUC2 的首字母縮略詞構(gòu)成[2]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子具有多種功能,如參與植物次生長,在細(xì)胞分裂和植株衰老中發(fā)揮作用,參與激素調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3~4]。植物的次生生長包括維管組織形成、次生細(xì)胞壁形成、木質(zhì)化、細(xì)胞程序化死亡以及心材形成等過程[5~6]。近年研究發(fā)現(xiàn)多個NAC 基因?qū)?xì)胞次生壁的形成起著正調(diào)控作用。例如擬南芥SND1(Secondary wall-associated NAC domain 1),NST1/2/3(NAC secondary wall thicken promoting factor 1/2/3)和VND6/7(Vascular-related NAC domain 6/7)。在擬南芥次生壁正常形成的過程中,SND2/3、MYB103/85/52/54/69/42/43/20 和KNAT7等11 個SND1 轉(zhuǎn)錄因子是必需的。抑制SND2/3、MYB103/85/52/54 和KNAT7 的表達,能顯著減少纖維細(xì)胞次生壁增厚;而SND2/3 和MYB103 的過量表達,則能促進纖維中次生壁的增厚。SND1 在莖的維管束間纖維和木質(zhì)部纖維中特異表達,過表達SND1促進非厚壁細(xì)胞中次生壁的沉積;而抑制SND1 的表達,纖維中缺失次生壁[7~8]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子對次生壁合成的調(diào)控是通過對下游靶基因的調(diào)控完成的。例如,VND7 能激活下游轉(zhuǎn)錄因子基因及一些參與次生壁形成、細(xì)胞壁化學(xué)修飾和細(xì)胞凋亡等非轉(zhuǎn)錄因子基因的表達[9]。

    前期研究結(jié)果顯示,BpNAC012 基因調(diào)控白樺(Betula platyphylla Suk.)次生細(xì)胞壁的合成[10]。本研究主要以次生生長相關(guān)的白樺BpNAC012 基因為研究對象,對其在白樺木質(zhì)部中調(diào)控的下游基因進行研究。通過對過表達、抑制表達轉(zhuǎn)基因株系及對照株系莖部轉(zhuǎn)錄組進行分析,鑒定差異表達基因,初步確定BpNAC012基因調(diào)控白樺木質(zhì)部發(fā)育的基因表達途徑,為白樺的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    分別取3 個月苗齡的轉(zhuǎn)基因白樺和野生型白樺,去除葉片和根,作為轉(zhuǎn)錄組測序材料,每個處理3 次生物學(xué)重復(fù),每次生物學(xué)重復(fù)5~7 株(抑制表達株系莖小,7 株可滿足建庫要求)。WT為野生型株系,OE為基因過表達株系,RS為抑制表達株系。

    1.2 建庫測序流程

    在RNA 樣品檢測合格后,利用帶有Oligo(dT)的磁珠富集總RNA 中的mRNA。隨后將mRNA 打斷成短片段,以mRNA 為模板,利用random hexamers 合成cDNA 第一鏈,利用PCR 合成cDNA 第二鏈,AMPure XP beads 純化雙鏈cDNA。PCR 擴增獲得測序所用文庫。為保證文庫質(zhì)量符合測序要求,使用Qubit2.0 對文庫進行初步定量,隨后使用Agilent 2100 對文庫的插入長度進行檢測,插入長度符合要求后,使用Q-PCR 方法準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度后(有效濃度>2 nmol·L-1),進行Illumina HiSeq測序。

    1.3 生物信息學(xué)分析

    利用Corset程序?qū)D(zhuǎn)錄本進行層次聚類,以聚類后序列為參考,進行后續(xù)分析。

    1.3.1 測序質(zhì)量評估

    通過測序錯誤率分布檢查來檢測測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量,用Qphred=-10log10(e)來衡量,其中測序錯誤率用e表示。將測序得到的原始測序序列(Sequenced Reads)或者raw reads去除帶接頭(adapter)的reads;去除N(N表示無法確定堿基信息)比例大于10%的reads;去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Qphred <=20的堿基數(shù)占整個reads的50%以上的reads)。

    1.3.2 轉(zhuǎn)錄本拼接

    對于無參考基因組的項目,獲得clean reads后,采用Trinity 進行轉(zhuǎn)錄本拼接。利用比對上轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)和表達模式對轉(zhuǎn)錄本進行Corset層次聚類(https://code.google.com/p/corset-project/)。對轉(zhuǎn)錄本及聚類序列長度分別進行拼接轉(zhuǎn)錄本長度分布統(tǒng)計。

    1.3.3 基因功能注釋及CDS預(yù)測

    利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋,包括:Nr,Nt,Pfam,KOG/COG,Swiss-prot,KEGG,GO。從比對結(jié)果中提取出轉(zhuǎn)錄本的ORF 編碼框信息,并按照標(biāo)準(zhǔn)密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列(按照5′->3'的順序);對于沒有比對結(jié)果或者比對未預(yù)測出結(jié)果的序列,則采用estscan(3.0.3)軟件預(yù)測其ORF。

    1.3.4 基因表達水平分析

    采用RSEM 軟件將每個樣品的clean reads 往參考序列(ref)上做mapping。進行參考序列比對。比對結(jié)果進行統(tǒng)計,得到樣品比對的readcount 數(shù)目,并對其進行FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)轉(zhuǎn)換,來進行基因的表達水平分析。

    1.3.5 差異表達分析

    利用基因表達水平分析中得到的readcount數(shù)據(jù)進行基因差異表達分析。采用DESeq2 軟件,篩選閾值為padj<0.05 且|log2FoldChange|>1,對原有假設(shè)檢驗得到的p-value進行校正。

    1.3.6 差異基因富集分析

    利用GOseq 進行GO 富集分析。以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Pathway 為單位,應(yīng)用超幾何檢驗,找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway,進行Pathway 顯著性富集分析。繪制KEGG 富集散點圖,KEGG 富集程度通過Rich factor、qvalue 和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量。其中Rich factor指差異表達的基因中位于該pathway 條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該pathway 條目的基因總數(shù)的比值。qvalue 是做過多重假設(shè)檢驗校正之后的Pvalue,qvalue 的取值范圍為[0,1],越接近于零,表示富集越顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA質(zhì)量分析

    RNA 質(zhì)量決定著文庫的質(zhì)量,RNA 提取質(zhì)量分析結(jié)果顯示如圖1,樣品質(zhì)量滿足建庫測序要求,且總量滿足2次以上建庫需要。

    2.2 表達譜測序結(jié)果評估

    2.2.1 測序質(zhì)量評估

    測序過程存在錯誤率,測序錯誤率分布檢查可以反映測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。一般情況下,單個堿基位置的測序錯誤率應(yīng)該低于1%。從表1可以看出,本文庫測序錯誤率均低于0.1%,說明測序質(zhì)量符合要求。

    從表2 可以看出,6 個文庫的G/C 含量符合正常規(guī)律。接頭序列、未知序列、低質(zhì)量序列等不合格序列的百分比低于2%,cleanread 應(yīng)占原始數(shù)據(jù)的90%以上,這樣的數(shù)據(jù)為合格數(shù)據(jù)。從表1 和附圖1 可以看出,該文庫cleanread 占原始數(shù)據(jù)的比例均符合后續(xù)分析的要求。

    2.2.2 轉(zhuǎn)錄本拼接

    對轉(zhuǎn)錄本及聚類序列長度分別進行統(tǒng)計,結(jié)果見表2、附表1 和附圖2。從圖表中可以看出,本次分析轉(zhuǎn)錄組的基因長度分布符合進一步分析的要求。

    表1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況一覽表Table 1 List of data output quality

    表2 拼接長度頻數(shù)分布情況Table 2 List of frequency distribution of splice length

    2.3 基因功能注釋

    為獲得基因功能全面信息,對本研究文庫獲得的數(shù)據(jù)進行7 大數(shù)據(jù)庫基因功能注釋,包括:Nr,Nt,Pfam,KOG/COG,Swiss-prot,KEGG,GO 數(shù)據(jù)庫。本項目數(shù)據(jù)在7 大數(shù)據(jù)庫中的注釋成功率情況見表3。從注釋成功率可以看出,獲得功能注釋的基因比率符合后續(xù)基因功能分析的要求。

    表3 基因注釋成功率統(tǒng)計Table 3 Gene annotation success rate statistics

    2.4 基因表達水平分析

    2.4.1 參考序列比對

    參考序列比對統(tǒng)計結(jié)果見附表2。在RNAseq 技術(shù)中,F(xiàn)PKM 分析是目前最為常用的基因表達水平估算方法。所以我們將readcount數(shù)進行了FPKM轉(zhuǎn)換用于下一步差異表達分析。

    2.4.2 基因差異表達分析及差異基因篩選

    本研究3個處理間共獲得差異表達基因1 476條。從圖2 中可以看出,與對照相比,過表達株系OE 中上調(diào)的基因有627 條,下調(diào)的基因有229 條,抑制表達株系中上調(diào)的基因有299條,下調(diào)表達的基因有207 條。說明在轉(zhuǎn)基因株系中,BpNAC012基因的表達影響一系列的基因表達變化,進而調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育性狀的變化。

    2.5 差異基因GO富集分析

    GO 功能顯著性富集分析給出與基因組背景相比,在差異表達基因中顯著富集的GO 功能條目,從而給出差異表達基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。結(jié)果如表4 所示。差異表達基因主要富集在轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的GO 分類中。說明轉(zhuǎn)錄因子在本實驗樣本的基因表達差異及性狀差異中起到重要作用。統(tǒng)計被顯著富集的各個GOterm 中的基因數(shù),以柱狀圖的形式展示,如圖3 所示。結(jié)合差異表達基因數(shù)量分析,從圖中可以看出,過表達BpNAC012 能夠調(diào)控更多的基因表達變化。而抑制表達BpNAC012 更多的是影響蛋白修飾和轉(zhuǎn)運類基因的表達。

    表4 樣品中差異基因富集的Gene Ontology分類Table 4 Gene Ontology classification of differential gene enrichment in samples

    2.6 差異基因KEGG富集分析

    差異基因KEGG 富集散點圖(見圖4)圖形化展示了KEGG 富集分析結(jié)果。從圖4中可以看出,涉及受體信號通路、營養(yǎng)代謝、氨基酸合成及苯丙烷生物合成相關(guān)代謝通路基因比較富集。其中苯丙烷生物合成,是次生細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵代謝通路,因此說明BpNAC012 的表達,調(diào)控了次生細(xì)胞壁合成的代謝通路。

    2.7 表達差異最大的前十位基因分析

    對過表達株系相對于野生型表達量上調(diào)最大的10個基因和抑制表達株系相對于野生型表達量下調(diào)最大的10 個基因進行分析(見表5~6)??勺C明這些基因強烈受BpNAC012 的調(diào)控,并在過表達或抑制表達株系發(fā)育的生理程序中起著重要作用。

    2.8 BpNAC012 調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育及次生壁合成相關(guān)基因的表達

    在BpNAC012過表達株系中,鑒定到一些和纖維素合成相關(guān)的基因(見表7),和一些細(xì)胞壁相關(guān)酶類。同時,鑒定了一些與木質(zhì)素合成及沉積相關(guān)的基因,和木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)的基因。這些基因可能受BpNAC012 的誘導(dǎo),參與過表達轉(zhuǎn)基因白樺木質(zhì)部發(fā)育及次生細(xì)胞壁的合成。

    在抑制表達株系中,鑒定到一些木質(zhì)部發(fā)育及細(xì)胞壁合成相關(guān)基因下調(diào)表達(見表8),如一些與纖維素合成相關(guān)的基因下調(diào)表達。

    2.9 BpNAC012 調(diào)控其它轉(zhuǎn)錄因子基因的差異表達

    在過表達和抑制表達株系中,分別鑒定到了與野生型對照差異表達的轉(zhuǎn)錄因子(見表9~11)。其中,與野生型對照相比,在過表達株系中鑒定了97 個上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄因子,15 個下調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄因子,在抑制表達株系中,鑒定了42個上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄因子,15個下調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄因子。

    表6 抑制表達株系中差異表達倍數(shù)最高的前10位基因Table 6 The top 10 genes with the highest differential expression folds in the suppressed expression lines

    3 討論

    BpNAC012 對白樺次生細(xì)胞壁合成的調(diào)控是通過下游基因表達變化實現(xiàn)的,與對照相比,過表達株系OE 中上調(diào)的基因有627 條,下調(diào)的基因有229 條,抑制表達株系中上調(diào)的基因有299 條,下調(diào)表達的基因有207 條。兩個轉(zhuǎn)錄組中共有140條基因差異表達。說明在轉(zhuǎn)基因株系中,Bp?NAC012 基因的表達影響了一系列的基因表達變化,進而調(diào)控次生壁的合成,這些差異表達基因可能參與白樺次生細(xì)胞壁及木質(zhì)部形成的調(diào)控。

    在轉(zhuǎn)基因株系中,表達變化最明顯的基因,可能對于BpNAC012 轉(zhuǎn)基因造成的變化起著重要作用,對過表達株系相對于野生型表達量上調(diào)最大的10個基因和抑制表達株系相對于野生型表達量下調(diào)最大的10個基因進行分析。UTP—glucose-1-phosphate uridylyltransferase,EC number 2.7.7.9,同義名稱UDP glucose pyrophosphorylase,UDPG pyrophosphorylase,UGPase[11],是 一 種參 與 糖 代 謝 的酶。它以葡萄糖-1-磷酸和UTP 為底物合成UDP

    葡萄糖;UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉(zhuǎn)移酶是在所有三個領(lǐng)域(細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌)中發(fā)現(xiàn)的酶,因為它是糖原生成和細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵參與者[12]。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因過表達可提高黃麻(Corchorus capsularis L.)的纖維素含量[13]。說明UGPase 在營養(yǎng)生長、細(xì)胞壁形成及纖維素合成中起重要作用。在BpNAC012抑制表達株系中,該基因顯著下調(diào)表達,可能與抑制表達株系纖維素含量下降有關(guān)。值得注意的是No lysine kinase 1 isoform 1,同時出現(xiàn)在過表達株系上調(diào)倍數(shù)前十中,和抑制表達株系下調(diào)倍數(shù)前十中,說明該基因與BpNAC012 的表達密切協(xié)同,受BpNAC012 的強調(diào)控。No lysine kinase 1(WNK)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化賴氨酸的獨特特征,因而得名。WNK1 在植物體內(nèi)離子轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)、激素對滲透和離子脅迫的調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律和開花時間、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運中、離子通道調(diào)控等過程中起重要作用[14]。因此說明BpNAC012 表達的改變,在某種程度上可能影響了轉(zhuǎn)基因株系的信號傳導(dǎo)途徑。

    表7 過表達株系木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)上調(diào)表達基因Table 7 Genes related to up-regulated expression of xylem development in overexpressing lines

    表8 抑制表達株系木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)下調(diào)表達基因Table 8 Genes related to down-regulated expression of xylem development-inhibited expression lines

    表9 過表達株系中差異表達轉(zhuǎn)錄因子Table 9 Differentially expressed transcription factors in overexpressing lines

    表10 抑制表達株系中差異表達轉(zhuǎn)錄因子Table 10 Inhibition of differentially expressed transcription factors in expressing lines

    過量表達BpNAC012可促進木質(zhì)部發(fā)育,次生壁增厚。因此本研究進行差異表達基因分析時,關(guān)注了和這些性狀相關(guān)的基因。CesA是細(xì)胞壁生物合成過程中催化纖維素合成的關(guān)鍵酶。該蛋白參與纖維素合成代謝途徑,參與次生細(xì)胞壁的形成,是木質(zhì)部細(xì)胞壁增厚所需[15]。本研究中,Bp-NAC012 過表達株系中鑒定的2 條CesA 相關(guān)基因的表達量比對照高,而在抑制表達株系中鑒定的1條CesA 基因的表達量比野生型對照低。表明Bp-NAC012 通過增強過表達株系中CesA 基因的表達促進纖維素生物合成。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)在植物的生長和分化中起著關(guān)鍵的作用。Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase family protein(XTHs)催化木葡聚糖鏈的分解和分子連接,在細(xì)胞壁的松弛和重新排列中起作用。本研究在過表達株系中鑒定了2 條上調(diào)表達的Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase family protein,綜合分析結(jié)果說明,該基因受BpNAC012 的誘導(dǎo),在白樺木質(zhì)部發(fā)育中起重要的作用。endo-1,4-beta-glucanase 家族基因在植物生長和發(fā)育的多方面具有功能,能促進植物生長和側(cè)根發(fā)育,增強細(xì)胞擴展。楊樹的endo-1,4-beta-glucanase 是木質(zhì)部組織特異的,在纖維素生物合成中起作用,能夠促進植物的生長[16]。本研究中,在抑制表達株系中,鑒定了1 個下調(diào)表達的endo-1,4-beta-glucanase 基因,綜合分析,說明endo-1,4-beta-glucanase 隨著BpNAC012表達的下調(diào)而下調(diào),受其調(diào)控,和抑制表達轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)部發(fā)育及纖維素合成受阻相關(guān)。

    本研究在過表達和抑制表達株系中,分別鑒定到與野生型對照差異表達的轉(zhuǎn)錄因子AP2-EREBP、Tify、WRKY、Orphans、bHLH、NAC、GRAS、C2H2、SWI/SNF、SET、MYB、HSF、AUX/IAA、ARF、Sigma70-like、mTERF、G2-like、C3H、HB、FAR1、CPP、ABI3VP1、TRAF、GNAT、C2C2-Dof和LOB 等。在過表達株系中,差異表達數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子是AP2-EREBP 類轉(zhuǎn)錄因子,而且全部是上調(diào)表達;其次是Tify 類轉(zhuǎn)錄因子,WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子;此外bHLH、NAC、AUX/IAA 和MYB 轉(zhuǎn)錄子表現(xiàn)了不同的表達模式。在抑制表達株系中,上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量明顯少于過表達株系,其中差異表達數(shù)量最多的,依然是AP2-EREBP 類轉(zhuǎn)錄因子,并且有1 個下調(diào);上調(diào)表達的WRKY、Tify和Orphars類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量也明顯下降;此外,在過表達株系中都上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子,在抑制表達株系中出現(xiàn)了下調(diào)表達,如C3H 和C2H2。在過表達株系中,GRAS、SWI.SNF 和HSF 類轉(zhuǎn)錄因子都有大于3條的上調(diào)表達,而在抑制表達株系中沒有檢測到;在抑制表達株系中,TRAF、C2C2-dof 和GNAT類轉(zhuǎn)錄因子都下調(diào)表達,而在過表達表達株系中沒有檢測到。以上結(jié)果說明,在BpNAC012調(diào)控的轉(zhuǎn)基因株系中,存在多個層級的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,BpNAC012能夠調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的表達;在過表達和抑制表達株系中,存在不同的、復(fù)雜的調(diào)控模式,一些特異轉(zhuǎn)錄因子,在各自的性狀變化中起著相應(yīng)的調(diào)控作用。

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