水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷的保護作用

楊 帆，曹 晨，方 敬，郭 帥，李雅純，陳志強

? 藥理與臨床 ?

水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷的保護作用

楊 帆1，曹 晨2，方 敬1，郭 帥1，李雅純1，陳志強3*

1. 河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437 3. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011

探討水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷的保護作用。SD大鼠隨機選取8只作為對照組，其余大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合ip鏈脲佐菌素（35 mg/kg）建立糖尿病腎病模型，成模大鼠隨機分為模型組及水蛭凍干粉低、中、高劑量（0.3、0.6、1.2 g/kg）組。給藥16周后，檢測大鼠24 h尿微量白蛋白（24 h urinary microalbumin，24 h-mALB）、空腹血糖、尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Scr）水平和腎質(zhì)量/體質(zhì)量；采用TBA法和羥胺法測定大鼠血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用ELISA法檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和單核細胞趨化因子-1（monocyte chemokine-1，MCP-1）水平；Western blotting法檢測大鼠腎組織Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子1、3（janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription1、3，JAK2/STAT1/STAT3）通路相關蛋白表達。與對照組比較，模型組大鼠24 h-mALB、空腹血糖、腎功能（BUN、Scr）、腎質(zhì)量/體質(zhì)量指標均顯著升高（＜0.01），血清MDA、TNF-α、IL-1β和MCP-1水平顯著增加（＜0.01），SOD活性顯著降低（＜0.01），腎組織JAK2/STAT1/STAT3通路被激活（＜0.05、0.01）。與模型組比較，水蛭凍干粉組大鼠24 h-mALB排泄降低（＜0.01），腎功能（BUN、Scr）、腎質(zhì)量/體質(zhì)量改善（＜0.05、0.01），氧化損傷減輕（＜0.05、0.01），血清炎癥因子水平下降（＜0.05、0.01），腎組織JAK2/STAT1/STAT3通路被抑制（＜0.05、0.01）。水蛭凍干粉可能通過抑制糖尿病腎病大鼠氧化應激及炎癥因子的產(chǎn)生，抑制腎組織JAK2/STAT1/STAT3信號通路活化，從而降低mALB排泄，改善腎功能，進而發(fā)揮腎臟保護作用。

糖尿病腎??；水蛭凍干粉；JAK2/STAT1/STAT3通路；氧化應激；炎癥

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，嚴重危害人類健康，加重經(jīng)濟和社會負擔。糖脂代謝紊亂、血液動力學改變、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活、氧化應激、炎癥等均可能參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，其中氧化應激和慢性炎癥在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1-2]。氧化應激可引起細胞內(nèi)和細胞間的代謝紊亂，內(nèi)源性活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）可刺激炎癥因子的表達[3]，從而引起基質(zhì)蛋白在腎臟過度沉積導致腎臟結(jié)構(gòu)及功能異常。Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路是調(diào)控炎癥因子表達的樞紐[4]，其中JAK2/STAT1/STAT3是在糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展過程中被最明確識別的JAK和STAT形式[5]。

中醫(yī)學認為瘀血阻滯腎臟絡脈是糖尿病腎病的主要病機之一[6]。現(xiàn)代醫(yī)學研究證實血瘀的病理機制與炎癥病理過程有關[7]。水蛭味咸、苦，性平，有小毒，歸肝經(jīng)，是常用的活血化瘀通絡類動物中藥。《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無子，利水道”。胡筱娟等[8]認為糖尿病凡有瘀血征象，甚或無明顯瘀血表現(xiàn)時均可酌情選用水蛭，只要運用得當，療效甚佳。然而水蛭治療糖尿病腎病的具體機制尚不明確，本研究采用ip鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂飼料復制糖尿病腎病大鼠模型，考察水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織的保護作用及氧化應激及炎癥因子的影響，闡明水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的可能機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，4～5周齡，體質(zhì)量60～80 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。于溫度（24±1）℃，濕度50%～70%條件下適應性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)河北中醫(yī)學院倫理委員會批準（批準號DWLL2015002）。

1.2 藥品和試劑

水蛭凍干粉（批號Z10970056，每克水蛭凍干粉相當于56個抗凝血酶活性單位）購自重慶多普泰制藥股份有限公司；鏈脲佐菌素（批號04081408）購自美國Enzo Life Sciences公司；高脂飼料（蛋白質(zhì)24.2%、碳水化合物42.1%、脂肪25.4%）購自北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司；尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Scr）試劑盒（批號分別為AUZ3611、AUZ3562）購自貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司；尿微量白蛋白（urinary microalbumin，mALB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號分別為H127-1-2、A003-1-2、A001-3-2）均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、單核細胞趨化因子-1（monocyte chemokine-1，MCP-1）試劑盒（批號分別為SXR063、SXR026、SXR043）均購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；抗兔JAK2抗體（批號3230）、抗兔STAT1抗體（批號14994）、抗兔STAT3抗體（批號4904）、抗兔磷酸化JAK2抗體（批號3776）、抗兔磷酸化STAT1抗體（批號7649）、抗兔磷酸化STAT3抗體（批號9145）均購自美國CST公司；β-actin抗體（批號AF0003）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標記羊抗兔抗體（批號GB23303）、ECL增強化學發(fā)光試劑盒（批號G2014）、蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑（批號G2007）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（批號A53225）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

One Touch血糖儀和穩(wěn)豪血糖試紙（美國強生Lifescan公司）；Infinite 200多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；RM2050石蠟切片機（德國Leica公司）；Dimension RxL Max全自動生化分析儀（西門子公司）；Olympus光學顯微鏡（日本Olympus公司)；ImageQuant LAS4000成像系統(tǒng)（美國GE醫(yī)療公司）；SDS-PAGE電泳儀（美國伯樂公司）；Allegra-64R高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 模型制備、分組與給藥

隨機選取8只SD大鼠作為對照組給予普通飼料飼養(yǎng)，其余40只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合ip小劑量鏈脲佐菌素復制糖尿病腎病大鼠模型。高脂飼料喂養(yǎng)6周后大鼠禁食不禁水12 h，造模大鼠ip 1%鏈脲佐菌素溶液（35 mg/kg），對照組ip等體積0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.3），72 h后尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L則視為造模成功[9]。造模過程中有2只大鼠死亡，1只大鼠因血糖＜16.7 mmol/L，予以剔除。根據(jù)人與大鼠體表面積換算和文獻報道[10-11]，將剩余37只糖尿病大鼠隨機分為模型組10只、水蛭凍干粉低劑量（0.3 g/kg）組9只，水蛭凍干粉中劑量（0.6 g/kg）組9只，水蛭凍干粉高劑量（1.2 g/kg）組9只。水蛭凍干粉溶于蒸餾水中配制成30%混懸液，水蛭凍干粉低、中、高劑量組ig混懸液（1、2、4 mL/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)16周，給藥期間觀察大鼠的一般狀態(tài)。

2.2 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠24 h-mALB水平的影響

給藥結(jié)束后，將大鼠置于代謝籠中留取尿液，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書測定24 h-mALB水平。

2.3 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血糖、BUN和Scr水平的影響

給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，3%異氟烷吸入麻醉，稱定體質(zhì)量，股動脈取血，采用全自動生化分析儀檢測血糖、BUN和Scr水平。大鼠脫頸椎處死后剖開腹腔，迅速分離腎臟，用冰生理鹽水沖洗后稱定左腎質(zhì)量，計算腎質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血清SOD活性及MDA、TNF-α、IL-1β和MCP-1水平的影響

大鼠股動脈取血，4 ℃、1500 r/min離心10 min分離血清，按照試劑盒說明書分別測定血清中SOD活性及MDA、TNF-α、IL-1β和MCP-1水平。

2.5 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響

腎臟組織在4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度4 μm），切片后分別用蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色，于顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

2.6 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織JAK2/STAT1/STAT3通路相關蛋白表達的影響

取約100 mg大鼠腎組織研磨至粉末狀，加入含HALT蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上裂解，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，提取總蛋白，采用BCA法測定組織上清液蛋白質(zhì)量濃度，用上樣緩沖液稀釋蛋白樣品，100 ℃沸水浴5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入JAK2抗體（1∶600）、STAT1抗體（1∶600）、STAT3抗體（1∶600）、磷酸化JAK2抗體（1∶750）；磷酸化STAT1抗體（1∶750）、磷酸化STAT3抗體（1∶750）、β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，于室溫孵育1 h。TBST洗滌后置ECL發(fā)光液中顯色，使用ImageQuant LAS4000成像系統(tǒng)拍攝。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的一般情況

對照組大鼠活動靈活，體質(zhì)量增加，反應靈敏，毛色光亮潔白；模型組大鼠多飲、多尿、多食，精神萎靡，體形消瘦，反應遲鈍，毛色枯黃無光澤，部分大鼠出現(xiàn)膿瘡、腹部包塊等現(xiàn)象；水蛭凍干粉組大鼠上述情況得到明顯改善，活動量增加，體質(zhì)量增加，毛色變白有光澤。模型組大鼠死亡3只，水蛭凍干粉低劑量組大鼠死亡2只，水蛭凍干粉中、高劑量組大鼠各死亡1只。

3.2 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠24 h-mALB、血糖和腎功能的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠24 h- mALB、血糖、BUN、Scr水平均明顯升高（＜0.01），腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各劑量水蛭凍干粉組大鼠24 h-mALB、BUN、Scr水平均顯著降低（＜0.05、0.01），腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著降低（＜0.01），呈劑量相關性，大鼠血糖無明顯變化。表明水蛭凍干粉可以改善糖尿病腎病大鼠相關腎損傷參數(shù)，但對血糖無明顯影響。

表1 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠24 h-mALB、血糖水平和腎功能的影響()

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

3.3 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血清MDA水平和SOD活性的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD活性明顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各劑量水蛭凍干粉組大鼠血清MDA水平均顯著降低（＜0.01），SOD活性均顯著恢復（＜0.05、0.01），呈劑量相關性。表明水蛭凍干粉可通過抑制氧化應激的產(chǎn)生，進而改善糖尿病腎病大鼠腎組織損傷。

表2 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血清MDA水平和SOD活性的影響()

3.4 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血清TNF-α、IL-1β和MCP-1水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和MCP-1水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各劑量水蛭凍干粉組大鼠血清TNF-α、IL-1β和MCP-1水平均顯著降低（＜0.05、0.01），呈劑量相關性。表明水蛭凍干粉具有抗炎作用，可有效降低糖尿病腎病大鼠血清中炎癥因子水平。

表3 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠血清TNF-α、IL-1β和MCP-1水平的影響()

3.5 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)未見明顯的組織病理學改變；模型組大鼠腎小球基底膜增厚，系膜擴張伴腎小球肥大，囊腔狹窄，部分節(jié)段出現(xiàn)球囊黏連，腎小管萎縮/擴張，炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)出現(xiàn)部分纖維化。水蛭凍干粉各劑量組大鼠腎小球肥大、囊腔狹窄、基底膜增厚及系膜擴張趨勢均被抑制，炎性細胞浸潤和膠原沉積減少。

圖1 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響

3.6 水蛭凍干粉對糖尿病腎病大鼠腎組織JAK2/ STAT1/STAT3通路相關蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3蛋白表達均明顯升高（＜0.05、0.01），提示糖尿病腎病大鼠腎組織JAK2/STAT1/STAT3信號通路激活；與模型組比較，水蛭凍干粉組大鼠腎組織p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3蛋白表達顯著降低（＜0.05、0.01），呈劑量相關性，表明水蛭凍干粉可抑制JAK2/STAT1/STAT3信號通路的活化。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

4 討論

隨著對糖尿病腎病的深入研究，許多中藥或中藥組分對糖尿病導致的腎損害有較好的預防和治療作用[12]。糖尿病腎病病程較長，遷延難愈，多為久病痼疾。久病多虛，久病入絡，氣虛無以推動血行形成瘀血，阻于腎臟絡脈，引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常。因此化瘀通絡、保持絡脈氣血通暢是治療糖尿病腎病的關鍵。水蛭是常用的活血化瘀通絡中藥，張錫純稱之為“祛瘀血而不傷新血，純系水之精華生成”“凡破血之藥，多傷氣分，惟水蛭味咸專入血分，于氣分絲毫無損，而瘀血默消于無形，真良藥也”。水蛭具有抗凝、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化、抗炎止痛、抗腫瘤、降低血液黏度、保護腦缺血再灌注損傷等多種藥理作用[13-14]。

氧化應激在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。慢性高血糖通過干擾氧化劑與抗氧化劑之間的平衡（如降低SOD活性）來誘導ROS的產(chǎn)生[15]。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中SOD的過表達可減輕糖尿病腎損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素復制的糖尿病腎病大鼠MDA產(chǎn)生增加，SOD活性降低，水蛭凍干粉可有效抑制糖尿病腎病大鼠MDA產(chǎn)生，增加SOD活性，從而抑制氧化應激所導致的腎臟損傷。

氧化應激與炎癥密切相關[17]，炎癥因子可使腎臟細胞外基質(zhì)合成增多、降解減少，導致腎小球硬化[18]。JAK/STAT是一種重要的ROS敏感轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應激和炎癥的串擾中起關鍵作用[19]。JAK/STAT信號通路主要由酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶JAKs和轉(zhuǎn)錄因子STATs組成[4]。細胞因子與酪氨酸激酶相關受體結(jié)合后，受體亞基發(fā)生二聚化或多聚化，可誘導結(jié)合于受體亞基上的JAK相互靠近而被激活，活化受體胞漿段的酪氨酸，使STATs與受體結(jié)合并在JAKs的作用下被磷酸化，磷酸化的STAT從受體復合物中解離形成異源或同源二聚體，然后易位到細胞核與特定的基因啟動子序列結(jié)合，調(diào)控下游炎癥基因的表達[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠腎臟組織中p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3蛋白表達和血清炎癥因子水平顯著上調(diào)，提示JAK2/STAT1/STAT3信號通路被激活；水蛭凍干粉組大鼠腎組織p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3蛋白表達均顯著降低，血清炎癥因子水平明顯下降，表明水蛭凍干粉可以抑制JAK2/STAT1/STAT3信號通路活化，抑制炎癥因子的表達，從而發(fā)揮腎臟保護作用。

綜上，水蛭凍干粉可通過抑制糖尿病腎病大鼠氧化應激及炎癥因子的產(chǎn)生，抑制腎組織JAK2/STAT1/STAT3信號通路活化，降低尿微量白蛋白排泄，改善腎功能，減輕腎臟病理損傷，從而發(fā)揮腎臟保護作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effects of hirudo lyophilized powder on renal injury in diabetic nephropathy rats

YANG Fan1, CAO Chen2, FANG Jing1, GUO Shuai1, LI Ya-chun1, CHEN Zhi-qiang3

1. Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China 2. Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China 3. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China

To explore the intervention of hirudo lyophilized powder in the renal tissue injury of diabetic nephropathy rats.Eight SD rats were selected as control group, and the remaining rats were used to establish diabetic nephropathy models by high-fat diet combined with ip streptozotocin (35 mg/kg). Diabetic nephropathy rats were randomly divided into model group, hirudo lyophilized powder low-, medium-, high-dose (0.3, 0.6, 1.2 g/kg) group. After administered with corresponding drug for 16 weeks, the 24 h-urine microalbumin, blood glucose, urea nitrogen (BUN), creatinine (Scr) and KW/BW were detected; The activity of superoxide dismutase (SOD) and level of malondialdehyde (MDA) in serum were measured by TBA and hydroxylamine method respectively; The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and monocyte chemokine-1 (MCP-1) in serum were analyzed by ELISA; The related protein expressions of JAK2/STAT1/STAT3 pathway were detected in renal tissues by western blotting.Compared with control group, 24-h urine microalbumin, fasting blood glucose, BUN, Scr, and KW/BW were significantly increased (< 0.01); The serum levels of MDA, TNF-α, IL-1β, and MCP-1 were significantly increased (< 0.01); The activiy of SOD was significantly inhibited (< 0.01); The JAK2/STAT1/STAT3 signaling pathway was activated in renal tissues of model group (< 0.05, 0.01). Compared with model group, the 24 h urinary microalbumin excretion was reduced (< 0.01), renal function (BUN, Scr) and KW/BW were significantly improved (< 0.05, 0.01), the degree of oxidative stress and serum inflammatory factor levels were decreased (< 0.05, 0.01), and the activation of JAK2/STAT1/STAT3 signaling pathway was inhibited in hirudo lyophilized powder group (< 0.05, 0.01).Hirudo lyophilized powder could inhibit oxidative stress and inflammation injury, inhibit the activation of JAK2/STAT1/STAT3 signaling pathway, reduce urinary microalbumin excretion, and improve renal function, and thus exert renal protective effects.

diabetic nephropathy; hirudo lyophilized powder; JAK2/STAT1/STAT3 pathway; oxidative stress; inflammation

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1020 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.014

2020-10-12

國家自然科學基金資助項目（81373804）；河北省科研能力提升重點項目（KTZ2019024）

楊 帆（1983—），男，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向為慢性腎臟病的中醫(yī)藥治療及機制研究。Tel: 13831192776 E-mail: hbxlydc@163.com

陳志強 Tel: 13930486188 E-mail: chenzhqiang2011@163.com

[責任編輯 李亞楠]