基于“質(zhì)量標(biāo)志物-生物活性”關(guān)聯(lián)分析評(píng)價(jià)丹參的等級(jí)

楊寧娟，劉妍如，唐志書，宋忠興，段金廒，陳 琳，劉 峰，陳衍斌，許 剛，史鑫波

基于“質(zhì)量標(biāo)志物-生物活性”關(guān)聯(lián)分析評(píng)價(jià)丹參的等級(jí)

楊寧娟1，劉妍如1*，唐志書1*，宋忠興1，段金廒4，陳 琳1，劉 峰2，陳衍斌3，許 剛3，史鑫波1

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同中心，省部共建協(xié)同秦藥特色資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083 2. 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712083 3. 陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075 4. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

基于“成分反映活性，活性指向功效”的中藥質(zhì)量控制研究思路，建立用于丹參飲片等級(jí)評(píng)價(jià)的Logistic回歸模型。采用超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定丹參質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-marker）含量，以凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、羥自由基抑制率、DPPH自由基清除率作為生物活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用Logistic回歸分析法將質(zhì)控指標(biāo)和生物活性指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最后建立Logistic回歸模型。Logistic模型結(jié)果顯示，31批丹參飲片被分成了優(yōu)、良、中、差4個(gè)等級(jí)，樣本等級(jí)預(yù)測(cè)概率（）值均大于90%，說明本研究所建立的模型其準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)能力均較好?；诤繙y(cè)定及生物活性結(jié)果建立的Logistic回歸模型可用來評(píng)價(jià)丹參飲片質(zhì)量高低，為丹參整體質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

丹參；二分類Logistic回歸分析；生物活性；超高效液相色譜；質(zhì)量標(biāo)志物

丹參是唇形科植物丹參Bunge.的干燥根或根莖，收載于《中國(guó)藥典》2015年版[1]，是中醫(yī)臨床常用大品種中藥飲片之一。主要分布在我國(guó)華北、華東、西北地區(qū)[2]。丹參味微辛、苦，歸心經(jīng)、肝經(jīng)[3]，具有抑制血小板聚集、抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效。臨床上常用于治療心肌缺血、心力衰竭以及動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病[4-6]。近年來，通過野生品、栽培品[7]、產(chǎn)地[8]、直徑[9]以及根皮顏色[10]與有效成分含量的相關(guān)性對(duì)丹參進(jìn)行等級(jí)分類的研究甚多，但飲片是由藥材經(jīng)除去雜質(zhì)和殘莖、洗凈、潤(rùn)透、切厚片、干燥等加工工序制成，炮制方法不同，有效成分的含量都會(huì)受到影響，因此不能完全依照丹參有效成分的含量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)丹參飲片質(zhì)量，及時(shí)修訂丹參飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是亟待解決的問題。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣給中藥質(zhì)量控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)。劉昌孝院士[11]于2016年首次提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-markers）新概念，使中藥質(zhì)量控制體系更加完善。劉妍如等[12]對(duì)腦心通膠囊中Q-marker進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，指出丹參中的丹酚酸B和丹參酮IIA可作為丹參的Q-marker，故可通過測(cè)定其含量增加質(zhì)量控制結(jié)果的準(zhǔn)確性。范華英[13]指出丹參酮IIA能降低血液黏度，抑制凝血酶活化和加速纖維蛋白降解；丹酚酸B可以減少血小板激活和動(dòng)脈血栓的形成。因此本課題組將凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）作為評(píng)價(jià)丹參抗凝血作用的主要指標(biāo)。此外，丹參在治療心腦血管疾病的作用與其提取物具有抗氧化活性有關(guān)，其機(jī)制為通過抑制自由基的產(chǎn)生而保護(hù)心臟免受傷害[14]，故選用羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率作為評(píng)價(jià)丹參抗氧化能力的指標(biāo)。

本研究以31批不同產(chǎn)地的丹參飲片為研究對(duì)象，采用Logistic回歸分析法對(duì)質(zhì)控指標(biāo)和TT、羥自由基清除率及DPPH自由基清除率等生物活性指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最后建立用于丹參等級(jí)評(píng)價(jià)的Logistic回歸模型，為建立科學(xué)、可靠的丹參飲片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供新思路。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量 (240±10) g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。保持溫度 (22±3) ℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用，以及動(dòng)物的處理嚴(yán)格遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 試劑 丹酚酸B（批號(hào)MUST-18070503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.51%）、丹參酮IIA（批號(hào)MUST-17022502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.64%）購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；凝血酶時(shí)間TT測(cè)定試劑盒（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司）；羥自由基試劑盒（批號(hào)W27F10E81251，南京建成生物工程研究所）；DPPH（批號(hào)W27F10E81251，源葉生物公司）；含枸櫞酸鈉添加劑一次性真空采血管（批號(hào)181201，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；甲酸（FlukaTM，色譜純，美國(guó)霍尼韋爾公司）；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)于德國(guó)默克公司；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.1.3 藥材 本研究收集31批丹參飲片，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定為唇形科植物丹參Bunge. 的干燥根和根莖。丹參對(duì)照藥材（批號(hào)SGAS-QTQ3）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；31批丹參基本信息見表1。

表1 31批丹參藥材信息

1.2 儀器

Acquity H-CLASS型超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)沃特世公司）；包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動(dòng)進(jìn)樣管理器、PDA檢測(cè)器和Empower 3色譜工作站；1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；Sartorius CPA225D十萬分之一分析天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Thermo Micro 17R微量低溫冷凍離心機(jī)（上海珂淮儀器有限公司）；C2000-A型全自動(dòng)凝血分析儀（北京普利生儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取丹酚酸B和丹參酮IIA對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成丹酚酸B和丹參酮IIA質(zhì)量濃度均為0.22 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過4號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率140 W、頻率42 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈溶液（B）；梯度洗脫條件為0～2 min，2% B；2～10 min，2%～100% B；10～13 min，100% B；13～15 min，100%～2% B，后運(yùn)行5 min；體積流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量2 μL。色譜圖見圖1。

圖1 丹參提取物 (A)、丹酚酸B (B)、丹參酮ⅡA (C) 及空白對(duì)照 (D) 的色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察 將“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品及供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣2 μL，記錄270 nm波長(zhǎng)下的UPLC譜圖，比較在線紫外光譜圖和保留時(shí)間，此條件下丹酚酸B、丹參酮IIA強(qiáng)度適中且與相鄰峰分離較好且理論塔板數(shù)不低于8000。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密移取混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加1∶1的甲醇水溶解至刻度，搖勻。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。丹酚酸B線性范圍為30.0～150.0 μg/mL，丹參酮IIA線性范圍為20.0～70.0 μg/mL，表明各對(duì)照品在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

2.3.3 精密度試驗(yàn) 吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示丹酚酸B、丹參酮IIA的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.02%、0.06%，相對(duì)峰面積RSD分別為0.39%、0.76%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫放置0、3、6、12、18、24、36 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示丹酚酸B、丹參酮IIA的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.04%、0.08%，相對(duì)峰面積RSD分別為0.41%、0.82%。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果丹酚酸B、丹參酮IIA的相對(duì)峰面積RSD為0.19%、0.67%，相對(duì)保留時(shí)間RSD分別為0.01%、0.02%。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照低、中、高3個(gè)添加水平（80%、100%、120%）進(jìn)行加樣回收測(cè)定，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定6次，記錄峰面積。丹酚酸B和丹參酮IIA加樣回收率為101.05%、99.86%，RSD值分別為0.16%、0.56%。

2.4 體內(nèi)抗凝血活性測(cè)定[15]

2.4.1 血漿制備 大鼠腹主動(dòng)脈取血，采用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，全血與抗凝劑比例為9∶1，將血液分裝在離心管內(nèi)，2500 r/min，離心15 min，取血漿備用。

2.4.2 丹參粉末的前處理 精密稱取丹參粉末1.00 g，加0.9%的生理鹽水至10 mL，超聲20 min，然后將其分裝在離心管內(nèi)，用離心機(jī)以5000 r/min離心10 min，取上清液，再以5000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm針頭過濾器濾過，得丹參粉末提取原液。

2.4.3 TT測(cè)定 取血凝儀測(cè)試杯，每通道精密加入血漿90 μL，分別加入不同濃度的丹參溶液50 μL，用全自動(dòng)血凝儀測(cè)定TT值，為保證測(cè)量的準(zhǔn)確性，測(cè)定應(yīng)在4 h內(nèi)完成，且不可冷凍保存和過度震蕩。

2.4.4 量效關(guān)系考察 將S11提取原液用0.9%氯化鈉注射液稀釋成質(zhì)量濃度為13.30、10.60、8.50、6.80、5.40、4.40、3.40、2.80、2.20、1.80、1.40 mg/mL溶液（劑間比0.8），按“2.4.3”項(xiàng)方法，分別測(cè)定含藥血漿的TT，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S11丹參提取液濃度較低時(shí)，體外抗凝血作用不明顯，不具有劑量依賴性，而在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)劑量依賴性較為明顯，并在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著丹參溶液質(zhì)量濃度的增加，TT值也在增加。通過量效關(guān)系考察實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為S11樣品的一定質(zhì)量濃度范圍，可作為其他批次丹參樣品TT測(cè)定時(shí)質(zhì)量濃度范圍選擇的依據(jù)。

圖2 丹參在體外對(duì)TT的量效關(guān)系考察結(jié)果

2.4.5 線性范圍考察 根據(jù)量效關(guān)系考察結(jié)果，將S11提取液用0.9%氯化鈉注射液稀釋成質(zhì)量濃度為13.30、10.60、8.50、6.80、5.40 mg/mL的溶液，劑間比為0.8，按“2.4.3”項(xiàng)方法，分別測(cè)定含藥血漿的TT，平行測(cè)定3次，以藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），TT值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)丹參提取液的質(zhì)量濃度在5.40～13.30 mg/mL時(shí)，TT與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好，其回歸方程為＝2 281.6＋26.738，＝0.999 6。通過該線性范圍考察，明確了S11的線性質(zhì)量濃度范圍，并將該范圍的中間質(zhì)量濃度8.50 mg/mL作為各批次樣品測(cè)定TT時(shí)的質(zhì)量濃度。

2.4.6 效價(jià)定義及各批次丹參TT測(cè)定 將質(zhì)量濃度為8.50 mg/mL的丹參溶液使空白血漿的TT延長(zhǎng)1 s定義為1個(gè)效價(jià)單位（U）。取各批次丹參提取原液，用生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為8.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，取平均值作為該批樣品的效價(jià)。

標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)＝/(V×C)

為標(biāo)準(zhǔn)品溶液比空白血漿TT延長(zhǎng)的時(shí)間，為標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積，為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度

2.4.7 羥自由基清除率測(cè)定 參考羥自由基試劑盒說明書，采用微量法進(jìn)行加樣，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)2次，測(cè)定吸光度（）值。根據(jù)公式計(jì)算樣品的羥自由基清除率，取平均值。

羥自由基清除率＝(c－s)/s

s為測(cè)定管的值，c為對(duì)照管的值

2.4.8 DPPH自由基清除率測(cè)定 用甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?；另配?.0 mg/mL的維生素C（Vc）溶液備用，參考文獻(xiàn)方法[16]，采用微量法在96孔板上進(jìn)行操作，取150 μL 70%甲醇，加入150 μL 待測(cè)液作為空白組；取 150 μL 70 %甲醇，加入150 μL DPPH溶液作為對(duì)照組；取150 μL DPPH 溶液，加入150 μL維生素 C（Vc）溶液作為標(biāo)準(zhǔn)組；取150 μL DPPH 溶液，加入150 μL 待測(cè)液作為測(cè)定組。加樣完成后于室溫下避光靜置30 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定 517 nm 處的吸光度（A）值。每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。根據(jù)公式計(jì)算丹參提取液的DPPH自由基清除率，取平均值。

DPPH自由基清除率＝1－(s－b)/c

s為測(cè)定管的值，b為空白管的值，c為對(duì)照管的值

2.5 丹參飲片等級(jí)評(píng)價(jià)

2.5.1 主成分（principal component analysis，PCA）分析 PCA是一種將多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，簡(jiǎn)化為少數(shù)幾個(gè)不相關(guān)的綜合指標(biāo)（主成分）的多元統(tǒng)計(jì)分析方法。其目的在于減少變量的數(shù)目使多變量數(shù)據(jù)集可視化，結(jié)合原始變量的線性關(guān)系生成影響分類較大的主成分。因此，采用PCA方法觀察樣品差異情況，將提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)齊、積分、標(biāo)準(zhǔn)化處理，導(dǎo)入至Simca-p 14.1軟件中，以其影響因素（質(zhì)控含量，生物活性）作為觀測(cè)值（）進(jìn)行PCA分析，從得到的數(shù)據(jù)矩陣中提取攜帶差異變量最多的主成分。提取前2個(gè)主成分，得到模型擬合度為83.9%。PC1的貢獻(xiàn)率為66.1%，包合差異信息最多，這說明此模型擬合能力較好，其模型預(yù)測(cè)圖見圖3-A。

以前2個(gè)主成分建立投影，得到散點(diǎn)圖見圖3-B。采用聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）方法，對(duì)31個(gè)批次的丹參數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)樣本被自動(dòng)分為4類（組1～4），由圖3可見，丹參正品和偽品有明顯的分類距離。浙皖丹參、白花丹參和南丹參等批次是丹參的代用品被分為一類（綠色）；甘西鼠尾草和偽品分為一類（紅色），其他2類為丹參正品（黃色，藍(lán)色），見圖3-C。結(jié)果表明，采用PCA的分類具有較高的可靠性。

A-模型預(yù)測(cè)圖 B-PCA散點(diǎn)圖 C-HCA聚類圖

2.5.2 建立Logistic回歸模型 目前，已有大量研究采用Logistic回歸模型對(duì)不同產(chǎn)地的中藥材或飲片進(jìn)行等級(jí)分類，這不僅為相關(guān)藥物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，還給生產(chǎn)該藥物相關(guān)制劑時(shí)投料飲片產(chǎn)地來源的選擇提供了一定的參考[17-19]。而影響丹參投料飲片的主要因素分為2類：第1類是主要成分的質(zhì)控含量；第2類是生物活性（抗氧化活性、抗凝血活性），故本研究通過Logistic模型建立各產(chǎn)地的丹參樣本對(duì)應(yīng)的主成分（質(zhì)控含量、生物活性）與歸屬等級(jí)之間的函數(shù)關(guān)系。根據(jù)丹參質(zhì)控成分，生物活性等測(cè)定結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分級(jí)，將其分成訓(xùn)練集和測(cè)試集2部分，運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)選定的訓(xùn)練集樣本進(jìn)行Logistic回歸分析擬合方程，再對(duì)測(cè)試集樣本進(jìn)行分類預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 定量測(cè)定

取31批丹參樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3份供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定6次，記錄峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算各批次樣品的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表2。

表2 31批丹參質(zhì)控成分含量測(cè)定結(jié)果()

3.2 抗凝血活性測(cè)定

將31批丹參按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備并稀釋至質(zhì)量濃度為8.50 mg/mL的溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法測(cè)定各批次丹參的TT值，平行測(cè)定6次。通過效價(jià)定義公式計(jì)算不同批次丹參的生物效價(jià)，見圖4。

圖4 31批丹參抗凝血生物活性測(cè)定結(jié)果(n＝6)

3.3 抗氧化活性測(cè)定

取31批丹參樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.4.7”“2.4.8”項(xiàng)下方法測(cè)定丹參體外抗氧化活性，平行測(cè)定3次。各批次羥自由基清除率結(jié)果見圖5-A，DPPH自由基清除率結(jié)果見圖5-B。

圖5 31批丹參羥自由基清除率(A)和DPPH自由基清除率(B)測(cè)定結(jié)果(n＝3)

3.4 等級(jí)評(píng)價(jià)

以“3.1”項(xiàng)下各個(gè)批次測(cè)定結(jié)果作為模式識(shí)別的基礎(chǔ)，擬將丹參不同批次按照優(yōu)（1）、良（2）、中（3）、差（4）4個(gè)等級(jí)分類，分別賦予響應(yīng)值4、3、2、1。以SPSS軟件對(duì)Logistic模型參數(shù)進(jìn)行求解，得到模型表達(dá)式如下。

優(yōu)=exp(?85.539＋0.121×抗凝血TT＋3.845×丹參酮IIA含量＋1.166×丹酚酸B含量?0.240×抗氧化DPPH＋0.119×抗氧化OH)/[1＋exp(?85.539＋0.121×抗凝血TT＋3.845×丹參酮IIA含量＋1.166×丹酚酸B含量?0.240×抗氧化DPPH＋0.119×抗氧化OH)]

良=exp(69.307?0.461×抗凝血TT?12.857×丹參酮IIA含量＋1.326×丹酚酸B含量?0.771×抗氧化DPPH?1.160×抗氧化OH)/[1+exp(69.307?0.461×抗凝血TT?12.857×丹參酮IIA含量＋1.326×丹酚酸B含量?0.771×抗氧化DPPH?1.160×抗氧化OH)]

中=exp(118.369＋1.223×抗凝血TT?3.453×丹參酮IIA含量＋0.642×丹酚酸B含量?5.175×抗氧化DPPH＋0.645×抗氧化OH)/[1＋exp(118.369＋1.223×抗凝血TT?3.453×丹參酮IIA含量＋0.642×丹酚酸B含量?5.175×抗氧化DPPH＋0.645×抗氧化OH)]

差=exp(?12.692?0.189×抗凝血TT＋1.571×丹參酮IIA含量?1.056×丹酚酸B含量＋1.272×抗氧化DPPH?0.152×抗氧化OH)/[1＋exp(?12.692?0.189×抗凝血TT＋1.571×丹參酮IIA含量?1.056×丹酚酸B含量＋1.272×抗氧化DPPH?0.152×抗氧化OH)]

將不同批次丹參的丹酚酸B、丹參酮IIA含量和生物活性（抗凝血效價(jià)，抗氧化活性）等指標(biāo)實(shí)測(cè)值代入回歸模型表達(dá)式中，從而確定丹參等級(jí)（接近1則判定為該等級(jí)），各等級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。由表3可知，不同產(chǎn)地丹參飲片概率均達(dá)到90%以上，這說明該模型可以較好地對(duì)丹參飲片等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中，優(yōu)級(jí)丹參有6個(gè)批次，良級(jí)有6個(gè)批次，中級(jí)有9個(gè)批次，其余為差級(jí)。而結(jié)合表1及表3結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與初始定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)基本相同，但丹參質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果與丹酚酸B及丹參酮IIA含量測(cè)定結(jié)果不呈單純的線性關(guān)系，這提示在判斷丹參質(zhì)量?jī)?yōu)劣的過程中還應(yīng)將抗凝血、抗氧化等生物學(xué)指標(biāo)劃入考慮范圍之內(nèi)。

4 討論

4.1 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-磷酸水、乙腈-醋酸水和乙腈-甲酸水作為色譜流動(dòng)相，結(jié)果顯示，乙腈-0.1%甲酸水的峰形最佳，分離效果優(yōu)于其它流動(dòng)相，故選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相；采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在270 nm波長(zhǎng)下，樣品待測(cè)成分的峰型好，基線平穩(wěn)，響應(yīng)值高，因此選擇270 nm波長(zhǎng)作為本實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，還考察了體積流量和進(jìn)樣量對(duì)色譜峰峰形以及峰參數(shù)的影響，結(jié)果顯示，體積流量0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL時(shí)峰形最好。

表3 31批丹參的等級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果

4.2 測(cè)定生物活性的方法選擇

現(xiàn)代藥理研究表明，丹參水溶性成分有清除羥自由基的功效，能夠抑制或降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，起到防治心、腦血管病、肝病、腎臟病的作用[20]，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定其抗氧化能力作為生物活性評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。目前，用于評(píng)價(jià)藥物抗氧化能力的方法很多[21-22]，主要分為體內(nèi)和體外2種，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)成本高且繁瑣，動(dòng)物個(gè)體差異影響大；而體外實(shí)驗(yàn)篩選法，具有簡(jiǎn)便、迅速、影響因素少的特點(diǎn)，適合于中藥抗氧化能力的快速評(píng)價(jià)。據(jù)報(bào)道，不同中藥與DPPH自由基反應(yīng)達(dá)到平衡所需的時(shí)間不同，如維生素C與DPPH反應(yīng)20 min即達(dá)到平衡[23]，而丹參提取液與DPPH反應(yīng)時(shí)間緩慢，故從實(shí)際操作角度出發(fā)，本研究確定在加入DPPH溶劑充分反應(yīng)30 min后統(tǒng)一測(cè)定樣品，此時(shí)樣品的吸光度變化趨于平穩(wěn)，保證測(cè)定的準(zhǔn)確性。

丹參具有顯著的活血化瘀作用[24]，本研究通過體外對(duì)SD大鼠血漿進(jìn)行TT測(cè)定來評(píng)價(jià)丹參的抗凝血能力。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，為最大程度接近人體環(huán)境，采用生理鹽水作為提取溶劑。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究嚴(yán)格控制SD大鼠血漿和藥物提取液的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參對(duì)體外SD大鼠血漿TT值有明顯的延長(zhǎng)作用，且TT值與丹參劑量成依賴性，兩者之間也存在明顯的線性關(guān)系，因此，采用TT值來評(píng)價(jià)丹參體外抗凝血活性的方法具有較強(qiáng)的可行性。

4.3 Logistic回歸模型選擇

從模型的通用性和實(shí)用性考慮，具有一定數(shù)學(xué)表達(dá)式的模型更易于被理解和應(yīng)用，其只需將實(shí)際數(shù)據(jù)輸入數(shù)學(xué)表達(dá)式中即可計(jì)算出預(yù)測(cè)結(jié)果。故本研究采用Logistic回歸模型來描述丹參投料飲片等級(jí)與影響因素（成分含量、生物活性）之間的映射關(guān)系，建立丹參投料飲片預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)表達(dá)式，計(jì)算影響因素屬于各等級(jí)的概率，最終確定投料飲片等級(jí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Logistic回歸模型對(duì)所選樣本的擬合結(jié)果與實(shí)際結(jié)果基本一致，說明本研究所建立的模型可以表達(dá)投料飲片等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Grade evaluation ofbased on correlation of “quality marker-biological activity”

YANG Ning-juan1, LIU Yan-ru1, TANG Zhi-shu1, SONG Zhong-xing1, DUAN Jin-ao4, CHEN Lin1, LIU Feng2, CHEN Yan-bin3, XU Gang3, SHI Xin-bo1

1. Drugsand ChineseMedicineFoundationResearch, Xianyang 712083, China 2. Shaanxi International Business College, Xianyang 712083, China 3. Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co., Ltd. Xi’an 710075, China 4. Jiangsu Key Laboratory for Traditional Chinese Medical Formula Research, Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization of Jiangsu Province, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

A logistic regression model for grade evaluation ofmedicinal slices was constructed based on the quality control idea of traditional Chinese medicines that “ingredients reflect activity and activity expresses effect”.Q-marker content inwas tested by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC). Thrombin time (TT) inhibition rate of hydroxyl radical and DPPH clearance rate were used as evaluation indexes of biological activity. Correlations between quality control indexes and bioactivity indexes were analyzed by the logistic algorithm. Finally, A Logistic regression model was established.The results of Logistic model showed that 31 batches ofmedicinal slices were divided into four grades: excellent, good, medium and poor.values of sample grade prediction were higher than 90%, indicating the high accuracy and prediction ability of the Logistic model.The Logistic model based on content determination and biological activity can be used to evaluate quality ofand provide some reference for quality control.

Bge.;binary logistic regression analysis;bioactivity; UPLC; Q-marker

R286.2

A

0253 - 2670(2021)04 - 1135 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.027

2020-06-08

陜西省“特支計(jì)劃”青年拔尖人才項(xiàng)目；國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-QIN-45）；基于多維整合分析策略的盤龍七片質(zhì)量標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)與大品種技術(shù)提升研究（2020ZDLSF05-08）

楊寧娟（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?。Tel: 18291009983 Email: ynj214218@163.com

劉妍如，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物分析研究。Tel: (029)38182207 Email: yanzi_2203@aliyun.com

唐志書，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑制備技術(shù)的研究。Tel: (029)38185060 Email: tzs6565@163.com.

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]