不同來源植物乳桿菌的益生特性研究

丁詩瑤，雷文平，劉成國，張巖春，汪家琦，汪鎮(zhèn)南，周輝

（1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院，長沙410128;2.澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司，長沙410200;3.湖南沙博安科技有限公司,長沙410200）

0 引言

益生菌為具有生物活性，攝入適當量時可以對宿主產生有益作用的微生物[1]。目前研究較多的益生菌生理功能有建立和維持腸道內正常優(yōu)勢種群、營養(yǎng)增強、免疫調節(jié)、降膽固醇、抗腫瘤、延緩衰老等[2]。隨著生活方式的改變，益生菌的應用擴散到飲食保健的方方面面。目前研究較多的益生菌有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌屬等[3]，其中，植物乳桿菌在生物環(huán)境中分布廣泛，且可能具有在不同環(huán)境中有效遷移的能力[4]。從非人體環(huán)境中篩選的乳酸菌，若要采取攝入的方式對人體產生積極作用，需要經過一系列的探究和鑒定，以確定乳酸菌可以相對長時間存在于人體且發(fā)揮其活性。FAO和WHO聯合發(fā)表《食品中益生菌評估指南》中，研究益生菌的主要試驗包括對胃酸的耐受試驗、黏附試驗、對條件致病菌的拮抗活性試驗等[5]。

本研究以實驗室保存的不同來源的植物乳桿菌為材料，通過耐受模擬胃腸液、抑菌活性、體外安全性評價、黏附能力等方面進行試驗，對這7株植物乳桿菌的益生特性進行初步探究，為其之后作為益生菌應用至食品中提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC 9181由湖南沙博安科技有限公司提供；鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）ATCC 6538由中國農業(yè)大學提供；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115及不同來源植物乳桿菌由湖南農業(yè)大學食品科技學院乳品加工實驗室提供，其中，D04、D05、D12、D18從湖南省南山牧場鮮牛奶中分離，D22、D24、D26從湖南農家自制剁辣椒中分離。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g），北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g），國藥集團化學試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS，以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司；抗生素試劑盒（20種），杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XW-80A漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱，韶關市廣智科技設備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；BKQ-B50II全自動高壓蒸汽滅菌鍋，山東博科科學儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋，常州市萬豐儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

將于-80℃保藏的菌株接種于新鮮無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h活化兩代后以1%接種量接種至5 mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，于4℃，10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌2次后重懸，使菌懸液在600 nm波長處的吸光度值為0.8～0.9。

1.3.2 耐受模擬胃腸液能力

模擬胃液配制[6]：量取1 mol/L HCl溶液20 mL，用NaOH溶液將其pH調至3，加入胃蛋白酶使其終濃度為1 g/100mL，0.22μm微孔濾膜除菌。

模擬腸液配制[7]：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使之溶解，用NaOH溶液將其pH調至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL，0.22μm微孔濾膜除菌。

將0.5 mL菌懸液加至4.5 mL模擬胃液或腸液中，混合均勻，于37℃條件下孵育3 h，分別計數0 h及3 h時混合液中乳酸菌數量，以菌株存活率評估植物乳桿菌對模擬胃腸液的耐受能力（以鼠李糖乳桿菌GG為陽性對照）。菌株存活率計算公式如下：

1.3.3 膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

膽鹽水解酶活性[8]：在MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入3 g/L?；撬徕c，使用接種環(huán)將植物乳桿菌發(fā)酵液點種到培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3 d，觀察周圍是否有透明圈產生，以評價菌株的膽鹽水解酶活性。

蛋白水解酶活性：操作同膽鹽水解酶活性，使用1 %脫脂乳粉瓊脂培養(yǎng)基進行測定。

1.3.4 抑菌活性

使用牛津杯法測定植物乳桿菌的抑菌活性。將指示菌大腸桿菌和單增李斯特菌活化三代后，按5 ‰接種指示菌發(fā)酵液至無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，傾注至平板中待其凝固后放置牛津杯，將植物乳桿菌發(fā)酵液200μL加至牛津杯中，4℃靜置4 h后轉到37℃條件下培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑。

1.3.5 體外安全性評價

溶血性：使用血平板進行試驗，操作同1.3.3，以金黃色葡萄球菌為陽性對照。

抗生素敏感性：將植物乳桿菌發(fā)酵液以5 ‰接種至無菌MRS瓊脂培養(yǎng)基中混勻后傾注平板，待凝后將20種抗生素藥敏試紙貼于平板上，37℃培養(yǎng)2 d后測定其抑制圈直徑。

1.3.6 自聚集及共聚集能力

自聚集[9]：將1 mL菌懸液用旋渦混合儀渦旋10 s，在37℃下孵育5 h，輕取200μL上層懸液，測量其600 nm處的吸光值（以鼠李糖乳桿菌GG為陽性對照）。其自聚集公式如下：

式中：A1為處理5 h的吸光值；A0為初始菌懸液的吸光值。

共聚集：以單增李斯特菌和大腸桿菌對植物乳桿菌的共聚集能力進行評價。將等體積的植物乳桿菌和致病菌菌懸液混合，渦旋振蕩10 s，在37℃下孵育5 h后，輕取200μL上層懸液，測量600 nm處的吸光值（A混）。其共聚集公式如下：

式中：A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨處理5 h的吸光值。

1.3.7 疏水性

以謝璐娜[10]的方法稍作修改，將等體積的植物乳桿菌菌懸液及有機溶劑渦旋振蕩2 min，37℃靜置30 min后取水相測其吸光度。有機相選用二甲苯，正十六烷和乙酸乙酯（以鼠李糖乳桿菌GG為陽性對照）。

1.3.8 對Caco-2細胞的黏附能力

細胞培養(yǎng)：將凍存的細胞快速解凍后轉入細胞瓶中，使用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，每2 d換液，待細胞融合度高于85 %進行傳代，傳代5次后進行試驗。

黏附試驗[11]：將細胞轉至6孔板中進行培養(yǎng)，待細胞長至單層，將培養(yǎng)液吸出，無菌PBS洗滌細胞兩次后，加入1 mL用DMEM培養(yǎng)基重懸的植物乳桿菌菌懸液（菌體濃度約為1×109mL-1），5% CO2、37℃條件下孵育2 h。用無菌PBS輕輕洗滌3次以除去未黏附的細菌，再用細胞刮板收集孔中內容物。通過血球計數板確定細胞數，附著的細菌數用平板計數法測定。菌株的黏附能力計算公式如下：

1.4 數據統(tǒng)計

所有試驗均重復三次，采用Excel 2010軟件進行數據統(tǒng)計分析；以SPSS Statistics 26進行方差分析（ANOVA）分析；使用Origin 2018軟件繪制結果圖。

2 結果與討論

2.1 耐受模擬胃腸液能力

7株植物乳桿菌耐受模擬胃腸液的能力如圖1所示。人的腸胃道環(huán)境十分復雜，益生菌在胃腸道中存活的能力，將決定其能否在人體內正常發(fā)揮益生作用[12]。本次試驗通過人工配置胃液及腸液對7株植物乳桿菌進行處理，37℃孵育，模擬益生菌進入人體后在腸胃中所處的消化環(huán)境，以評估其生存能力。從圖1可以看出，7株植物乳桿菌在模擬胃腸液中的存活率均高于75 %，D05、D18在胃液中存活率可接近100 %；D22、D24、D26在腸液中存活率高于95%；其中，D24在胃腸液中存活表現最為突出，與陽性對照LGG相當。進入人體的乳酸菌克服了胃腸中的惡劣環(huán)境，才能夠進一步在腸道中定植，以發(fā)揮其效用。

圖1 植物乳桿菌對模擬胃腸液的耐受性

2.2 抑菌活性

本次試驗選用革蘭氏陽性菌單增李斯特菌和陰性菌大腸桿菌來測定這7株植物乳桿菌的抑菌活性，由圖2可知，這7株菌對兩種致病菌均有一定的抑制能力，其中，D04和D24的抑制能力較為優(yōu)秀，D04對大腸桿菌和單增李斯特菌的抑制圈均高于17.5 mm，D24對單增李斯特菌的抑制圈達到22 mm。益生菌的抑菌能力，能一定程度上幫助宿主在其腸胃道中抵御有害致病菌的侵襲，且應用于食品中時，能夠抑制食品中腐敗菌的生長，則有助于延長商品貨架期[13]。

圖2 7株植物乳桿菌的抑菌活性

2.3 膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

益生菌具有膽鹽水解酶活性有助于增強菌株對膽鹽的耐受性，延長菌體在腸胃道的滯留時間，改變宿主的消化功能或降低血清中膽固醇水平[14-15]。而具有蛋白水解酶活性的益生菌能分解外界蛋白質加以利用，也可以分泌蛋白酶幫助宿主消化[16]。由結果得知，7株菌都具備一定的膽鹽水解酶活性和蛋白水解酶活性，D04、D12的實驗現象更為明顯，水解能力更佳，可進一步確定其酶活，作為潛在降膽固醇益生菌株繼續(xù)探究。

表1 7株植物乳桿菌的膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性

2.4 體外安全性評價

乳酸菌可能會存在某些潛在的安全性問題，《食品中益生菌評估指南》中建議，測定益生菌菌株安全性需確定菌株耐藥性和溶血性[5]。使用血平板測定這7株植物乳桿菌的溶血性結果顯示，7株菌均未出現溶血現象；使用抗生素藥敏片對其耐藥性進行測定，發(fā)現D04對20種抗生素均有一定的敏感性，但其他6株植物乳桿菌對不同的抗生素具有一定的耐藥性，如苯唑西林，D12、D24和D26對其不敏感，氨基糖苷類如卡那霉素、新霉素、慶大霉素，D05和D22對其均不敏感。這些結果與之前報道的一些乳酸桿菌耐藥研究相一致[17-18]。

表2 7株植物乳桿菌的溶血性

2.5 自聚集及共聚集能力

由圖3所示，7株植物乳桿菌的聚集能力差異較大。其中D05和D22的自聚集與共聚集能力都強于陽性對照LGG；D12的自聚集能力最強，但與病原菌共聚集的能力不突出，特別是與單增李斯特菌的共聚集能力只有10 %；除D18，其他植物乳桿菌的自聚集能力均高于致病菌，這與一些文獻報道益生菌的自聚性高于致病菌的結果相一致[19-20]。在與病原菌單增李斯特菌和大腸桿菌的共聚集能力結果中，D22的效果最為明顯，均超過90%。有研究表明，乳酸菌的自聚集能力與其在體內的黏附能力相關[21]，而乳酸菌與致病菌間的共聚集能力可能與之和致病菌競爭黏附腸上皮細胞有密切關系[22]。

表3 7株植物乳桿菌的抗生素敏感性

圖3 7株植物乳桿菌的聚集能力

2.6 疏水性

圖4 所示7株植物乳桿菌及LGG的疏水性結果。除D05和D12外，其他5株菌的疏水率均高于LGG，尤其D04對3種有機試劑的疏水率均超過70 %，且對乙酸乙酯表現出7株菌中最佳的疏水性；D24對二甲苯和十六烷的疏水率均高于82 %，在二甲苯中表現為最佳，十六烷中略低于D18的84 %；D05和D12疏水性都很低，但其自聚集能力都較高。一些研究人員對乳酸菌與小鼠腸黏液的黏附能力及對應的菌株的表面疏水性進行了分析，發(fā)現菌株的黏附能力與疏水性之間不存在明顯相關性，故而菌株表面疏水性的高低并不能完全代表菌株黏附能力的強弱[23-24]。

圖4 7株植物乳桿菌的疏水性

2.7 對Caco-2細胞的黏附能力

益生菌對腸道上皮細胞的黏附，是發(fā)揮其益生作用的先決條件，但直接在體內研究黏附能力難度較大，故而選用類似于人小腸上皮細胞的Caco-2細胞來評估益生菌的黏附能力。7株植物乳桿菌的黏附能力如圖5所示，7株菌的黏附能力差異較大，D12的黏附能力最為突出，平均每個Caco-2細胞能黏附超過58個乳酸菌，D05、D22、D24、D26高于20 CFU/cell，黏附能力較好。病原菌黏附于腸道黏膜被認為是其致病的第一步[25-26]，益生菌在宿主腸道中定植后，將在腸黏膜層形成生物膜或占據黏附位點，阻止病原菌對宿主腸黏膜受體的結合，甚至清除病原菌[11]。

圖5 7株植物乳桿菌的黏附能力

3 結論

本文通過對7株不同來源植物乳桿菌的益生特性進行探究，確定其在模擬胃腸液中耐受存活率均高于75%；均具有膽鹽水解酶及蛋白水解酶活性；對大腸桿菌和單增李斯特菌具有一定抑制能力；無溶血性且對大部分抗生素敏感；其中，D12具有最強的自聚集能力及最佳黏附能力；而D05和D22的聚集能力表現較佳，D04和D18的疏水能力更強。因此，這7株植物乳桿菌可作為潛在益生菌菌株應用于食品中，但7株菌的益生特性各有側重，需要進一步對其優(yōu)勢方面進行探究，運用于不同食品中以發(fā)揮其最大效用。