添加胃腸肽奶粉的抗過敏功效及對胃腸肽自分泌的影響

謝詠梅，汪志凌，王麗媛，高珊，蔡曉唐

（四川大學(xué) 華西第二醫(yī)院兒科出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室，成都610041）

0 引言

生長抑素（Somatostatin，SST）與胃動素（Motilin，MTL）是經(jīng)典的“抑制性”與“興奮性”胃腸肽代表，對“胃腸-神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”功能有著廣泛調(diào)節(jié)作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，母乳中有高濃度的SST及MTL分泌，并可能參與嬰兒胃腸功能維護、抑制過敏及誘導(dǎo)“食物免疫耐受”[1]。牛乳過敏癥在嬰幼兒的發(fā)病率呈顯著升高趨勢，降低牛奶粉的過敏性研究有著積極的醫(yī)學(xué)及社會意義。本著模擬母乳原則，本研究在普通嬰兒牛乳奶粉中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL，探索添加胃腸肽的奶粉對“牛乳過敏癥及食物不耐受”是否有預(yù)防功效及降低風(fēng)險作用。并了解在添加SST及MTL后的奶粉對幼崽自身胃腸肽分泌的影響，觀察其有否顯著臨床副作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象與干預(yù)處理

采用BN（Brown Norway）大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。BN大鼠于四川大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房常規(guī)飼養(yǎng)。生后一周左右的BN大鼠幼仔，按性別及體重分級，隨機分配到3組。每組15只幼鼠，給與不同干預(yù)方式喂養(yǎng)，詳見表1。

添加胃腸肽的牛乳奶粉配置方法：牛乳奶粉按說明書配置成牛乳。牛乳中添加胃動素至終濃度為250 ng/L（豬胃動素，廣州和為醫(yī)藥科技有限公司），并同時添加天然14肽生長抑素至終濃度為400 ng/L（思他寧，瑞士雪蘭諾公司，Laboratoires Serono S.A.）。

1.2 酶聯(lián)免疫法ELISA測定血總免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

所有實驗組BN幼鼠在進行不同干預(yù)喂養(yǎng)處理后，于第29天以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。抽取靜脈血5 mL，800g離心分離制備血清，-20℃凍存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清T-IgE水平，檢測過程按大鼠血清總IgE試劑盒（RapidBioLab,USA）說明書操作。Model 680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）測定650 nm吸光度，繪制標準曲線并計算檢測樣本終濃度。

1.3 臨床損害評分（疊加量化法）

各組大鼠每天觀察狀況，共計干預(yù)喂養(yǎng)4周。按表2標準，分別進行精神行為狀況、消化道癥狀、體重增長情況及皮疹狀況等臨床癥狀評分，最后采用“疊加量化法”評價總體臨床損害程度。臨床損害總評分=皮膚損害評分+消化道癥狀評分+精神行為損害評分+體重落后評分。每周評分一次，連續(xù)4周動態(tài)評分，評分越高者臨床損害越重。

1.4 胃腸動力檢測

采用“葡聚糖藍法”檢測胃腸動力[2]。各組大鼠給予不同干預(yù)方式喂養(yǎng)至28天。第29天禁食禁飲半天后，給予胃管灌入2%葡聚糖藍-2000（四川省維克奇生物科技有限公司）0.4 mL。半小時后處死動物，測定“胃排空比率”及“小腸推進比”。于賁門及幽門處結(jié)扎胃體出入口，向胃體內(nèi)針管注入蒸餾水3 mL，清洗胃腔，收集胃內(nèi)液體，在620 nm波長下（Model 680,Bio-Rad Co.,USA），測定胃內(nèi)色素殘留物吸光度。胃排空比率（%）=（母乳喂養(yǎng)組吸光度的均值/各樣本吸光度）×100%。小腸推進比（%）=（幽門括約肌至色素最前端距離/幽門至盲腸始端總距離）×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫法測定血及大便中SST及MTL含量

大便標本處理：干預(yù)處理滿4周時，于處死大鼠前一天收集新鮮大便標本，凍存于-80℃保存待檢。取大便標本200 mg，加2 mL生理鹽水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，超聲勻漿，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低溫離心3 000 rpm×30 min，取上清液；考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，蛋白液-80℃凍存待檢。

表1 各實驗組干預(yù)處理措施

表2 臨床損害量化評分表

血液標本處理：在處死大鼠前收集動脈血標本5 mL，加入含有7.5% EDTA二鈉30μL和抑肽酶40μL的聚苯乙烯試管內(nèi)，靜置2 h后，離心3 000 rpm×15 min，離心半徑8 cm，取上清液分離血漿，凍存于-80℃保存。取血漿2 mL，加入2 mL生理鹽水，100℃煮沸3 min，加入0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，4℃孵育1～2 h，加入0.1 mol/L NaOH 0.5 mL中和；4℃低溫離心（3 000 rpm）30 min，取上清液；考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，蛋白液-80℃凍存待檢。

采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿及大便中MTL及SST含量。大鼠胃動素ELISA試劑盒及大鼠生長抑素ELISA試劑盒購自上海信裕生物技術(shù)有限公司。檢測過程按試劑盒說明書操作。Model 680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）測定450 nm波長下吸光度（OD值），繪制標準曲線并計算檢測樣本終濃度。每份標本取2份檢測2次，最后結(jié)果以檢測值的均值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0及Graph Pad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示。多個組別之間比較，先采用方差分析（F檢驗）比較總體差異性，再采用q檢驗進行各組別之間兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血總免疫球蛋白E（Total IgE，T-IgE）水平

ELISA法測定各實驗組大鼠血中總IgE（T-IgE）水平，見表3。在胃腸喂養(yǎng)及皮膚涂抹致敏刺激下，牛乳組的T-IgE水平較母乳組有顯著升高（q=112.40，P＜0.0001），提示牛乳激發(fā)了顯著的過敏反應(yīng)。牛乳中添加了胃腸肽后，SST+MTL組的T-IgE較之牛乳組有顯著降低（q=77.96，P＜0.0001）。

表3 血總IgE、臨床損害及胃腸動力狀況（n=15）

2.2 臨床損害評分（疊加量化法）

干預(yù)喂養(yǎng)4周后，牛乳組的臨床損害最重，有皮疹、腹瀉、血便、食納減退、體重增長緩慢等臨床癥狀。SST+MTL組第4周時的臨床損害狀況顯著輕于牛乳組（q=13.24，P＜0.0001），見表3。SST+MTL組的臨床損害總評分在每周的評估中均為最低，見圖1。

嚴重并發(fā)癥情況：在牛乳喂養(yǎng)及皮膚涂抹誘導(dǎo)致敏下，第4周時牛乳組有輕中度皮炎及不同程度的腹瀉、便血癥狀，其他組別的總體臨床損害均輕于牛乳組。所有實驗組均未發(fā)生失血性休克、腸梗阻、重癥喘息、死亡等嚴重并發(fā)癥。

圖1 臨床損害狀況評分（分值）

2.3 胃腸動力檢測

以母乳喂養(yǎng)組的胃排空值作為基線對比，牛乳組及SST+MTL組的胃動力狀況均低于母乳組（見表3）。牛乳組的胃動力最差（vs.母乳組及vs.SST+MTL組，q值分別為16.93及11.51，P＜0.0001）。盡管SST+MTL組的胃動力較之母乳組也有降低，但顯著優(yōu)于牛乳組。小腸推進比情況，牛乳組的小腸蠕動明顯加快，這與牛乳組有明顯腹瀉癥狀相符合（牛乳組vs.母乳組，q=27.30，P＜0.0001）。SST+MTL組的腹瀉癥狀明顯輕于牛乳組，其小腸動力狀況也非常接近BF組，兩組間無顯著差異性（q=0.3513，P=0.9991）。

2.4 血及大便中SST及MTL含量

牛乳組的血SST及血MTL濃度，較之母乳組及SST+MTL組，盡管在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異（P＜0.0001），但其倍比降幅并不大，僅低下20%左右（見表4及圖2）。較之牛乳組，SST+MTL組的血SST及血MTL濃度均有上升，其水平接近母乳組，且同母乳組

圖2 血及大便中SST及MTL水平的倍比率（比值率）

無顯著性差異（P＞0.05，見表4）。大便中的SST/MTL濃度，牛乳組顯著低于母乳組及SST+MTL組（P＜0.0001），且倍比降幅顯著，僅約另兩組濃度的30%左右（見表4及圖2）。SST+MTL組的大便中SST/MTL濃度較之牛乳組有顯著提升，且接近母乳組狀況（vs.母乳組，P＞0.05）。

表4 血及大便中SST及MTL含量（ELISA法，n=15）

3 結(jié)果與討論

胃動素（MTL）與生長抑素（SST）是經(jīng)典的興奮性與抑制性胃腸肽類激素代表[3]，有著廣泛的“胃腸/神經(jīng)/免疫”等調(diào)節(jié)作用。二者的大分子前體均有物種差異，但裂解后的活性部分卻高度保守并跨物種[4-5]。SST與MTL在嬰兒期處于生理性低分泌狀態(tài)。而孕晚期及產(chǎn)后乳母的血漿中SST及MTL分泌水平有顯著增高，母乳中也有高濃度的MTL與SST分泌[1,6-7]，但母乳中活性胃腸肽的生理學(xué)功能尚不明確。

本研究采用高過敏、高IgE反應(yīng)的BN大鼠，牛乳喂養(yǎng)誘導(dǎo)“食物過敏/食物不耐受”模型[8]，并在牛乳中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL，以探討SST/MTL的功能作用。普通牛乳組誘導(dǎo)出了明顯的消化道及皮膚癥狀，且血總IgE水平顯著升高，并有胃動力下降、腸蠕動過快的動力紊亂現(xiàn)象，提示造模成功。添加SST+MTL后的牛乳組，較之普通牛乳組，血總IgE水平顯著下降約50%，臨床損害評分也顯著降低約40%。SST+MTL組的胃腸動力狀況也更接近母乳組，體重增長優(yōu)于牛乳組。可見，添加SST+MTL對牛乳過敏有確定的預(yù)防作用，且能提高普通牛乳的胃腸道耐受性，改善生長發(fā)育狀況。SST+MTL組連續(xù)用藥4周，無明顯副作用顯現(xiàn)。SST/MTL的含量測定顯示，牛乳組血中的SST/MTL濃度較母乳組有輕度降低，但消化道局部（大便中）的SST/MTL的含量明顯低下而缺乏。添加SST+MTL后，消化道局部內(nèi)的濃度提升顯著（約3倍），更接近母乳組狀況，而血循環(huán)中濃度提升則非常輕微（僅20%左右，見圖2）。這顯示，食物中添加SST/MTL更多的是在胃腸道局部起作用，對幼崽的自身血循環(huán)系統(tǒng)中的胃腸肽水平影響較小。

SST是經(jīng)典的抑制性胃腸激素代表，對生長發(fā)育及胃腸功能均有抑制作用[9]。15年前就發(fā)現(xiàn)，嬰兒期血中SST水平較成人顯著低下（約1/4比例），但嬰兒的胃腸道黏膜上“SST受體”表達卻十分豐富，這種“受體與配體不平衡”的奇怪表達現(xiàn)象，其生理學(xué)意義未知[10]。進場我們又發(fā)現(xiàn)，母乳中有豐富的SST分泌，約4倍于人血濃度[1,6-7]，母乳中高濃度的SST應(yīng)該不是為了抑制嬰兒生長，其確切功能尚不明確。同時發(fā)現(xiàn)，食物過敏癥的純母乳喂養(yǎng)嬰兒，其母乳中SST水平有顯著降低。這就聯(lián)想到了SST另一重要功能——內(nèi)源性免疫抑制因子。SST對“炎癥瀑布級聯(lián)反應(yīng)”及“免疫過激損傷”均有顯著抑制作用[11-12]，這一作用早已用于重癥胰腺炎、多臟器損傷等的臨床治療[13-14]。因此推測，嬰兒胃腸道上豐富表達的“SST受體”不是為了感知自身血中低濃度的SST，而是為了感受母乳中的“外源性SST”，SST可能在胃腸道局部起到抑制“食物超敏免疫”，進而誘導(dǎo)“食物免疫耐受”。結(jié)合本研究結(jié)果，添加SST后的牛乳，對胃腸道致敏性顯著降低，消化道免疫損傷有減輕。證明牛乳中添加外源性SST起到了減輕過敏免疫損傷、誘導(dǎo)食物耐受的作用。且食物中的SST主要在消化道內(nèi)形成局部高濃度，對幼崽自身血濃度影響不大。這將有利于SST作用局限于消化道，利于降低抑制生長的全身性副作用。同時本研究結(jié)果顯示，添加SST后，對腸動力有抑制作用，但這一作用剛好對抗和緩解了過敏損傷導(dǎo)致的“腹瀉及腸易激蠕動過快”。另一方面，SST+MTL組的胃動力更接近母乳組狀況，推測可能是MTL拮抗了SST的胃動力抑制作用。

MTL是經(jīng)典的興奮性胃腸肽代表，其類似物治療嬰兒“喂養(yǎng)困難”及“食物不耐受”療效確切[15]。MTL從外周及中樞雙重層面調(diào)節(jié)胃腸動力及食欲[16]，又被稱為“增食欲肽”[17]。嬰兒期MTL處于生理性低分泌狀態(tài)[18]。我們曾發(fā)現(xiàn)，母乳中也有高濃度的MTL分泌，且母乳中MTL水平低下的嬰兒，更易出現(xiàn)腹脹、便秘、食欲低下等功能性消化不良癥狀。MTL水平低下也與功能性消化不良息息相關(guān)[19]。因此推測，母乳給予嬰兒必要的外源性MTL補充，可能起到增強嬰兒胃腸動力、促進消化酶分泌及促進食欲作用，對于維持嬰兒快速生長及支撐過重的胃腸負擔有著重要作用，這可能是“母子共生互補”的重要機制。而牛乳喂養(yǎng)嬰兒的食物中缺乏外源性MTL補充，這可能助推“喂養(yǎng)困難及食物不耐受”風(fēng)險。本研究在牛乳中添加MTL后，幼鼠食欲有改善，體重增長也優(yōu)于純牛乳組。SST+MTL組的胃動力在SST抑制下，MTL顯示出對SST的拮抗平衡作用，其總體胃動力狀況較純牛乳組有顯著改善，更為接近母乳組。證明MTL對SST的胃腸抑制作用有拮抗平衡，并對促進食欲、促進生長及預(yù)防食物不耐受有著良好作用?？梢?，在普通牛乳中添加MTL，有助于改善牛乳的胃腸耐受性，對預(yù)防嬰兒食物不耐受及改善喂養(yǎng)困難有積極作用。而且這一作用多數(shù)局限于消化系統(tǒng)內(nèi)，對幼崽全身血循環(huán)水平影響相對較小。

SST及MTL作為兩種有拮抗相反作用的胃腸肽，為何在人母乳中同時有高濃度分泌，這也是研究中感到困惑的問題。而本研究結(jié)果恰好可以充分揭示二者同時存在的協(xié)調(diào)機制。胃腸動力結(jié)果顯示，SST+MTL組的胃腸動力更傾于正常化，更接近母乳組狀態(tài)，SST與MTL顯示出相互平衡協(xié)調(diào)作用。一方面SST參與抑制食物超敏，誘導(dǎo)食物免疫耐受。另一方面，MTL拮抗SST對胃腸動力的抑制，促進食欲、促進生長，拮抗SST的抑制生長作用。因此推測，天然母乳中的抑制性與興奮性胃腸肽之間，存在“協(xié)同/拮抗”的雙重平衡調(diào)節(jié)機制。而且母乳中的活性SST及MTL可能更多的是在消化道局部發(fā)揮作用，對幼崽自身血循環(huán)水平影響相對較小，這將有利于降低幼崽的全身性副反應(yīng)?？梢?，在普通牛乳奶粉中添加母乳劑量的SST+MTL，能改善嬰兒奶粉的消化道耐受性，降低牛乳過敏風(fēng)險。SST+MTL組的生長發(fā)育及體重增長等狀況明顯優(yōu)于牛乳組，其一般狀況更接近母乳組。SST+MTL組用藥4周，顯示出良好療效，且未見明顯副作用及并發(fā)癥。可見，在牛乳中添加“等同母乳劑量”的SST及MTL是安全的，并能顯著改善普通牛乳的胃腸耐受性及致過敏性。