進(jìn)展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素分析及風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)評(píng)分模型建立

丁平安，楊沛剛，田園，林葉成，郭洪海，劉洋，張志棟，王冬，李勇，趙群

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

目前將近20%的進(jìn)展期胃癌病人在術(shù)前或術(shù)中診斷存在腹膜轉(zhuǎn)移，超過(guò)50%的T3、T4期病人在根治性切除術(shù)后發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，腹膜轉(zhuǎn)移程度越高，生存期越短[1]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，腹腔游離癌細(xì)胞是胃癌腹腔播散轉(zhuǎn)移的一種早期表現(xiàn)形式，目前認(rèn)為屬于晚期胃癌，現(xiàn)有的胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)已將其明確判定為Ⅳ期[2]。研究證實(shí)腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞是形成腹膜轉(zhuǎn)移的先決條件，是胃癌的獨(dú)立預(yù)后不良因素[3]。腹腔內(nèi)是否存在脫落癌細(xì)胞對(duì)胃癌病人生存率有較明顯的影響，絕大多數(shù)腹腔內(nèi)存在脫落癌細(xì)胞的病人術(shù)后3年內(nèi)都死于腹膜轉(zhuǎn)移。因此在行胃癌根治術(shù)前常規(guī)進(jìn)行腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究探討影響進(jìn)展期胃癌病人腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的臨床病理因素，以期為臨床治療提供更精確的分期及參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

分析河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2012年2月至2018年12月期間開展的一項(xiàng)前瞻性、多中心、開放、隨機(jī)對(duì)照Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT01516944)中的225例接受胃癌腹腔鏡探查并進(jìn)行腹腔沖洗脫落細(xì)胞學(xué)檢查的進(jìn)展期胃癌病人的臨床病理資料。該組病人年齡23～78歲(中位年齡50歲)。其中男性162例，女性63例。病人入選標(biāo)準(zhǔn)需同時(shí)滿足以下條件：(1)經(jīng)胃鏡咬檢病理組織學(xué)確診為胃癌，同時(shí)行超聲、CT等影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、腹膜增厚及腹水；(2)無(wú)手術(shù)禁忌，能夠耐受腹腔鏡探查手術(shù)；(3)術(shù)前未接受抗腫瘤治療。所有病人均簽署知情同意書，本研究的設(shè)計(jì)與開展經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(審批號(hào)：20111214029)。

二、方法

1.腹腔鏡探查方法及探查內(nèi)容[4]所有病人均于手術(shù)室在全身麻醉下行腹腔鏡探查及腹腔沖洗脫落細(xì)胞學(xué)檢查。病人取平臥位，于臍下方1.5 cm處作橫行切口，切開皮膚、皮下組織、腹白線及腹膜，置入10 mm Trocar，建立氣腹并維持壓力于12～15 mmHg 水平。置入腹腔鏡頭，直視下于右側(cè)臍鎖骨中線處置入5 mm Trocar，置入操作鉗進(jìn)行探查和灌洗，探查灌洗結(jié)束后拔除Trocar，關(guān)閉戳孔，術(shù)畢。探查順序：左右膈下→肝臟、脾臟→腹腔壁層腹膜→盆腔→大網(wǎng)膜、小腸及系膜→橫結(jié)腸系膜→胃。探查內(nèi)容：(1)有無(wú)腹水；(2)腹盆腔腹膜、腸系膜、大網(wǎng)膜和Douglas腔有無(wú)轉(zhuǎn)移灶；(3)肝表面有無(wú)轉(zhuǎn)移；(4)胃周淋巴結(jié)是否腫大；(5)胃漿膜面有無(wú)浸潤(rùn)；(6)胃壁是否僵硬。 對(duì)于胃體后壁腫瘤，需要切開胃結(jié)腸韌帶，探查小網(wǎng)膜囊，包括橫結(jié)腸系膜和胰腺被膜，必要時(shí)以抓鉗鉗取可疑組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2.腹腔沖洗脫落細(xì)胞學(xué)檢查及評(píng)估方法 (1)腹水收集：以500 mL滅菌生理鹽水分別沖洗左右膈下、腹盆腔腹膜及腸系膜，避免直接沖洗原發(fā)病灶。取頭高腳低位于Douglas腔、肝下及脾窩，收集腹腔沖洗液，離心沉渣，細(xì)胞學(xué)檢查有無(wú)脫落腫瘤細(xì)胞。(2)標(biāo)本的制作：收集的沖洗液進(jìn)行3 000 r/min離心10 min。沉渣溶于分離液，使用一次性病變細(xì)胞采集器，制成HE染色涂片2張用于常規(guī)診斷，同時(shí)制備8張防脫玻片涂片，置于95%乙醇中固定，用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。然后由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行鏡檢腫瘤細(xì)胞。(3)結(jié)果的記錄：腹腔細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性者記錄為CY0，陽(yáng)性記錄為CY1。

3.腹腔脫落細(xì)胞學(xué)結(jié)果判定[5]病理科2名專業(yè)醫(yī)師閱片，胃癌腹腔脫落細(xì)胞染色的陽(yáng)性結(jié)果主要有：核大深染，核漿比例失調(diào)；核染色質(zhì)致密、粗糙，分布不均，排列紊亂；核膜增厚，出現(xiàn)中斷或皺折；核仁增多等(圖1)。

4.腫瘤標(biāo)志物測(cè)定方法 采集所有病人空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5 mL，靜置0.5 h，3 000 r/min離心10 min。采用CobasE601型化學(xué)發(fā)光分析儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]以及配套試劑盒，使用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA)19-9及CA72-4表達(dá)水平。各指標(biāo)正常參考值：CEA≤5.0 μg/L、CA19-9≤30.0 kU/L、CA72-4≤6.9 kU/L，高于上述水平則判定為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)利用 SPSS(21.0版) 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，將分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Logistic回歸分析中，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)和受試者工作特征(ROC)曲線檢測(cè)模型的區(qū)分度和擬合優(yōu)度。

結(jié) 果

一、單因素分析

225例胃癌病人中發(fā)生腹腔沖洗脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性(圖1)者32例，陽(yáng)性率為14.22%。單因素分析顯示，病人的年齡、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度(cT分期)、組織學(xué)類型、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(cN分期)均是影響進(jìn)展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，詳見表1。血清中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA72-4、CA19-9表達(dá)情況亦是影響腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表2。

表1 臨床病理特征與腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的單因素分析

表2 血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)情況與腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的單因素分析

二、多因素Logistic回歸分析

結(jié)果(表3)顯示，腫瘤浸潤(rùn)深度為cT4a～cT4b期以及血清中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4的表達(dá)陽(yáng)性是影響進(jìn)展期胃癌病人腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

表3 腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的多因素Logistic回歸分析

三、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)評(píng)分模型的建立及驗(yàn)證

根據(jù)多因素Logistic回歸結(jié)果建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方程：logit (p)=-7.088+3.042×X1(腫瘤浸潤(rùn)深度)+2.041×X2(CEA)+1.199×X3(CA19-9)+2.022×X4(CA72-4)，采用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)檢測(cè)回歸方程的擬合優(yōu)度(P=0.614)。采用ROC曲線評(píng)價(jià)回歸方程的區(qū)分度，曲線下面積為0.844[95%置信區(qū)間(0.751，0.936)，P=0.000]，見圖2。

圖1 腹腔沖洗液腺癌細(xì)胞鏡檢圖(HE染色，×400)

圖2 進(jìn)展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型受試者工作特征(ROC)曲線

根據(jù)多因素Logistic回歸方程的回歸系數(shù)對(duì)進(jìn)展期胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)分(表4)，建立參數(shù)模型。病人術(shù)前腫瘤浸潤(rùn)深度較深(cT4a～cT4b)及血清中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA72-4、CA19-9表達(dá)陽(yáng)性，其發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分別為3、2、2、1分。評(píng)分≥4分的病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的概率為19.44%，評(píng)分<4分的病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的概率為4.94%。

表4 進(jìn)展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)因素評(píng)分表

討 論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，腹腔肉眼轉(zhuǎn)移病人的中位總生存期(OS)僅為3～6個(gè)月，而腹腔游離癌細(xì)胞陽(yáng)性病人的總生存率同樣較差，術(shù)后5年生存率為0～18%，中位OS為10～15個(gè)月，且大多數(shù)病人均在2年內(nèi)發(fā)生腹腔腫瘤種植復(fù)發(fā)[6-10]。現(xiàn)有文獻(xiàn)認(rèn)為，發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移的先決條件是腹腔內(nèi)存在游離癌細(xì)胞，腹腔游離癌細(xì)胞陽(yáng)性可作為Ⅳ期胃癌的獨(dú)立診斷指標(biāo)，是胃癌的獨(dú)立預(yù)后不良因素[3,11-12]。因此對(duì)進(jìn)展期胃癌病人在根治術(shù)前進(jìn)行腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢查是很有必要的，能夠有效檢測(cè)出游離癌細(xì)胞，可以避免非治療性的開-關(guān)腹手術(shù)，同時(shí)可以為臨床提供更精準(zhǔn)的治療方案。

本研究中225例進(jìn)展期胃癌病人均進(jìn)行腹腔鏡探查及腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢查，脫落細(xì)胞陽(yáng)性者有32例(14.22%)，陽(yáng)性率低可能與腹腔內(nèi)脫落細(xì)胞檢測(cè)方案、術(shù)中使用500 mL生理鹽水沖洗量少及沖洗范圍不足有關(guān)，不能排除假陽(yáng)性與假陰性的可能。有文獻(xiàn)報(bào)道，腹腔灌洗液CEA測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)定量法、轉(zhuǎn)錄-逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同反應(yīng)法(TRC)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)等溫?cái)U(kuò)增法(RT-LAMP)等檢測(cè)技術(shù)可以有效地提高腹腔脫落細(xì)胞檢出的陽(yáng)性率[13-22]。因此在以后的臨床治療中，我們將會(huì)采用更好的脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)、使用更大劑量生理鹽水沖洗及擴(kuò)大沖洗范圍來(lái)降低假陽(yáng)性率及假陰性率，提高腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性診斷的準(zhǔn)確率。

在胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的相關(guān)因素分析方面，我國(guó)相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了積極的探索。宋書彬等[23]通過(guò)對(duì)163例胃癌病人臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，存在腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性15例(9.20%)。單因素分析顯示，病人的病理分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移站別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、第2站淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率以及組織分化程度與腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性有關(guān)(P<0.05)。趙樹鵬等[24]對(duì)100例胃癌病人進(jìn)行回顧性分析，其中20例(20.00%)出現(xiàn)腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性，單因素分析顯示腹腔脫落學(xué)陽(yáng)性率與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型有關(guān)；多因素分析顯示腹腔脫落學(xué)陽(yáng)性率與腫瘤浸潤(rùn)深度及組織學(xué)類型有關(guān)。可見，胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)的陽(yáng)性率與病灶大小及浸潤(rùn)范圍、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及病理學(xué)類型密切相關(guān)。本課題組研究的225例胃癌病人，其中腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性者32例，占14.22%；單因素分析發(fā)現(xiàn)，與胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性有關(guān)的臨床病理因素包括病人年齡、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤部位、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)病人年齡越趨于年輕化，發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的概率越大，其原因可能是病人發(fā)病年齡年輕，自身代謝較為旺盛，而腫瘤組織也以更快速度發(fā)展，繼而更容易發(fā)生腹腔游離癌細(xì)胞，這與既往相關(guān)研究一致[22]。同時(shí)本研究中有2例術(shù)前T2分期病人經(jīng)腹腔鏡探查及脫落細(xì)胞學(xué)檢查后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)存在游離癌細(xì)胞，這提示在臨床診治中對(duì)于所有胃癌病人均應(yīng)該進(jìn)行腹腔鏡探查及腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢查。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，CA19-9作為一種對(duì)消化道腫瘤特異性相對(duì)高的腫瘤相關(guān)抗原，與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[25]。CA72-4 也被認(rèn)為是一項(xiàng)上消化道腫瘤特異和敏感的診斷指標(biāo)，與預(yù)后相關(guān)。同時(shí)CEA是目前最常用的腫瘤標(biāo)志物之一，作為一類廣譜性腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[26]。本研究中病人血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA72-4、CA19-9表達(dá)陽(yáng)性也與腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性有關(guān)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤侵犯深度深、血清中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4的表達(dá)陽(yáng)性是影響進(jìn)展期胃癌病人腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此在臨床診治過(guò)程中，對(duì)于血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4表達(dá)異常增高的病人術(shù)前更應(yīng)該進(jìn)行腹腔鏡探查及腹腔脫落學(xué)檢查，排除腹腔內(nèi)存在游離癌細(xì)胞，避免非治療性的開-關(guān)腹手術(shù)。

同時(shí)胃癌病人一旦發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性將失去根治手術(shù)機(jī)會(huì)，因此，建立一種簡(jiǎn)單有效的評(píng)分模型，提前預(yù)測(cè)腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)胃癌手術(shù)病人圍術(shù)期的管理具有指導(dǎo)意義。本研究分析了可能與胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性發(fā)生相關(guān)的多項(xiàng)臨床病理因素，建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方程，通過(guò)擬合優(yōu)度及ROC曲線證明模型擬合效果好，該方程具有較高診斷價(jià)值。本研究對(duì)Logistic回歸方程中4個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素進(jìn)行權(quán)重分配，對(duì)病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)分。進(jìn)一步分析結(jié)果表明：評(píng)分≥4分的病人發(fā)生腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的概率高達(dá)19.44%，評(píng)分<4分的病人發(fā)生的概率僅為4.94%。

綜上所述，我國(guó)大部分胃癌病人就診時(shí)多處于進(jìn)展期，發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移及腹腔內(nèi)脫落游離癌細(xì)胞的概率大增，因此關(guān)于胃癌腹腔脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素分析對(duì)提高病人臨床療效和遠(yuǎn)期生存率、改善生活質(zhì)量具有重要的意義。對(duì)于術(shù)前分期評(píng)估為cT4a～cT4b期及腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4值增高的胃癌病人，更應(yīng)該行腹腔鏡探查及腹腔沖洗脫落細(xì)胞學(xué)檢查。