人參雨生紅球藻濃縮飲品延緩秀麗隱桿線蟲(chóng)衰老作用的研究

付書(shū)正，王彩霞，譚璐瑩，綦占文，高雪峰，李坤

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2.延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林 延吉133000；3.吉林省億福健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，吉林 長(zhǎng)春130021；4.吉林紫鑫藥物研究有限公司，吉林 長(zhǎng)春130041）

衰老是人體中不可逆的生物學(xué)進(jìn)程，也是諸如心血管疾病、癌癥、帕金森癥和阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病最主要的誘因[1-3]。秀麗線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans，C.elegans）蛋白質(zhì)序列中約有83%與人類(lèi)同源，具有良好的遺傳學(xué)和清晰的生物學(xué)研究背景，其生命周期短，實(shí)驗(yàn)操作方便，是研究人體衰老的經(jīng)典模式生物[4-6]。

人參雨生紅球藻濃縮飲品（Ginseng Haematococcus Pluvialis Concentrated Drink，GHCD）（生產(chǎn)許可證編號(hào)：SC10622240148121；產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：Q/HGF 0353S）是以生曬參、黑果腺肋花楸果、藍(lán)莓、桑椹、黑枸杞、烏梅、黑棗、黑加侖、覆盆子、黑蒜、膠原蛋白肽、雨生紅球藻粉及殼寡糖等為原料，經(jīng)提取、濃縮等工藝而制成。飲品為棕褐色液體，具有人參特有的氣味和滋味，含人參總皂苷≥0.1%。雨生紅球藻中含有的蝦青素是一種抗氧化活性極強(qiáng)的物質(zhì)，蝦青素的抗氧化活性可應(yīng)用于腫瘤、心血管疾病和糖尿病等預(yù)防中，還有提高免疫力、延緩衰老的作用[7，8]。生曬參含有的人參皂苷Rb1、Rg2、Rg3及CK等，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明也都具有抗氧化和抗衰老的功效[9-12]。本實(shí)驗(yàn)借助模式動(dòng)物秀麗線蟲(chóng)，通過(guò)對(duì)其壽命、熱激反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)卵能力及體內(nèi)抗氧化酶活力等方面進(jìn)行觀察，探究GHCD功能食品在其體內(nèi)的抗衰老作用，為抗衰老的功能食品開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參雨生紅球藻濃縮飲品（GHCD，批號(hào)：20200721）由延邊韓工坊健康制品有限公司提供；野生型秀麗線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans，C.elegans）及埃希氏大腸桿菌OP50（Escherichia.coli）均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室提供；SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（生產(chǎn)批號(hào)：20200818）。

SPX-70BIII型生化培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；FRESCO21高速冷凍離心機(jī)（Thermo公司）；SMZ-140體視顯微鏡（Motic公司）；GF36DA立式壓力蒸汽滅菌鍋[致微（廈門(mén)）儀器有限公司]；Epoch酶標(biāo)儀（Bioteck公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秀麗線蟲(chóng)的培養(yǎng)及同期化NGM（Nematode growth media）培養(yǎng)基配制[13]：瓊脂4.0 g、蛋白胨0.5 g、NaCl 0.6 g，加蒸餾水100 mL溶解，搖勻，再加入1 mol/L MgSO4溶液以及1 mol/L CaCl2溶液各0.2 mL、KH2PO4緩沖液3.25 mL，搖勻后補(bǔ)足蒸餾水至200 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻至60℃左右時(shí)，加入5 mg/mL膽固醇乙醇溶液0.2 mL，搖勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，取大腸桿菌OP50置于培養(yǎng)皿內(nèi)于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，備用。

取L4期野生型N2線蟲(chóng)涂布于大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基內(nèi)，20℃培養(yǎng)48～72 h，觀察其產(chǎn)卵情況，開(kāi)始產(chǎn)卵4 h后，將L4期成蟲(chóng)挑去，將卵培養(yǎng)至L4期成蟲(chóng)，該批成蟲(chóng)即為同期化成蟲(chóng)。收集同期化線蟲(chóng)，隨機(jī)分組。

1.2.2 對(duì)秀麗線蟲(chóng)衰老指標(biāo)的檢測(cè)挑取線蟲(chóng)置于不同濃度的GHCD（0.25、0.5和1.0 mg/mL）的NGM培養(yǎng)基，對(duì)照組給予等量的蒸餾水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3.1 秀麗線蟲(chóng)壽命測(cè)定隨機(jī)挑取線蟲(chóng)至涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，每組30條，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為第0天，20℃培養(yǎng)，每天上午將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新的同濃度培養(yǎng)皿內(nèi)，同時(shí)觀察線蟲(chóng)的存活情況。線蟲(chóng)死亡判斷：以鉑絲輕碰觸秀麗線蟲(chóng)后10 s無(wú)反應(yīng)；線蟲(chóng)剔除判斷：線蟲(chóng)爬出培養(yǎng)皿或蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化成袋樣蟲(chóng)。每天記錄秀麗線蟲(chóng)存活和死亡條數(shù)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)至最后一條秀麗線蟲(chóng)死亡為止[14]。

1.2.3.2 秀麗線蟲(chóng)熱應(yīng)激測(cè)定隨機(jī)挑取線蟲(chóng)各30條至給藥組及對(duì)照組，20℃培養(yǎng)3 d。給藥3 d后，封口膜封住培養(yǎng)皿，平鋪放置于35℃培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)2 h；結(jié)束后解開(kāi)封口膜，將培養(yǎng)皿放回20℃培養(yǎng)箱中恢復(fù)12 h。此時(shí)記為第0天。每天更換培養(yǎng)基同時(shí)觀察并記錄線蟲(chóng)的死亡情況，標(biāo)準(zhǔn)如上。

1.2.3.3 秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)測(cè)定隨機(jī)挑取線蟲(chóng)各80條至給藥組及對(duì)照組，此時(shí)記為第0天。分別于第3、5、7、9天，隨機(jī)取20條線蟲(chóng)置于M9緩沖液的不接種大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基中，2 min后觀察3 s內(nèi)每條線蟲(chóng)的移動(dòng)情況（身體擺動(dòng)定義為頭或尾從一側(cè)擺向另一側(cè)）。

1.2.3.4 秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵測(cè)定隨機(jī)挑取線蟲(chóng)各1條至給藥組及對(duì)照組，每組10皿，記為產(chǎn)卵第1天，每隔24 h將親代線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新的NGM平皿中，在產(chǎn)卵高峰期（DAY1-DAY6）內(nèi)，每天記錄蟲(chóng)卵數(shù)目（產(chǎn)卵量）。

1.2.3.5 秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶（超氧化物歧化酶，SOD）活力的測(cè)定隨機(jī)挑取線蟲(chóng)至涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，每組30條，20℃培養(yǎng)72 h，M9緩沖液將秀麗線蟲(chóng)從培養(yǎng)皿上沖洗下，清洗至透明后移除上清液稱(chēng)重，按比例加入生理鹽水，在冰水中進(jìn)行勻漿，勻漿2 500 r/min，離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行SOD酶活力的測(cè)定[15]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“均值±SD”表示。采用方差分析進(jìn)行兩組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響

壽命是秀麗線蟲(chóng)衰老最直接的指標(biāo)，GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)壽命的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，3個(gè)濃度加藥組與對(duì)照組相比，壽命曲線均右移，說(shuō)明GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)的壽命有明顯的延長(zhǎng)作用。在第5天現(xiàn)象較明顯，各濃度加藥組中線蟲(chóng)的活躍程度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，最長(zhǎng)壽命為18 d，從表1中的秀麗線蟲(chóng)平均壽命數(shù)值可以看出，與對(duì)照組相比，1.0 mg/mL加藥組效果最佳，平均壽命為18 d，表明GHCD能延緩線蟲(chóng)衰老。

表1 GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)平均壽命（均值±SD）的影響Table 1 Effect of GHCD on average longevity of Caenorhabditis elegans

圖1 GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)生存率的影響Fig.1 Effect of GHCD on survival rate of Caenorhabditis elegans

2.2 對(duì)秀麗線蟲(chóng)熱激的影響

耐熱的能力也是考察抗衰老的一種表現(xiàn)。高溫條件下，各濃度的加藥組與對(duì)照組相比，秀麗線蟲(chóng)平均壽命均延長(zhǎng)，0.5 mg/mL加藥組線蟲(chóng)平均壽命為8.67 d（表2），曲線明顯右移，能增強(qiáng)線蟲(chóng)抗熱應(yīng)激的能力（圖2）。給藥3 d后，熱激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖2），與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組線蟲(chóng)存活率均有所提高。

表2 GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)熱激平均壽命（均值±SD）的影響Table 2 Effect of GHCD on heat stress of average lifespan of Caenorhabditis elegans

圖2不同濃度的GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)熱應(yīng)激損傷的影響Fig.2 GHCD at the concentration of 0.25，0.5，1.0 mg/mL had effect on heat stress injury of Caenorhabditis elegans

2.3 對(duì)秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力和生殖能力的影響

秀麗線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)卵量與線蟲(chóng)的壽命具有直接相關(guān)性，能評(píng)價(jià)線蟲(chóng)的衰老速度，不僅能體現(xiàn)機(jī)體健康情況，還能反應(yīng)神經(jīng)系統(tǒng)的健康程度。在壽命和熱應(yīng)激試驗(yàn)中10%的飲品作用效果最佳，故選用此濃度檢測(cè)線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)卵量。從擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，從第5天開(kāi)始，飲品能明顯提高線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力（圖3 A）；產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，飲品從第3天開(kāi)始能顯著提高線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量（圖3B）；表明飲品對(duì)線蟲(chóng)的生殖能力有正向增強(qiáng)作用，可延緩線蟲(chóng)衰老。

圖3（A）GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響；（B）GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Fig.3(A)Effect of GHCD on movement of Caenorhabditis elegans;(B)Effect of GHCD on fecundity of Caenorhabditis elegans

表3 GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力（均值±SD）的影響Table 3 Effect of GHCD on movement of Caenorhabditis elegans

表4 GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)產(chǎn)卵量（均值±SD）的影響Table 4 Effect of GHCD on fecundity of Caenorhabditis elegans

2.4 對(duì)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)SOD酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）作為線蟲(chóng)體內(nèi)最主要的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的抗氧化水平至關(guān)重要，SOD能夠有效清除超氧陰離子自由基，保護(hù)機(jī)體，起到抗氧化的作用[16]。秀麗線蟲(chóng)內(nèi)的抗氧化酶活性越強(qiáng)，則GHCD起到的抗氧化作用越強(qiáng)。如圖4所示，經(jīng)測(cè)定，秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的SOD值與給予GHCD的劑量成正比，與對(duì)照組相比，給藥組秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的SOD活性顯著增加（P＜0.05）。由此能夠說(shuō)明給予GHCD后，在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)起到抗氧化的作用，并且SOD值與GHCD呈劑量相關(guān)性。

圖4不同濃度的GHCD對(duì)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性的影響（與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.4 GHCD at the concentration of 0.25，0.5，1.0 mg/mL had effect on the activity of SOD of caenorhabditis elegans(*P＜0.05，**P＜0.01，vs control group)

3 結(jié)論

隨著年齡的增長(zhǎng)，人體內(nèi)細(xì)胞間氧化劑水平會(huì)隨之升高，則產(chǎn)生兩個(gè)影響：對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷以及某些代謝通路的激活?；钚匝踝杂苫≧eactive oxygen species，ROS）及其產(chǎn)物在生命活動(dòng)中具有重要的作用[17]。如果ROS過(guò)量表達(dá)，則會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等產(chǎn)生損傷，促進(jìn)細(xì)胞向癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)變。細(xì)胞通過(guò)平衡ROS產(chǎn)生系統(tǒng)和SOD、過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽的清除系統(tǒng)從而達(dá)到控制ROS水平的目的[18]。本研究通過(guò)利用秀麗線蟲(chóng)模型，探究GHCD抗衰老抗氧化的作用，實(shí)驗(yàn)證明，與對(duì)照組相比，1.0 mg/L的GHCD可以顯著延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)的壽命，在熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中增加線蟲(chóng)的存活率，并且顯著增加其運(yùn)動(dòng)能力、產(chǎn)卵量以及在線蟲(chóng)體內(nèi)的SOD活性，進(jìn)而達(dá)到了延緩衰老的作用。人參雨生紅球藻濃縮飲品中含有人參和雨生紅球藻里提取的天然成分，具有抗氧化的活性，正是因?yàn)檫@些草本植物提取物的功效，與之前報(bào)道的雨生紅球藻中提取的蝦青素等具有強(qiáng)抗氧化的活性一致[19]。本實(shí)驗(yàn)借助秀麗線蟲(chóng)模型探究人參雨生紅球藻濃縮飲品的抗衰老活性，為人參紅球藻等提取成分在哺乳動(dòng)物體內(nèi)抗衰老研究提供思路，也為人參雨生紅球藻的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。