酸水解法富集人參細(xì)胞稀有皂苷工藝研究

朱義剛，申雁冰，王敏

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

人參（Panax ginseng C.A.mey）為五加科人參屬珍貴藥用植物，主要分布在我國(guó)東北及韓國(guó)，人參以其獨(dú)特的滋補(bǔ)功效及民間悠久的服用歷史，被譽(yù)為百草之王，聞名中外。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，人參具有補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、定魂魄、開心、益智、久服輕身延年的功效?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，人參主要的藥理活性物質(zhì)為人參皂苷和人參多糖等[1]，其中稀有人參皂苷具有良好的藥理活性，尤其是有較強(qiáng)的抗腫瘤活性而受到研究者極大關(guān)注。人參皂苷具有多種藥理活性，例如人參皂苷可以清除損害細(xì)胞的氧自由基并在一定程度上具有抗氧化和抗衰老作用[2]，人參總皂苷可以增強(qiáng)5-氟尿嘧啶抗腫瘤的作用療效[3]。人參皂苷Rg1可以改善記憶力[4]。人參皂苷Rd可以提高免疫系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)[5]。人參皂苷Rh2在抑制乳頭狀瘤、黑色素瘤[6]及子宮內(nèi)膜瘤[7]等方面具有重要的作用。人參皂苷Rg3可以抑制人腸癌細(xì)胞增殖[8]。人參皂苷Rk1可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)阻滯乳腺癌細(xì)胞分裂周期，被認(rèn)為是一種新型、潛在的抗乳腺癌藥物[9]。人參皂苷Rg5可以有效抑制癌癥轉(zhuǎn)移，來提高治療效果[10]?？梢娤∮腥藚⒃碥諏?duì)多種常見腫瘤有確切的藥理活性，但是傳統(tǒng)種植人參稀有皂苷的含量極低，通過常規(guī)的提取分離手段獲得稀有皂苷途徑無法滿足市場(chǎng)需求，因此通過化學(xué)方法或者生物學(xué)手段富集稀有人參皂苷成為人參產(chǎn)品開發(fā)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前主要有酸水解法[11，12]、堿水解法和酶催化法[13]，但是堿水解法往往由于條件較難控制、易水解過度，所以較少使用；而酶催化法則由于酶活性不夠?qū)е掠昧枯^大，成本較高；酸水解法尤其是弱酸水解法是目前較常用的方法，其有酸性溫和、產(chǎn)率較高、操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保及產(chǎn)物可不經(jīng)分離直接用于功能性食品領(lǐng)域等優(yōu)勢(shì)[14]。本研究以人參細(xì)胞培養(yǎng)物為起始原料，比較了蘋果酸、檸檬酸及谷氨酸等弱酸富集人參細(xì)胞稀有皂苷的差異，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)對(duì)谷氨酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為規(guī)模化生產(chǎn)富含稀有皂苷人參培養(yǎng)物提供理論指導(dǎo)，是潛在的規(guī)?；a(chǎn)富含稀有人參皂苷的新途徑，對(duì)緩解稀有皂苷供應(yīng)不足的現(xiàn)狀具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀（安捷倫公司）；ES-E210B電子分析天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（山東新華醫(yī)療）；RO DI 1600純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）；LGJ-10F冷凍真空干燥機(jī)（北京松源華興科技有限公司）。

1.2 材料

人參細(xì)胞培養(yǎng)物（紫外檢測(cè)含量≥2.0%，廈門鷺港兆康生物科技有限公司）；人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品Re（批號(hào)：080023-201802，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；人參皂苷Rg1（批號(hào)：080024-201801，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、人參皂苷Rb1（批號(hào)：080021-201802，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、人參皂苷20（R）-Rg3（批號(hào)：080027-201802，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、人參皂苷20（S）-Rg3（批號(hào)：110804-201504，純度：≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、人參皂苷Rh2（批號(hào)：080027-201802，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、人參皂苷Rg5（批號(hào)：04022071-201702，≥98%，上海同田生物技術(shù)股分有限公司）、人參皂苷Rk1（批號(hào)：13360120-201802，純度：≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸、谷氨酸、蘋果酸（純度：≥98%，西隴科學(xué)股份有限公司）；乙腈（色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）；無水甲醇、正丁醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

2 方法

2.1 蘋果酸水解富集稀有皂苷

精密稱量7.5g人參細(xì)胞培養(yǎng)物，分別加入到不同濃度的蘋果酸水溶液中，在60℃水浴鍋中攪拌30 min，均勻分散后置于120℃高壓滅菌鍋中保溫20 min，滅菌結(jié)束后自然冷卻至室溫，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，即得較高稀有皂苷含量的人參細(xì)胞培養(yǎng)物。

2.2 檸檬酸水解富集稀有皂苷

精密稱量7.5g人參細(xì)胞培養(yǎng)物，分別加入到不同濃度的檸檬酸水溶液中，在60℃水浴鍋中攪拌30 min，均勻分散后置于120℃高壓滅菌鍋中保溫20 min，滅菌結(jié)束后自然冷卻至室溫，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，即得較高稀有皂苷含量的人參細(xì)胞培養(yǎng)物。

2.3 谷氨酸水解富集稀有皂苷

精密稱量7.5g人參細(xì)胞培養(yǎng)物，分別加入到不同濃度的谷氨酸水溶液中，在60℃水浴鍋中攪拌30min，均勻分散后置于120℃高壓滅菌鍋中保溫20 min，滅菌結(jié)束后自然冷卻至室溫，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，即得較高稀有皂苷含量的人參細(xì)胞培養(yǎng)物。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究以人參細(xì)胞培養(yǎng)物為試驗(yàn)材料，選用正交表L9（34）共9組試驗(yàn)，重復(fù)5次。正交試驗(yàn)的各因素及水平見表1。按正交表設(shè)計(jì)中試驗(yàn)組控制谷氨酸水解富集稀有皂苷轉(zhuǎn)化條件。

2.5 人參皂苷含量的測(cè)定[15]

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh2、20（R）-Rg3、Rk1、20（S）-Rg3、Rg5標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解制成每1 mL各0.2 mg的混合溶液，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

2.5.2 對(duì)照樣品1溶液的制備稱量人參細(xì)胞培養(yǎng)物1 g，用中性濾紙包好，置索氏提取器中，加入適量氯仿回流3 h，棄去氯仿，揮干溶劑，加飽和正丁醇水溶液50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

2.5.3 對(duì)照樣品2溶液的制備稱量人參細(xì)胞培養(yǎng)物1 g，加入等酸體積的純化水，在60℃水浴中攪拌30 min，均勻分散后置于120℃高壓滅菌鍋中保溫20 min，滅菌結(jié)束后自然冷卻至室溫，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，收集干品按照2.5.2步驟進(jìn)行制樣，即得。

2.5.4 樣品溶液的制備稱量人參細(xì)胞培養(yǎng)物1 g，經(jīng)不同酸轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的人參細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品經(jīng)冷凍干燥，收集干品按照2.5.2步驟進(jìn)行制樣，即得。

2.5.5 液相色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以超純水為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫程序，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算不低于6 000。

2.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了5次重復(fù)。結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度蘋果酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響

蘋果酸是具有重要功能的有機(jī)酸[16]，是目前世界食品工業(yè)中用量最大和發(fā)展前景較好的有機(jī)酸之一，常作為酸度調(diào)節(jié)劑來改良食品風(fēng)味。試驗(yàn)用不同濃度的蘋果酸處理人參細(xì)胞培養(yǎng)物后，結(jié)果如圖1所示，隨著蘋果酸濃度的提高，稀有人參皂苷含量先逐步提高后略微降低；蘋果酸較適宜的添加量為0.6 mg mL-1，此時(shí)普通皂苷大部分被轉(zhuǎn)化，稀有人參皂苷含量最大。當(dāng)蘋果酸量不足時(shí)，例如在0.3 mg mL-1時(shí)，有近1/3的普通皂苷未被轉(zhuǎn)化，可見蘋果酸的添加量對(duì)人參皂苷的轉(zhuǎn)化具有重要作用。適量濃度的蘋果酸在高溫條件下可以使Re、Rb1等皂苷完全轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，該結(jié)果與張金秋等報(bào)道一致[17]。

圖1不同濃度蘋果酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.1 Effect of malic acid concentrations on ginsenoside conversion

3.2 不同濃度谷氨酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響

如圖2所示，不同濃度的谷氨酸處理人參細(xì)胞培養(yǎng)物后，隨著谷氨酸濃度的提高稀有人參皂苷含量先逐步提高后逐漸降低；谷氨酸較適宜的添加量為2.5 mg mL-1，此時(shí)普通皂苷大部分被轉(zhuǎn)化。當(dāng)谷氨酸量不足時(shí)，例如1.25 mg mL-1時(shí)，有近1/2的普通皂苷未被轉(zhuǎn)化，可見谷氨酸的添加量對(duì)人參皂苷的轉(zhuǎn)化具有重要作用。谷氨酸作為一種酸性氨基酸，其弱酸性水溶液可以有效水解人參皂苷結(jié)構(gòu)中C-20及C-3位糖苷鍵，進(jìn)而得到稀有皂苷。

圖2不同濃度谷氨酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of glutamate concentrations on ginsenoside conversion

3.3 不同濃度檸檬酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響

檸檬酸是常用的食品酸度調(diào)節(jié)劑，酸度相比鹽酸、硫酸的酸性小，可有效避免酸水解過度而影響稀有皂苷得率。檸檬酸水解試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，不同濃度的檸檬酸處理人參細(xì)胞培養(yǎng)物后，普通皂苷含量逐步降低，當(dāng)檸檬酸較適宜的添加量為0.6 mg mL-1時(shí)，普通皂苷大部分被轉(zhuǎn)化；當(dāng)檸檬酸不足時(shí)，例如在0.3 mg mL-1時(shí)，有近1/3的普通皂苷未被轉(zhuǎn)化。

3.4 不同種類的酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷

不同種類的酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷的含量及轉(zhuǎn)化率結(jié)果見表3。從表3可知，谷氨酸水解人參細(xì)胞培養(yǎng)物效果最佳，稀有皂苷含量分別是檸檬酸和蘋果酸的1.15倍和1.27倍。檸檬酸和蘋果酸常作為食品加工中的酸度調(diào)節(jié)劑，酸度值較低，谷氨酸是一種酸性氨基酸，呈弱酸性，人參皂苷的多糖結(jié)構(gòu)容易在弱酸環(huán)境中被部分或完全水解，可能由于谷氨酸溶液酸度較適宜，不易造成人參皂苷過度水解。因此，谷氨酸相對(duì)檸檬酸和蘋果酸對(duì)人參稀有皂苷的富集量更大。

圖3不同濃度檸檬酸對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of citric acid concentrations on ginsenoside conversion

表3 不同酸種類水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷的對(duì)比Table 3 Comparison of rare saponins enriched by different acid hydrolyzed Panax ginseng cells

3.5 谷氨酸水解富集人參細(xì)胞培養(yǎng)物稀有皂苷的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。通過正交法設(shè)計(jì)的直觀分析法可見，谷氨酸水解富集人參細(xì)胞培養(yǎng)物稀有皂苷的最優(yōu)條件A2B2C2，即3種因素的最優(yōu)組合為水解溫度75℃、水解時(shí)間120 min、谷氨酸濃度3 mg L-1。通過極差分析可見，影響谷氨酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷的因素的主次影響為C＞A＞B，即谷氨酸濃度＞水解溫度＞水解時(shí)間。經(jīng)過SPSS24.0軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表5可見C因子（P＜0.05）對(duì)谷氨酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷影響顯著，其他因子對(duì)谷氨酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷影響不顯著。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 L9(34)orthogonal test and results

表5 主體間效應(yīng)檢驗(yàn)Table 5 Inter subject effect test

3.6 試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)化人參細(xì)胞培養(yǎng)物富集稀有皂苷的最優(yōu)組合條件和最佳組合進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，其結(jié)果如表6所示，最優(yōu)組合A2B2C2與正交表最佳組合A2B1C2相比，前者稀有皂苷平均含量是后者的1.05倍。因此綜合正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)可以得出結(jié)論，谷氨酸水解富集人參細(xì)胞培養(yǎng)物稀有皂苷的最佳條件為溫度75℃，時(shí)間120 min，谷氨酸濃度為3 mg mL-1，人參細(xì)胞培養(yǎng)物中稀有皂苷的含量高達(dá)16.75 mg g-1。

表6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 6 Results of validation experiment

4 討論與結(jié)論

應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行人參的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，被認(rèn)為是解決現(xiàn)有種植人參占用林地、破壞環(huán)境問題的潛在可行的途徑。近幾十年來，日本及韓國(guó)先后成功進(jìn)行了人參組織培養(yǎng)的工業(yè)化大生產(chǎn)[18，19]。我國(guó)在人參組織培養(yǎng)方面也取得了較大的進(jìn)步[20]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人參的主要活性物質(zhì)為人參皂苷，其中稀有皂苷可以抑制多種腫瘤細(xì)胞，在抗腫瘤方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但是目前市場(chǎng)上的園參、林下參等稀有皂苷的含量極低，滿足不了人們對(duì)富含稀有皂苷人參制品的需求。本試驗(yàn)選擇3種較常用的食品添加劑，并比較其提取人參培養(yǎng)物的富集稀有皂苷量的差異，結(jié)果表明谷氨酸富集的稀有皂苷含量相對(duì)高，進(jìn)一步通過正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳的水解條件為溫度75℃，時(shí)間120 min，谷氨酸濃度為3 mg mL-1，人參細(xì)胞培養(yǎng)物中稀有皂苷的含量高達(dá)16.75 mg g-1，是市售高麗參稀有皂苷含量的16倍左右。利用谷氨酸水解人參細(xì)胞富集稀有皂苷具有工藝簡(jiǎn)單、操作安全和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。此外，植物組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合酸水解法協(xié)同作用富集高稀有皂苷含量的人參，可以進(jìn)一步開發(fā)成高端的食品、保健品及藥品，展示出廣闊的應(yīng)用前景。