七株鵝腸道沙門氏菌的分離鑒定、藥敏試驗及毒力基因、耐藥基因的檢測

李 珂， 黃凱倫， 解新迪， 郭偉娜，劉 暢， 張 寧， 李賀俠， 路振香*

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.南京市棲霞區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 南京 210046；3.安徽省和縣動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 和縣 238200)

沙門氏菌(

Salmonella

) 是人和多種動物的致病菌，各個年齡段的動物均可感染沙門氏菌，但以幼年動物更易感， 感染者主要表現(xiàn)為急性腹瀉、腸炎及敗血癥等。全世界每年大約有 1600 萬人感染沙門氏菌病，其中，因為感染該病而死亡者約 60 萬。沙門氏菌能引起多種動物的全身性的感染以及人類的食物中毒等，全世界每年因沙門氏菌引起的食物中毒人數(shù)經(jīng)常占各類細(xì)菌性食物中毒首位。目前，沙門氏菌耐藥性問題日益突出，給臨床治療該菌造成的感染帶來很大困擾。

本研究擬對2018年以來養(yǎng)殖戶送檢的7個批次在當(dāng)?shù)亟?jīng)過治療沒有效果，以肝臟、脾臟腫大、瘀血斑駁樣，腸道廣泛性出血，氣囊渾濁為主要病理變化病死鵝進(jìn)行病原分離鑒定、藥敏試驗、毒力基因、耐藥基因的檢測，為養(yǎng)殖戶用藥提供指導(dǎo)，并對其致病機(jī)理和耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018年初至2019年底安徽滁州地區(qū)養(yǎng)殖戶送檢的7個批次在當(dāng)?shù)亟?jīng)過抗菌藥物治療沒有任何效果的病死雛鵝若干只。

1.1.2 藥敏紙片 慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢他啶、阿米卡星、頭孢唑林、大觀霉素、頭孢曲松等抗菌藥物紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司，生產(chǎn)批號是20190315。

1.1.3 試劑 引物均由安徽通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成。DL2000及2×Taq PCR MasterMixTM均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物均由安徽通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)、純化 用無菌接種環(huán)蘸取病死鵝的肝臟組織，分別在營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂上劃線進(jìn)行病原菌的分離，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。將麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)出的單個典型菌落劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上純化，挑取純化后的分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。

1.2.2 分離菌生化試驗 將純化后的分離菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵、吲哚形成、甲基紅、VP和產(chǎn)HS試驗。

1.2.3 分離菌DNA模板制備 對病原菌進(jìn)行2次分離純化，待鏡檢確保無雜菌后，用水煮法提取分離菌的DNA模板。

1.2.4 分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增 使用細(xì)菌16S rRNA通用引物， 27F：5'-GCTTTATCCTCTGGCCTT-3' 和1492R：5'-GGTTAACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，細(xì)菌模板2 μL，超純水19 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.5 分離菌體外抑菌試驗 采用圓紙片法。分別用無菌涂布棒蘸取適量分離菌新鮮純培養(yǎng)物均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板表面，將圓紙藥片均勻地貼于其上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[6～10]報道的沙門氏菌毒力基因序列合成試驗所需的沙門氏菌毒力基因引物，引物序列如表1所示,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。

表1 分離菌毒力基因引物序列

表2 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCRbuffer 2.5 μL、細(xì)菌模板1 μL、dNTP 1 μL、Taq酶0.25 μL、超純水18.25 μL、上、下游引物各1 μL。

1.2.7 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[11～12]報道的沙門氏菌耐藥基因序列合成本次試驗所需耐藥基因引物，引物序列如表3所示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件，見表4。

表3 分離菌耐藥基因引物序列

反應(yīng)體系25 μL：PCRbuffer 5.0 μL、超純水15.75 μL、dNTP 1.0 μL、Taq酶0.25 μL、細(xì)菌模板1.0 μL、上、下游引物各1.0 μL。

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳 在1%瓊脂糖凝膠的第一孔加6 μL D2000Maker作為對照，其他孔分別加5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer 的混合物。電壓設(shè)定為110 V，電泳30 min。

表4 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察結(jié)果

從7個批次送檢的病死鵝肝臟組織中分離到7株均為革蘭氏陰性、單個散在的中等大小桿菌，該分離菌在麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板上均為淡橘紅色透明、邊緣整齊、光滑、圓形的小菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落均為灰白色圓形、邊緣整齊、光滑濕潤、半透明的小菌落。

2.2 分離菌生化試驗結(jié)果

7株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，不能利用乳糖和蔗糖；吲哚形成試驗和甲基紅試驗陽性，VP試驗陰性，均產(chǎn)HS。

2.3 分離菌藥敏試驗結(jié)果

7株分離菌藥敏試驗結(jié)果見表5。

表5 7株分離菌藥敏試驗結(jié)果

2.4 分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可知：擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的目的基因。

注：M：DL2000 marker；1～7：7株分離菌。

2.5 分離菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

由圖2可得，7株分離菌均與GenBank中的腸道沙門氏菌同源性在99%以上，因此，分離菌均為腸道沙門氏菌。

注: 圖中GSC1～7為7株分離菌的序列。

2.6 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果詳見圖3～5。結(jié)果顯示，7株分離菌均沒有擴(kuò)增出毒力島基因

misL

和毒力島基因

ssaB

。

注：M：DL2000 marker；1～7：7株分離菌。下同。

圖4 分離菌菌毛基因invJ凝膠電泳圖

圖5 分離菌菌毛基因sipA凝膠電泳圖

2.7 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖6～9可得，分離菌均沒有擴(kuò)增出喹諾酮類耐藥基因

qnr

。

圖6 分離菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blatem-1凝膠電泳圖

圖7 分離菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因baCMY-2凝膠電泳圖

圖8 7株分離菌磺胺類耐藥基因sul1凝膠電泳圖

圖9 分離菌卡那霉素耐藥基因aadA1凝膠電泳圖

3 結(jié)論與討論

本研究從2018年初至2019年底養(yǎng)殖戶7次送檢的在當(dāng)?shù)亟?jīng)過抗菌藥物治療沒有效果的病死鵝的肝臟中分離得到7株均為單個存在、革蘭氏陰性中等大小桿菌，同源性分析結(jié)果顯示：7株分離菌均為腸道沙門氏菌，并且分離株之間同源性較高，可能是由于該菌能夠引起多種動物感染發(fā)病，并且該菌在患病動物排泄的糞便中含量高，這些病菌可以通過糞便污染土壤、飼料和水等，帶有該菌畜禽糞便可以借助水源散播，鴨、鵝等水禽可以經(jīng)水感染。產(chǎn)蛋種禽如果感染了該菌，能夠通過種蛋將其傳遞給雛禽。送檢病死鵝均來自滁州地區(qū)養(yǎng)殖戶，飼喂的鵝苗有的來自同一家孵化場同一批次種蛋。

從藥敏試驗及耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果可知：7株分離菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，均對磺胺類藥物(如：復(fù)方新諾明)耐藥，并且都擴(kuò)增出了磺胺類耐藥基因

sul1

；6株對阿米卡星耐藥，且6株均擴(kuò)增出卡那霉素耐藥基因

aadA1

；2株擴(kuò)增出

blaterm

-

1

基因，3株擴(kuò)增出

β

-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因

baCMY

-

2

，均未擴(kuò)增出喹諾酮耐藥基因

qnr

。藥敏試驗結(jié)果與耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果一致，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與耐藥基因的存在密切相關(guān)。毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：4株分離菌擴(kuò)增出腸毒素基因

stn

和菌毛素基因

invJ

，3株擴(kuò)增出菌毛素基因

sipA

，均未擴(kuò)增出毒力島基因

misL

和毒力島基因

ssaB

。沙門氏菌的毒力因子有多種，主要包括脂多糖、腸毒素、菌毛、毒力島、毒力質(zhì)粒等。腸毒素是沙門氏菌中重要的致病因子，帶有菌毛的菌株致病力很強(qiáng)，因菌毛具有黏附作用能與纖連蛋白結(jié)合抵抗消化道內(nèi)的殺菌物質(zhì)，從而降低機(jī)體抵抗力。