光果甘草愈傷組織總黃酮和總酚提取工藝優(yōu)化

苗永美， 方 達(dá)， 王宇豪， 汪 雁， 張 維

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

光果甘草(

Glycyrrhiza

glabra

L.)是《中國藥典》收錄的3種藥用甘草之一,又稱為歐甘草,零星分布于我國新疆地區(qū)。光果甘草根中含黃酮(異黃酮)、總酚、皂苷、多糖等有效活性成分,具消炎、治肝硬化,降血脂和降血壓、抗氧化等功效。近年來因光果甘草中的甘草定具有美白作用被譽(yù)稱為“美白黃金”。

黃酮類和酚類化合物廣泛存于植物體內(nèi),提取方法研究較多。其中黃酮提取方法主要有加熱回流、超聲輔助、微波輔助、雙水相、閃式、超臨界CO和微生物混合發(fā)酵等提取;多酚化合物提取方法有加熱回流、酶解輔助、超聲波輔助、微波輔助等。提取選用的溶劑有主要甲醇和乙醇。提取方法選擇除了考慮方法本身特點(diǎn)外,還要考慮材料本身。愈傷組織用途廣,可用于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,還可作為誘變、轉(zhuǎn)基因的受體,本研究選愈傷組織為材料,乙醇為溶劑,磁力攪拌加熱冷凝回流提取法,單因素考察了4個(gè)主要因素,此基礎(chǔ)上,再對溫度、時(shí)間、液料比和乙醇濃度進(jìn)行正交設(shè)計(jì),優(yōu)化出適合愈傷組織總黃酮和總酚的提取工藝,為后期光果甘草細(xì)胞培養(yǎng)中兩種成分的檢測提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)光果甘草莖段獲取的愈傷組織。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%),沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%,上海伊卡生物技術(shù)有限公司);乙醇,Al(NO),NaNO,NaOH,NaCO,福林酚等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

主要儀器包括DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司);ThermoHeraeus Multifuge X1R冷凍離心機(jī),T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 方法優(yōu)化

1.3.1 材料處理 洗凈愈傷組織表面培養(yǎng)基,切成小塊,60 ℃ 烘干,研磨,依次過40、60目篩,干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單因素試驗(yàn) 分別對單因素試驗(yàn)涉及到的溫度、時(shí)間、料液化和乙醇濃度分別進(jìn)行考察。首先，0.40 g粉末按液料比60∶1加入 60%(V/V)乙醇,分別在40、50、60、70、80 ℃下冷凝回流提取25 min;其次，0.40 g粉末按液料比60∶1加入60%(V/V)乙醇,60 ℃條件下分別提取20、25、30、60、90、120 min;再次，0.40 g粉末,按液料比50∶1、60∶1、70∶1、80∶1分別加入60%乙醇,60 ℃提取25 min;最后，0.40 g粉末按液料比60∶1分別加入50%、60%、70%、80%乙醇,60 ℃提取25 min。所得提取液離心,上清用于總黃酮和總酚測定。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素結(jié)果,進(jìn)行正交設(shè)計(jì),選用4因素3水平表L(3)。總黃酮和總酚提取因素水平設(shè)計(jì)見表1～2,3組平行。

表1 總黃酮提取正交試驗(yàn)因素水平

表2 總酚提取正交試驗(yàn)因素水平

1.3.4 提取量計(jì)算 總黃酮含量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=7.428 6X-0.008 4(

R

=0.999 8),線性范圍為0.025～0.15 mg/mL;總酚含量測定以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用福林酚法,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=15.63X-0.010 3(

R

=0.998 7),線性范圍為0.01～0.05 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對2種活性成分含量的影響

溫度、時(shí)間、液料比和乙醇濃度4個(gè)因素對總黃酮和總酚提取量的影響見圖1?？傸S酮提取量隨溫度升高呈先增大后降低趨勢,60 ℃時(shí)最大,為3.35 mg/g;總酚提取量在提取溫度50～70 ℃范圍內(nèi)急劇增加,80 ℃時(shí)最高,為11.42 mg/g。隨提取時(shí)間延長,總黃酮的提取量先增大后降低,60 min時(shí)最大,為3.54 mg/g,但僅比30 min時(shí)提高了0.17%,從成本考慮,30 min為合適時(shí)間;總酚提取量在25 min時(shí)最高,僅比20 min的增加了0.46%,超過25 min后,提取率下降幅度大。液料比60∶1時(shí),黃酮浸提量達(dá)到最大值,為3.34 mg/g;隨著溶劑體系增加,總酚浸提效果越好,料液比70∶1時(shí)提取量達(dá)到11.59 mg/g?？傸S酮和總酚提取量均隨著乙醇濃度升高先急劇增加后緩慢降低,70%時(shí)提取率最高,分別為3.34、11.00 mg/g,高濃度乙醇可能是由于脂溶性雜質(zhì)的溶解,改變了溶液性質(zhì)從而降低了總黃酮、總酚提取率。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)對成份的影響

2.2.1 總黃酮提取 正交試驗(yàn)結(jié)果見表3,其方差分析及多重比較分別見表4～5。方差分析表明溫度、時(shí)間、乙醇濃度對總黃酮提取率影響顯著,液料比影響不顯著。由

R

值可知,對提取量的影響由大到小依次為乙醇濃度>時(shí)間>溫度>液料比。根據(jù)多重比較分析結(jié)果并考慮其成本,光果甘草愈傷組織總黃酮提取優(yōu)化工藝為液料比50∶1、乙醇濃度60%、溫度50 ℃、時(shí)間60 min。

表3 總黃酮L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表5 多重比較

2.2.2 總酚提取 正交試驗(yàn)結(jié)果見表6,方差分析及多重比較分別見表7～8。方差分析表明只有提取時(shí)間和乙醇濃度對總酚提取量影響顯著。由R值可知,4個(gè)因素對總酚提取量的影響從大到小順序?yàn)闀r(shí)間>乙醇濃度>溫度>液料比。根據(jù)多重比較分析結(jié)果并考慮成本,光果甘草愈傷組織總酚提取優(yōu)化工藝為液料比70∶1、乙醇濃度60%、溫度70 ℃、時(shí)間25 min。

表6 總酚L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析

表8 多重比較

3 結(jié)論與討論

植物藥用成分的種類和含量因植物和生長年限而異,不同的提取方法和提取條件會(huì)得到不同的提取效果,因此選擇提取方法時(shí)除了考慮方法本身特點(diǎn)外,還要考慮植物種類、年限、培養(yǎng)環(huán)境等。藥用植物愈傷組織或細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的重要途徑,成分含量與培養(yǎng)條件、細(xì)胞株有關(guān),目前有關(guān)光果甘草愈傷組織或細(xì)胞中黃酮或酚提取工藝優(yōu)化研究較少,探究提取工藝的優(yōu)化可最大程度地獲取較高提取率,可為更好地篩選高產(chǎn)細(xì)胞株或培養(yǎng)條件優(yōu)化提供檢測方法。根據(jù)相溶相似原理,黃酮類和酚酸類物質(zhì)常用甲醇和乙醇作溶劑,加熱冷凝回流法或者借助超聲、微波等輔助法最常用,李娜等選用甲醇作溶劑超聲提取了2年生光果甘草四種器官中總黃酮。雖超聲和微波能提高效率,但會(huì)對物質(zhì)結(jié)構(gòu)有一定破壞;甲醇使用安全性不如乙醇高;而光果甘草中總酚提取未見報(bào)道,因此本研究選用乙醇為溶劑,磁力加熱攪拌冷凝回流提取總黃酮和總酚酸。方差分析表明溫度、時(shí)間、乙醇濃度對總黃酮提取率影響顯著,而液料比對提取率影響不顯著,50∶1～70∶1范圍內(nèi)均可;時(shí)間和乙醇濃度對總酚的提取量影響顯著,而溫度和液料比對提取率影響不顯著,70～90 ℃,70∶1～90∶1范圍內(nèi)均可。不同植物所含黃酮和酚類型不同,結(jié)構(gòu)的不同決定著極性不同,因此,不同植物體內(nèi)的黃酮和酚提取需要不同極性的溶劑。本研究表明低濃度乙醇不利于黃酮和酚的浸出,而高濃度乙醇可能因?yàn)槭垢嗟姆悄繕?biāo)物質(zhì)浸出干擾了檢測,或者由于溶質(zhì)溶劑極性差異影響了浸出。目標(biāo)成分的浸出需要合適溫度和時(shí)間,過高的溫度和長時(shí)間浸提會(huì)引起聚合或分解,從而影響了產(chǎn)量。

綜上所述，根據(jù)各個(gè)因素不同水平影響差異,得到總黃酮提取優(yōu)化工藝為液料比50∶1、乙醇濃度60%、溫度50 ℃、時(shí)間60 min;總酚提取工藝為液料比70∶1、乙醇濃度60%、溫度70 ℃、時(shí)間25 min。由此看出,光果甘草中總黃酮的提取需要較小溶劑量、較低溫、長時(shí)間,而總酚的提取需要較大溶劑量、較高溫、短時(shí)間。