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    TW-37對(duì)肺癌細(xì)胞和血管生成的影響及其機(jī)制研究

    2021-02-24 07:38:22謝丹李旖查銀蓮何櫻
    關(guān)鍵詞:孵育肺癌誘導(dǎo)

    謝丹,李旖,查銀蓮,何櫻

    (惠州市中心人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,廣東 惠州516001)

    肺癌是最常見(jiàn)的癌癥死亡原因,占癌癥相關(guān)死亡的24%,診斷后5年生存率僅為15%。約85%肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌[1]。診斷時(shí),大多數(shù)肺癌患者都存在一定程度的肺癌轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后惡化,而血管生成是肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[1]。新生血管在癌組織中發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)和分解代謝物的作用,并促使腫瘤的轉(zhuǎn)移,因此血管生成抑制劑被廣泛用于治療肺癌[2-4]。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是血管生成的有效誘導(dǎo)劑,通過(guò)激活其下游信號(hào)分子,可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,從而促進(jìn)血管生成,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5]。

    有文獻(xiàn)指出, B 淋巴細(xì)胞瘤2 (B cell lymphoma 2, Bcl-2)小分子抑制劑TW-37 具有抗血管生成活性,其可通過(guò)與Bcl-2 結(jié)合,從而抑制Bcl-2 和Bcl-2 家族促凋亡成員的異源二聚化,進(jìn)而促進(jìn)線粒體孔形成并誘導(dǎo)釋放細(xì)胞色素c 和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,最終在體內(nèi)外抑制腫瘤的生長(zhǎng)[6-7]。此外,Bcl-2 可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中酸酐酶Ⅸ、VEGF 和p-Akt的表達(dá),其可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF 的表達(dá),促進(jìn)血管生成[8-9],但是其靶分子和抗血管生成的確切機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討TW-37對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成的影響及其機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

    21 只BALB/cAnu/nu 小鼠(6~8 周)購(gòu)自上海華源生物公司。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)和A549 肺癌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型收藏物保藏中心。HMEC-1 細(xì)胞在含2 mmol/L 谷氨酰胺、10 ng/ml 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)、15% FBS 和抗生素(100 u/ml 青霉素,100 μg/ml 鏈霉素)的DEME 培養(yǎng)基中培養(yǎng),A549 肺癌細(xì)胞在含10% FBS 和抗生素(100 u/ml 青霉素,100 μg/ml鏈霉素)的RIPM 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在5%CO2潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

    1.2 主要試劑及儀器

    1.2.1 主要試劑胎牛血清購(gòu)自浙江擎科生物技術(shù)公司,DEME 培養(yǎng)基、RIPM1640 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司,TW-37 購(gòu)自上海百奧萊博生物技術(shù)公司,血管生成檢測(cè)試劑盒、Transwell 小室和MTT 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自泉州市睿信生物科技有限公司,Caspase-3/7 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司,Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司,M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司,EGF 和VEGF 一抗購(gòu)自上海Prime Gene 公司,VEGFR2 一抗購(gòu)自上海百奧萊博生物科技有限公司,HIF-1α 和ERK 一抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司,CD31 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司,Ki67 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司,VEGF 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

    1.2.2 主要儀器BX51 型顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司,F(xiàn)ACSCalibur?型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司,Applied Biosystems ViiA?7 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)測(cè)定將受精卵在37℃、45%濕度下孵育。第7 天緩慢、輕輕地用砂輪磨除頂部蛋殼,并將該區(qū)域剝落,暴露出絨毛尿囊膜。分別用含0 μg/卵、50 μg/卵、100 μg/卵和150 μg/卵的TW-37鹽水浸泡濾紙(0.5 cm×0.5 cm),然后放在CAM 上,用無(wú)菌透明膠帶封閉后孵育3 d。每組10 個(gè)卵,使用甲醇和丙酮(1∶1)固定后通過(guò)顯微鏡拍攝CAM。

    1.3.2 血管生成試驗(yàn)將冷的基質(zhì)膠按50 μl/孔涂在96 孔板上,并在37℃條件下孵育以固化基質(zhì)膠。將HMEC-1 細(xì)胞按5×104個(gè)/孔的密度接種到基質(zhì)膠上,使用不同劑量(0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)TW-37 處理2 h 后在37℃條件下孵育過(guò)夜。將HMEC-1 細(xì)胞接種在含或不含VEGF (100 ng/ml) 和TW-37 (8 μmol/L) 的 生 長(zhǎng)因子還原基質(zhì)膠上,孵育12 h。用顯微鏡拍攝并記錄毛細(xì)管生成情況。

    1.3.3 細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定①細(xì)胞遷移測(cè)定:將HMEC-1 細(xì)胞按1.5×105個(gè)/孔接種在含不同劑量TW-37(0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L)的100 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基中。下腔室包含相同的培養(yǎng)基,含15% FBS。溫育8 h 后,將遷移的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色,并用棉簽清潔膜的上表面以除去未遷移的細(xì)胞,拍照并記錄遷移的細(xì)胞。②細(xì)胞侵襲測(cè)定:將基質(zhì)膠解凍并在無(wú)血清冷培養(yǎng)基中稀釋至5 mg/ml,將80 μl 稀釋的基質(zhì)膠添加到上腔室中。在37℃條件下孵育5 h,將凝膠狀的Matrigel 用溫和的無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕洗滌。后續(xù)步驟與細(xì)胞遷移測(cè)定相同。孵育24 h 后進(jìn)行固定和染色,拍照并記錄侵襲細(xì)胞。

    1.3.4 MTT 增殖測(cè)定用8 μmol/L TW-37(TW-37組)或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(對(duì)照組)處理HMEC-1 細(xì)胞4 h。將細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種在96 孔培養(yǎng)板上,室溫孵育24 h,每孔添加50 μl MTT 測(cè)試溶液,使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量并記錄吸光度值,拍照并記錄增殖細(xì)胞。

    1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)用胰蛋白酶消化TW-37 組和對(duì)照組HMEC-1 細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明書(shū),使用Muse?Annexin V、Cell Cycle 和Caspase-3/7 試劑盒制備樣品,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

    1.3.6 免疫熒光染色將TW-37 組和對(duì)照組HMEC-1 細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定15 min,0.3%Triton Ⅹ-100滲透并用5% BSA在PBS中封閉1 h,用鬼筆環(huán)肽染色以可視化F-肌動(dòng)蛋白絲,細(xì)胞室溫孵育1h,用DAPI 復(fù)染色30 h,在熒光顯微鏡下分析顯微照片。

    1.3.7 qRT-PCRTW-37組、對(duì)照組HMEC-1細(xì)胞培養(yǎng)6 h、12 h 和24h。采用Trizol 試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶從2 μg總RNA中合成互補(bǔ)DNA。使用SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng),qRT-PCR 反應(yīng)條件:95℃變性30 s,然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán),95℃變性3 s,57℃退火和延伸30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.3.8 蛋白免疫印跡法用裂解緩沖液溶解HMEC-1 細(xì)胞。蛋白樣品通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將印跡與EGF 一抗(1∶500)、VEGF 一抗(1∶500)、HIF-1α 一抗(1∶500)、ERK 一抗(1∶500)在4℃孵育過(guò)夜。與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠二抗(1∶100)室溫孵育2 h 后,使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行信號(hào)檢測(cè),以GAPDH 為內(nèi)參,使用Image J 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化和歸一化。

    1.3.9 異種移植模型與免疫組織化學(xué)染色皮下注射A549 癌細(xì)胞(5×106個(gè)/只)到BALB/cAnu/nu 小鼠中,異種移植動(dòng)物分別經(jīng)尾靜脈注射鹽水或不同劑量的TW-37(0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg),1 次/d,每組7 只。治療第27 天,處死小鼠,稱重并拍照。收集并切除腫瘤,4%中性多聚甲醛固定,對(duì)羥基苯甲酸酯包埋,切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。采用CD31 抗體免疫染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞,Ki67 抗體染色確定細(xì)胞增殖,VEGF 抗體染色顯示VEGF 表達(dá)。使用Image Pro Plus 軟件對(duì)切片進(jìn)行半定量圖像分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或方差分析,方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TW-37 抑制血管新生及HMEC-1 細(xì)胞的遷移和侵襲

    與對(duì)照組相比,TW-37 組以劑量依賴的方式降低微血管密度(見(jiàn)圖1A),削弱HMEC-1 細(xì)胞生成毛細(xì)血管的能力(見(jiàn)圖1B),同時(shí)以劑量依賴的方式抑制HMEC-1 細(xì)胞的遷移(見(jiàn)圖1C)和侵襲(見(jiàn)圖1D)。

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,對(duì)照組細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白以線性模式規(guī)則組裝,并基本上以平行的方式穿過(guò);而TW-37 組細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白變?yōu)榉稚⑿?,?yīng)力纖維處于混亂狀態(tài)或部分消失,表明TW-37 可引起HMEC-1 細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白解聚。見(jiàn)圖2。

    圖1 TW-37在體內(nèi)外抑制血管生成及HMEC-1細(xì)胞的遷移和侵襲

    圖2 TW-37對(duì)F-肌動(dòng)蛋白分布的影響(×200)

    2.2 TW-37抑制VEGF誘導(dǎo)的體外血管生成

    與對(duì)照組相比,100 ng/ml VEGF可誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞生成毛細(xì)血管。而再加入TW-37 后,可明顯抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。見(jiàn)圖3。

    2.3 TW-37抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

    TW-37 組與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率、增殖率、侵襲情況比較,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組與TW-37組G1期、S期細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖4~6。

    表2 兩組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及細(xì)胞周期分析 (±s)

    表2 兩組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及細(xì)胞周期分析 (±s)

    /(個(gè)/Hp)細(xì)胞周期/(個(gè)/Hp)G1期S期±0.12 1.00±0.06 1.00±0.08±0.03 2.56±0.28 0.65±0.09 926 8.391 9.103 P 值0.001 0.013 0.024 0.028 0.016

    圖4 各組流式細(xì)胞圖

    圖5 TW-37抑制細(xì)胞增殖 (×100)

    圖6 TW-37抑制細(xì)胞遷移 (×100)

    2.4 TW-37抑制VEGF和ERK的激活

    對(duì)照組與不同時(shí)間點(diǎn)TW-37 組的VEGF、ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組和不同時(shí)間點(diǎn)TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,不同時(shí)間點(diǎn)TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05)。見(jiàn)表3 和圖7。

    對(duì)照組與不同質(zhì)量濃度TW-37 組的VEGF、ERK 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組的p-VEGF、p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,不同質(zhì)量濃度TW-37 組的p-VEGF、p-ERK 蛋白相對(duì)表達(dá)量較低(P<0.05)。見(jiàn)表4 和圖8。

    表3 對(duì)照組與8 μmol/L TW-37組處理不同時(shí)間后細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    表3 對(duì)照組與8 μmol/L TW-37組處理不同時(shí)間后細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    注:?與對(duì)照組比較,P<0.05。

    組別p-VEGF VEGF p-ERK ERK對(duì)照組TW-37組6 h 12 h 24 h 0.63±0.08?0.54±0.06?0.39±0.01?0.61±0.07?0.47±0.07?0.45±0.03?0.99±0.11 0.91±0.08 0.86±0.11 0.93±0.12 1.09±0.08 1.12±0.17 F 值P 值1.00±0.12 1.00±0.08 1.00±0.10 1.00±0.09 29.229 0.000 45.717 0.000 1.097 0.374 2.519 0.135

    表4 對(duì)照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    表4 對(duì)照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    注:?與對(duì)照組比較,P<0.05。

    組別p-VEGF VEGF p-ERK ERK對(duì)照組TW-37組4 μmol/L 6 μmol/L 8 μmol/L 0.62±0.04?0.52±0.01?0.41±0.03?0.53±0.02?0.47±0.01?0.39±0.03?0.82±0.03 0.92±0.07 0.79±0.08 1.11±0.09 0.99±0.11 1.26±0.13 F 值P 值1.00±0.15 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.09 31.802 0.000 80.222 0.000 4.558 0.053 1.879 0.208

    2.5 TW-37下調(diào)VEGF及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

    圖7 對(duì)照組與TW-37組(8 μmol/L)處理不同時(shí)間后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

    對(duì)照組與TW-37 組HIF-1α、AP-1 及AP-2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TW-37組低于對(duì)照組。見(jiàn)表5和圖9。

    圖8 對(duì)照組與不同質(zhì)量濃度TW-37組處理12 h后細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

    圖9 TW-37下調(diào)HMEC-1細(xì)胞中VEGF及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

    表5 各組HIF-1α、AP-1及AP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    表5 各組HIF-1α、AP-1及AP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    組別HIF-1α AP-1 AP-2對(duì)照組TW-37組t 值P 值1.00±0.09 0.37±0.01 12.970 0.000 1.00±0.12 0.42±0.02 11.081 0.000 1.00±0.11 0.61±0.02 8.991 0.009

    2.6 TW-37在體內(nèi)阻礙腫瘤生長(zhǎng)和血管生成

    對(duì)照組與TW-37 組(0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg)小鼠的腫瘤體積、增殖標(biāo)志物Ki67 和微血管密度標(biāo)志物CD31 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,TW-37 組(0.5 mg/kg 和10.0 mg/kg)腫瘤體積、Ki67 和CD31 均較低(P<0.05); 與TW-37 組(0.5 mg/kg)比較,TW-37 組(10.0 mg/kg)腫瘤體積、Ki67 和CD31 均較低(P<0.05)。3 組小鼠的VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6 和圖10~12。

    表6 對(duì)照組與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TW-37組小鼠的腫瘤體積、Ki67、CD31、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    表6 對(duì)照組與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TW-37組小鼠的腫瘤體積、Ki67、CD31、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

    注:?與對(duì)照組比較,P<0.05。

    組別腫瘤體積/mm3 Ki67 CD31 VEGF對(duì)照組TW-37組0.5 mg/kg 10.0 mg/kg F 值P 值600±132 1.00±0.13 1.00±0.09 1.00±0.18 387±72?326±43?53.307 0.000 0.66±0.03?0.24±0.01?51.897 0.000 0.69±0.05?0.37±0.01?184.002 0.000 0.92±0.08 0.98±0.23 1.191 0.311

    圖10 各組小鼠背側(cè)接種A549細(xì)胞27 d后的腫瘤

    圖11 TW-37在體內(nèi)阻礙腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成(免疫組織化學(xué)染色×200)

    圖12 小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)

    3 討論

    肺癌是最具侵襲性的癌癥之一,預(yù)后很差。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示,在中國(guó)每年有33 000 例患者死于肺癌[10]。絕大多數(shù)患者出現(xiàn)大轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移,需要有效的藥物治療。然而,現(xiàn)有的常規(guī)化學(xué)治療與手術(shù)切除難以滿足臨床需求,迫切需要新的治療方法[11-12]。在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中血管的新生至關(guān)重要,新生血管通過(guò)為腫瘤組織供血、供氧及傳輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而干擾血管生成為一種有效的抗腫瘤治療策略[13]。

    在腫瘤誘導(dǎo)的血管生成早期,大量的VEGF 從癌細(xì)胞中釋放出來(lái),然后與內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF 2型受體(VEGFR2) 結(jié)合,從而激活下游效應(yīng)因子,促進(jìn)血管新生。研究指出,生長(zhǎng)因子通過(guò)與VEGFR2 受體結(jié)合,誘導(dǎo)其磷酸化和二聚化,從而導(dǎo)致下游信號(hào)通路激活,促進(jìn)血管生成[14]。而VEGFR2 的負(fù)調(diào)節(jié)對(duì)于抑制血管生成,包括腫瘤新血管生成具有重要意義,被認(rèn)為是限制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要靶點(diǎn),在血管生成中起關(guān)鍵作用[15]。因此,靶向VEGF 及其受體是一種有效的抗腫瘤治療策略。而本研究結(jié)果表明,VEGF 可以促進(jìn)HMEC-1 細(xì)胞生成毛細(xì)血管,而TW-37 能夠抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。

    VEGF 的表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,包括HIF-1α、AP-1、AP-2、SP-1 和STAT3[16]。HIF-1α是一種異型二聚體反式激活因子,是控制VEGF 表達(dá)和分泌的主要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)涉及血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)[17-18]。HIF-1 由α 和β亞基組成,HIF-1α 是在常氧條件下限制VEGF基因轉(zhuǎn)錄速率的限制性亞基[19-22]。此外,有研究指出,Bcl-2 通過(guò)Raf-1/MEKK-1 介導(dǎo)的IKKβ 活化的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[22-25]。本研究中蛋白免疫印跡法和qRT-PCR 反應(yīng)結(jié)果顯示,TW-37 能夠通過(guò)抑制VEGFR2 和ERK 的磷酸化激活,下調(diào)VEGF 轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α、AP-1 和AP-2 的轉(zhuǎn)錄水平,抑制HIF-1α 蛋白的表達(dá),進(jìn)而抑制VEGF 誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。此外,本研究結(jié)果顯示,TW-37 通過(guò)靶向ERK 抑制HIF-1α 的表達(dá),從而下調(diào)VEGF 水平,抑制HMEC-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮其對(duì)血管生成的抑制作用,提示ERK/MAPK 信號(hào)通路對(duì)毛細(xì)血管生成有重要意義。而細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,TW-37可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的克隆形成能力;其次,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明TW-37 可以抑制腫瘤進(jìn)展,并抑制血管生成,表現(xiàn)為微血管密度標(biāo)志物CD31 的表達(dá)下調(diào);最后,對(duì)照組與TW-37 組大鼠的VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異,可能是因?yàn)門W-37 在體內(nèi)多為抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能,而未影響腫瘤細(xì)胞的功能。

    綜上所述,TW-37 可以通過(guò)靶向ERK,抑制包括HIF-1α 在內(nèi)的VEGF 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),從而下調(diào)VEGF 水平,抑制HMEC-1 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮其對(duì)血管生成的抑制作用,并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡,抑制肺癌細(xì)胞的增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用。

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