• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鹽酸氯丙嗪對八肋游仆蟲中心蛋白C端功能的抑制

    2021-02-24 00:48:38葉旭文王文明趙亞琴楊斌盛
    無機化學學報 2021年1期
    關鍵詞:凝膠電泳殘基復合物

    董 倩 葉旭文 楊 靜 王文明 趙亞琴 楊斌盛

    (山西大學分子科學研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006)

    中心蛋白是首次在單細胞綠藻中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的鈣離子結合蛋白,屬于鈣調蛋白家族[1]。它廣泛存在于真核生物中,如酵母[2]、無脊椎動物[3]、高等植物[4]、哺乳動物[5]等,是很多生物的中心體重要組成部分,在細胞分裂過程中起著重要作用。中心蛋白含有4個EF-手結構域,每個EF-手結構域可以結合一個鈣離子。當?shù)鞍捉Y合鈣離子后,蛋白構象變得更加開放,疏水區(qū)暴露,有利于蛋白和靶肽之間的結合[6]。Tb3+具有與Ca2+相似的配位化學性質,但是其與蛋白質結合后出現(xiàn)明顯的熒光敏化。因此常常被用作Ca2+結合蛋白的離子探針[7]。

    八肋游仆蟲中心蛋白由168個氨基酸殘基組成,其分子量約為20 kD。本實驗室使用Tb3+熒光探針、蛋白質片段等多種方法研究表明,生理條件下每個蛋白質分子可結合4個Ca2+,Tb3+與Ca2+占據(jù)相同的結合位點,Ⅲ、Ⅳ位點屬于蛋白和金屬離子結合的高親和位點;蛋白與金屬離子結合后使得蛋白質從封閉狀態(tài)到開放狀態(tài),從而導致疏水表面暴露,蛋白質聚集;八肋游仆蟲中心蛋白的N端在金屬離子介導的聚集過程中扮演了重要的角色[8],而與靶肽的結合完全發(fā)生于C端[9];中心蛋白還可以參與核苷酸切除修復[10]。

    鹽酸氯丙嗪(CPZ)是一種吩噻嗪類臨床藥物[11],其分子結構如圖1所示。它主要作為抗組胺藥和安定劑使用,是一種具有多種作用的通用型抗精神病藥。其一個重要特征是可以在不損傷人的大腦意識的情況下控制過度興奮和狂躁,改變精神病患者的異常行為。小劑量的CPZ也可以緩解嘔吐,對于鎮(zhèn)定、降溫和抗休克效果明顯。此外,在生物醫(yī)學研究中CPZ常被用作為鈣調蛋白抑制劑[12],可以與鈣調蛋白結合,從而抑制鈣調蛋白的功能。本實驗室曾報道另一種吩噻嗪類臨床藥物——三氟拉嗪與八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子的結合及對蛋白質功能的影響[13]。本文報道CPZ與八肋游仆蟲中心蛋白C端半分子的結合及對蛋白質功能的影響,深入了解其在分子水平上的相互作用,有助于理解藥物結合的熱力學和機制,可以為醫(yī)學研究做出一定的貢獻。

    圖1 鹽酸氯丙嗪的結構Fig.1 Structure of chlorpromazine

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    GST親和層析柱材料(Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow)來自GE Healthcare,N-2-羥乙基哌嗪-N'-乙磺酸(Hepes分析純)、CPZ均來自Sigma公司,氯化鉀(>99%)、Tris(>99.9%)、甘氨酸(>99.5%)、Acrylamide(>99.9%)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、bis-acrylamide(純度大于 99.0%)均來自上海生工,乙二胺四乙酸鈉(EDTA)來自索萊寶,過硫酸銨(分析純)來自北京化工廠。

    所用儀器有:Eppendorf移液槍、THZ-C搖床(江蘇太倉實驗設備廠)、KS-600超聲波粉碎機(寧波儀器廠)、TGL-16臺式高速冷凍離心機(湖南儀器總廠)、F-2700型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)、F-2700型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)、Chirascan圓二色光譜儀(Applied Photophysics有限公司)、Malvern ITC200等溫滴定微量熱儀、Cary Varian Eclipse紫外分光光譜儀、METTLER TOLEDO Five easy plus pH計、DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳和DYY-10C型雙穩(wěn)時電泳儀(北京市六一儀器廠)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 儲備液的配制

    Tb3+儲備液的配制參照文獻[14]進行。

    CPZ溶液的配制:準確稱取0.177 7 g的CPZ加入1 mL的 Hepes溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,攪拌均勻至溶解,配制成0.5 mmol·L-1的CPZ溶液,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    pBR322 DNA儲備液的配制:在無菌環(huán)境下用移液槍取一定量的pBR322 DNA(濃度為0.5 μg·μL-1),用無菌水稀釋至所需濃度,并將其分裝儲備于-20℃下。

    1.2.2 熒光光譜分析

    CPZ和apoC-EoCen作用的熒光通過熒光光譜儀測定[15]。隔3 min掃描1次,記錄保存相關數(shù)據(jù)。同樣可以測定Tb3+的敏化熒光光譜。

    1.2.3 等溫滴定量熱分析

    apoC-EoCen與CPZ結合的熱力學常數(shù)通過等溫量熱分析得到,實驗在30℃下進行[16]。apoCEoCen 濃度為 0.08 mmol·L-1,CPZ 濃度為 4 mmol·L-1,分別將其置于樣品池及注射器中。

    1.2.4 CD色譜的測定

    通過Biologic Mos型CD光譜儀測定圓二色光譜(CD),掃描范圍為190~260 nm,樣品均溶解于Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中[17]。所有實驗均在室溫下進行,掃描3次取平均值,扣除稀釋效應。

    1.2.5 共振光散射測定

    共振光散射(RLS)通過掃描同步熒光光譜實現(xiàn)。設定激發(fā)波長為250 nm,掃描范圍為250~600 nm,電壓為400 V,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。取1 mL apoC-EoCen和不同濃度的CPZ混合溶液于1 cm的比色皿中,apoC-EoCen 濃度為10 μmol·L-1,然后加入 1 mmol·L-1的 Tb3+,每次加 2 μL,隔 3 min 掃描 1次,最終結果為3次掃描結果的平均值。

    1.2.6 apoC-EoCen的磷酸化修飾

    將 apoC-EoCen(0.1 mmol·L-1)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA,0.1 mmol·L-1)、Mg2+(0.132 mol·L-1)、ATPNa2(1.01 mmol·L-1)均溶解于 Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中,分別加入 0、5、10、30、50倍的CPZ,置于恒溫水浴(30 ℃)反應10 h,得到磷酸化蛋白(P-apoC-EoCen)。利用PD-10脫鹽柱將多余的金屬離子和ATP等洗脫。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測蛋白的電遷移率[18]。

    1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳

    將提前制備好的apoC-EoCen和XPC混合樣品放置于4℃過夜反應,apoC-EoCen的電遷移率在室溫下用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,電泳時間約3 h完成,用考馬斯亮藍R-250染色,然后用乙醇或冰乙酸脫色后在紫外可見透射反射儀中觀察。

    1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳分析

    pBR322 DNA、apoC-EoCen和CPZ按一定比例混合,在4℃反應約3 h,通過瓊脂糖凝膠電泳實驗研究apoC-EoCen、CPZ和pBR322 DNA三者之間的相互作用。實驗結果置于紫外可見透射反射儀下進行觀察[13]。

    1.2.9 分子對接

    apoC-HsCen 2與apoC-EoCen的序列同源性高達71.8%,與鈣調蛋白的同源性也在50%以上[19]。如此高的同源性使得它們之間的生物功能基本相似,因此我們選擇apoC-HsCen 2(PDB∶2GGM)的結構作為模板,利用自動對接軟件Discovery Studio 3.0(DS)對小分子CPZ與C端半分子之間的結合位點和結合模式進行模擬,找到最優(yōu)結合位點,即能量最低位點[20]。這種研究方法的優(yōu)點在于在實驗基礎上可以直觀地看到兩者之間的結合狀態(tài)。

    2 結果與討論

    2.1 CPZ與apoC-EoCen的結合

    2.1.1 熒光光譜

    圖 2A 是在 pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖條件下,用CPZ滴定apoC-EoCen的熒光光譜。從圖2A可以看出,308 nm處是apoC-EoCen的最大熒光發(fā)射峰。隨著CPZ滴加到apoC-EoCen溶液中,可以看到位于308 nm處的C端半分子蛋白熒光強度逐漸下降,而在355和452 nm處出現(xiàn)了CPZ的2個特征熒光峰,并在335 nm處出現(xiàn)了等熒光點。表明CPZ與apoC-EoCen結合生成了復合物。

    將apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度對cCPZ/capoC-EoCen作圖,得到圖2B。從圖2B可以看出,apoCEoCen在308 nm處的熒光強度隨著cCPZ/capoC-EoCen的增大而逐漸減小。利用CPZ與apoC-EoCen反應形成apoC-EoCen-CPZ復合物的平衡方程,可將熒光強度與反應表觀結合常數(shù)、結合位點數(shù)建立式1所示方程:

    圖 2 (A)CPZ(2.5 mmol·L-1)的加入對apoC-EoCen(10 μmol·L-1,1 mL)熒光光譜的影響;(B)隨 cCPZ/capoC-EoCen變化的熒光強度(308 nm)滴定曲線,以及CPZ滴定apoC-EoCen的擬合曲線Fig.2 (A)Fluorescence spectra produced by addition of CPZ(2.5 mmol·L-1)to 1 mL apoC-EoCen(10 μmol·L-1);(B)Titration curve of fluorescent intensity at 308 nm against concentration ratio of CPZ and apoC-EoCen

    其中F0為apoC-EoCen在308 nm處的初始熒光強度;F為任一滴定點的熒光強度;F∞為CPZ與apoCEoCen完全結合后apoC-EoCen在308 nm處的熒光強度;K為CPZ與apoC-EoCen結合的條件結合常數(shù);n為apoC-EoCen的CPZ結合位點數(shù);cCPZ,f為任一滴定點時CPZ的游離濃度。根據(jù)文獻[21],使用CPZ的總濃度代替CPZ的游離濃度,由式1用lg[(F0-F)/(FF∞)]對 lgcCPZ,f作圖可得近似的K和n(圖 2B,Inset)。CPZ與apoC-EoCen的結合比為1∶1,結合常數(shù)為(1.91±0.04)×104L·mol-1(Supporting information)。

    2.1.2 等溫滴定量熱分析

    為了進一步研究CPZ和apoC-EoCen之間的相互作用,我們選用等溫量熱滴定進行分析。圖3為室溫下在 Hepes緩沖溶液(10 mmol·L-1,pH=7.4)中CPZ滴定apoC-EoCen的等溫量熱滴定曲線。通過單位點結合模型擬合,獲得結合常數(shù)為(1.12±0.15)×104L·mol-1,apoC-EoCen有1個CPZ的結合位點,與前面的熒光滴定結果一致。熱力學參數(shù)列于表1,可以看出熵是正數(shù)、焓是負數(shù)、吉布斯自由能是負數(shù),表明CPZ和apoC-EoCen反應的過程是焓熵共同驅動的自發(fā)放熱反應,它們之間反應的主要作用力是靜電作用[22]。

    2.1.3 CD光譜分析

    在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖溶液下測得的apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復合物的遠紫外圓二色譜如圖4所示。由圖4可見,apoC-EoCen的CD光譜在208和222 nm附近出現(xiàn)了2個負吸收峰,這是中心蛋白由α螺旋結構組成的2個特征峰。加入10倍的CPZ并形成apoC-EoCen-CPZ復合物后,2個峰的負吸收減少,中心蛋白的α螺旋含量降低了約40%,說明鈣調蛋白抑制劑CPZ的結合,對中心蛋白的二級結構產生了影響,導致α螺旋部分解旋,橢圓率降低。

    圖3 25 ℃下CPZ(3 mmol·L-1)對apoC-EoCen(0.08 mmol·L-1)的等溫量熱滴定曲線Fig.3 Calorimetric titration curve of CPZ(3 mmol·L-1)to apoC-EoCen(0.08 mmol·L-1)at 25 ℃

    圖4 apoC-EoCen和apoC-EoCen-CPZ復合物在水中的遠紫外CD光譜Fig.4 Far-UV CD spectra of apoC-EoCen and apoCEoCen-CPZ complex in aqueous solution

    表1 25℃下通過ITC和熒光光譜測量CPZ與apoC-EoCen結合的熱力學數(shù)據(jù)Table 1 Thermodynamics data of CPZ binding with apoC-EoCen measured by ITC and fluorescence spectrometry at 25℃

    2.1.4 CPZ與apoC-EoCen之間的福斯特共振能量轉移及分子模擬

    根據(jù)福斯特非輻射能量轉移理論[23],能量供體和受體發(fā)生能量轉移的條件有2個:一是供體的熒光發(fā)射光譜和受體的紫外吸收光譜存在著一定的重疊;二是供體和受體之間的距離r<7 nm,二者不可缺一。圖5A為室溫下在290~355 nm范圍內供體apoC-EoCen的熒光發(fā)射光譜和受體CPZ的紫外吸收光譜的光譜重疊。由此計算得到光譜重疊積分J為 2.69×10-15cm6,已知K2=2/3,n=1.336,Φ=0.14[24],由此得到福斯特臨界能量轉移距離R0為2 nm,能量轉移效率E=0.91,進一步計算得到能量供體apoCEoCen的168位酪氨酸殘基和受體CPZ之間的距離r為 1.36 nm(Supporting information)。0.5R0<r<1.5R0,證明蛋白供體和CPZ之間發(fā)生了無輻射能量轉移。

    在實驗測定的基礎上,通過自動對接軟件Discovery Studio 3.0可以更加直觀地看到CPZ與apoCEoCen之間的結合位點以及結合模式。圖5B是最小結合能為-36.88 kJ·mol-1時對應的結構。如圖5B所示,CPZ的吩噻嗪環(huán)和第4個EF-hand結構域的F螺旋上的168位酪氨酸殘基芳環(huán)之間的距離是1.38 nm,與福斯特能量轉移得到的結果吻合。仔細分析CPZ與apoC-EoCen之間結合的驅動力可知其分為2種:(1)靜電作用,質子化的吩噻嗪與去質子化的E144間的作用。(2)疏水作用,CPZ與F109、L122、M141、I142、F145、I153、I161、T165、M162、S166間的作用。除F109和L122分別位于第3個EF-hand結構域的E和Fα-螺旋之外,其它10個氨基酸殘基均位于第4個EF-hand結構域,其中9個氨基酸殘基分別位于第4個EF-hand結構域的E和Fα-螺旋,I153是唯一位于loop區(qū)的氨基酸殘基。

    圖5 (A)apoC-EoCen熒光光譜(a)和CPZ吸收光譜的重疊(b);(B)apoC-EoCen和CPZ的分子對接圖Fig.5 (A)Overlap of apoC-EoCen fluorescence spectrum(a)and CPZ absorption spectrum(b);(B)Molecular docking between apoC-EoCen and CPZ

    2.2 CPZ對apoC-EoCen功能的抑制

    2.2.1 對Tb3+結合的影響

    八肋游仆蟲中心蛋白不含色氨酸殘基,含有4個酪氨酸殘基Y46、Y72、Y79和Y168,分別位于第Ⅰ、Ⅱ結構域和蛋白質的末端。因此,當Tb3+與蛋白質結合時,占據(jù)Ⅲ和Ⅳ結合位點(高親和位點)的Tb3+出現(xiàn)弱熒光敏化,而占據(jù)Ⅰ和Ⅱ結合位點(低親和位點)的Tb3+出現(xiàn)強熒光敏化[25]。由此得出八肋游仆蟲中心蛋白的4個金屬離子結合部位是不等價的,結合順序為Ⅳ≈Ⅲ>Ⅰ、Ⅱ[26]。C端半分子的酪氨酸殘基只有1個,當用Tb3+滴定時仍可觀測到在490、545、590和620 nm附近出現(xiàn)的Tb3+特征峰(圖6A)??梢?,隨著 Tb3+的不斷加入,其在 490、545、590 和620 nm處的特征峰熒光強度逐漸增大,直至不變。這表明Tb3+與apoC-EoCen結合后發(fā)生了Y168殘基與結合Tb3+間的非輻射能量轉移。將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖 6C 曲線 a),可以看出,cTb3+/capoC-EoCen<1.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加;在cTb3+/capoC-EoCen為1.0~2.0范圍內,盡管Tb3+在545 nm處熒光強度仍隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加,但增加幅度明顯減少;當cTb3+/capoC-EoCen>2.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen以2∶1的結合比結合。在Ⅲ和Ⅳ結構域分別引入色氨酸殘基的研究表明,Tb3+優(yōu)先占據(jù)蛋白質的第Ⅳ結合位點[27],即結合于第Ⅳ結合位點的Tb3+出現(xiàn)強熒光敏化,而結合于第Ⅲ結合位點的Tb3+出現(xiàn)弱熒光敏化。圖6B是在10倍CPZ存在的條件下,用Tb3+滴定apoC-EoCen的熒光光譜。同樣將545 nm處的熒光強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖6C曲線b)。由該曲線可得,當cTb3+/capoC-EoCen<1.0 時,Tb3+在545 nm處熒光強度隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而線性地增加;當cTb3+/capoC-EoCen>1.0時,Tb3+在545 nm處熒光強度不再隨著cTb3+/capoC-EoCen的增加而增加。表明Tb3+和apoC-EoCen-CPZ以1∶1的結合比結合,即CPZ與apoC-EoCen的結合導致Tb3+的1個結合部位被破壞。由圖6C曲線b的斜率及圖5B分子對接的CPZ作用部位可推斷,CPZ與apoC-EoCen的結合導致其第Ⅳ結合部位喪失Tb3+結合能力。

    根據(jù)式1擬合圖6C的Tb3+熒光敏化數(shù)據(jù)可得,在10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4的條件下,Tb3+與apoC-EoCen的結合位點數(shù)n為2.04±0.25,條件結合常數(shù)K為1.70×1016L2·mol-2;而Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結合位點數(shù)n為1.09±0.06,條件結合常數(shù)K為2.00×108L·mol-1(Supporting information),與Ⅲ和Ⅳ結構域分別引入色氨酸殘基后所測得的結合常數(shù)吻合[28]。

    圖6D是10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4條件下Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的CD光譜。可以看出,在10倍CPZ的存在下,位于208和220 nm處蛋白質的2個負吸收峰減少近40%,即CPZ的結合使蛋白質的分子結構發(fā)生改變,α螺旋含量降低。

    2.2.2 CPZ對apoC-EoCen聚集的影響

    圖6 在CPZ不存在(A)和存在(B)的情況下Tb3+敏化的熒光光譜;(C)在CPZ不存在(a)和存在(b)的情況下,Tb3+在545 nm處的熒光強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系;(D)Tb2-apoC-EoCen和Tb-apoC-EoCen-CPZ的遠紫外CD光譜Fig.6 Tb3+sensitized fluorescence spectra in the absence(A)and presence(B)of CPZ;(C)Fluorescence intensity of Tb3+at 545 nm as a function ofcTb3+/capoC-EoCenin the absence(a)and presence(b)of CPZ;(D)Far-UV CD spectra of Tb2-apoC-EoCen and Tb-apoC-EoCen-CPZ

    中心蛋白的生物功能之一是金屬離子結合誘導的蛋白質聚集[29]。盡管其聚集驅動力主要集中在N端,但是C端也有一定的聚集能力[30]。圖7A是在室溫、pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖溶液時,用Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜??梢?,隨著Tb3+的不斷加入,280 nm處的RLS強度逐漸增強。增大到某一點時,基本保持穩(wěn)定。將280 nm處的RLS強度對cTb3+/capoC-EoCen作圖(圖7B曲線a),可以發(fā)現(xiàn)類似于圖6的Tb3+敏化熒光滴定,Tb3+和apoC-EoCen以2∶1的結合比結合。由Tb3+滴定apoC-EoCen-CPZ的RLS光譜可得其滴定曲線如圖7B曲線b所示,即Tb3+與apoC-EoCen-CPZ的結合比為1∶1。根據(jù)式1擬合圖7B的Tb3+誘導RLS數(shù)據(jù)可得,在10 mmol·L-1Hepes、pH=7.4的條件下,Tb3+與apoC-EoCen的結合位點數(shù)n為1.95±0.10,條件結合常數(shù)K為1.15×1016L2·mol-2;而 Tb3+與 apoC-EoCen-CPZ 的結合位點數(shù)n為 1.00±0.06,條件結合常數(shù)K為 2.14×108L·mol-1(Supporting information),與Tb3+敏化熒光所得結果一致。

    圖7 (A)Tb3+滴定apoC-EoCen的RLS光譜;(B)在CPZ比例不同(cCPZ/capoC-EoCen=0(a),10(b))的情況下,RLS光譜在280 nm處的強度與cTb3+/capoC-EoCen的關系Fig.7 (A)RLS spectra of apoC-EoCen titrated with Tb3+;(B)RLS intensity at 280 nm as a function of cTb3+/capoC-EoCenin the presence of different proportions of CPZ:cCPZ/capoC-EoCen=0(a),10(b)

    2.2.3 CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的抑制

    2.2.3.1 apoC-EoCen的類核酸酶活性

    pBR322 DNA質粒是一種超螺旋型(Ⅰ)核酸大分子,能夠被一些具有切割活性的小分子、蛋白等切割成切口型(Ⅱ)以及線型(Ⅲ)。它們具有不同的遷移速率,其大小順序一般為超螺旋型>線型>缺刻型。圖8A為不同濃度的apoC-EoCen對pBR322 DNA切割的凝膠電泳圖。1~10號泳道為pBR322 DNA,2~10號泳道為分別加入2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、25 μmol·L-1apoC-EoCen后的pBR322 DNA。從圖8A中可以看出,最初DNA只有超螺旋一種形式,隨著apoC-EoCen濃度的增大,線型和缺刻型條帶逐漸變亮,而超螺旋DNA條帶慢慢變暗,即DNA逐漸由超螺旋狀態(tài)變?yōu)榫€型和缺刻型,直到超螺旋型完全消失。將圖8A中3種不同形式的DNA進行黑度掃描并對apoC-EoCen濃度作圖得到圖8B。從圖8B可以看出,當 apoC-EoCen 終濃度為 25 μmol·L-1時,pBR322 DNA完全由Ⅰ型轉變?yōu)棰蚝廷笮?。即apoC-EoCen像apoN-EoCen[31]一樣有類核酸酶活性。

    2.2.3.2 不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響

    圖9A是不同濃度CPZ對apoC-EoCen類核酸酶活性的影響。其中1~10號泳道為相同濃度的pBR322 DNA,2~10號泳道為加入終濃度為25 μmol·L-1的apoC-EoCen,3~10號泳道為含有不同濃度CPZ的apoC-EoCen類核酸酶活性,cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、15、20、25、30、40、50。由圖中可見,隨著CPZ濃度的增大,線型和切口型pBR322 DNA條帶逐漸由亮變暗,直到消失;而超螺旋型pBR322 DNA逐漸出現(xiàn),其條帶逐漸變亮。說明CPZ和apoCEoCen的結合抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性,阻礙了其對pBR322 DNA的切割,使得pBR322 DNA保存為最初的超螺旋形式。將圖9A中3種不同形式的pBR322 DNA進行黑度掃描并對cCPZ/capoC-EoCen作圖得到圖9B。從圖9B可以看出,開始蛋白將DNA切割成Ⅱ和Ⅲ型DNA,隨著CPZ濃度的增大,Ⅱ和Ⅲ型DNA均逐漸減少,Ⅰ型DNA逐漸增加;當加入20倍的CPZ時,Ⅲ型DNA基本消失;當加入50倍CPZ時,僅剩下Ⅰ型DNA。

    圖8 (A)apoC-EoCen切割pBR322 DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖;(B)不同構型DNA的比例與apoC-EoCen濃度的關系Fig.8 (A)Agarose gel electrophoresis for pBR322 DNA cutting with different concentrations of apoC-EoCen;(B)Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and apoC-EoCen concentration

    圖9 (A)CPZ對apoC-EoCen裂解DNA影響的瓊脂糖凝膠電泳圖;(B)不同構型DNA的比例隨cCPZ/capoC-EoCen變化的曲線Fig.9 (A)Agarose gel electrophoresis for effect with different proportions of CPZ on apoC-EoCen cleavaging DNA;(B)Relationship between proportion of different configurations pBR322 DNA and cCPZ/capoC-EoCen

    2.2.4 CPZ對apoC-EoCen與靶肽結合的抑制

    XPC是以人著色性干皮病C組蛋白中覆蓋中心蛋白結合序列的多肽,它參與許多細胞內生物分子反應。在 pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes緩沖條件下,XPC和apoC-EoCen可形成1∶1的復合物。圖10A是CPZ對apoC-EoCen-XPC復合物影響的天然凝膠電泳圖。其中1號泳道為apoC-EoCen,2號泳道為apoC-EoCen-XPC,3~10號泳道是cCPZ/capoC-EoCen分別為5、10、20、30、40、50、100、200時的apoC-EoCen-XPC。由圖10A可見,隨著CPZ濃度的增加,apoC-EoCen-XPC復合物逐漸減少,直到復合物全部消失,而apoC-EoCen條帶逐漸從無到有。這表明CPZ的結合抑制了apoC-EoCen-XPC復合物的形成。將圖10A中蛋白及其復合物進行黑度掃描并對cCPZ/capoC-EoCen作圖(圖 10B),其中曲線 a為 apoC-EoCen 隨CPZ濃度的變化,曲線b為apoC-EoCen-XPC隨CPZ濃度的變化。從圖10B可以看出,隨著CPZ濃度的增大,曲線a呈上升趨勢,曲線b呈下降趨勢,CPZ抑制了蛋白和XPC的結合,使得復合物含量逐漸下降。當加入50倍的CPZ時,apoC-EoCen和apoCEoCen-XPC復合物含量基本各占一半。

    圖10 (A)不同比例的CPZ加入apoC-EoCen和XPC中的天然凝膠電泳圖;(B)apoC-EoCen(a)和apoC-EoCen-XPC(b)隨cCPZ/capoC-EoCen的變化;(C)遠紫外CD光譜中CPZ對apoC-EoCen與XPC復合物的影響(a:apoC-EoCen;b:apoC-EoCen-XPC復合物;c:apoC-EoCen-XPC與CPZ共存);(D)apoC-EoCen與XPC或CPZ結合的緞帶模型Fig.10 (A)Non-denaturing gel electrophoresis diagram for effect of adding CPZ with different proportions to apoC-EoCen combined with XPC;(B)apoC-EoCen(a)and apoC-EoCen-XPC(b)changes with cCPZ/capoC-EoCen;(C)Far-UV CD spectra for effect of CPZ on apoC-EoCen binding to XPC(a:apoC-EoCen;b:apoC-EoCen-XPC complex;c:apoC-EoCen-XPC combined with CPZ);(D)Cartoon ribbon model structure of apoC-EoCen combined with XPC and CPZ

    中心蛋白C端結構域是其靶蛋白結合功能區(qū),許多靶肽如蜂毒素[32]、XPC[33]在溶液中處于隨機卷曲態(tài),當與中心蛋白結合后便形成α-螺旋結構。圖10C譜線a是apoC-EoCen的遠紫外CD光譜,可見在208和220 nm處出現(xiàn)蛋白質α-螺旋結構的特征峰;當apoC-EoCen與XPC結合形成apoC-EoCen-XPC復合物后,位于208和220nm處的2個特征負峰明顯增大(譜線 b),α-螺旋結構含量增加;CPZ 與 apoCEoCen結合導致蛋白質α-螺旋結構含量減少;圖10C譜線c是apoC-EoCen-XPC中加入10倍CPZ后的遠紫外CD光譜,可知apoC-EoCen的α螺旋含量減少約25%。這些結果表明CPZ的結合抑制了apoC-EoCen和XPC形成復合物。

    圖10D是apoC-EoCen和CPZ結合能量最低結構與apoC-EoCen-XPC晶體結構(PDB∶2GGM)的疊加圖。由圖10D可見,CPZ與XPC的N端占據(jù)apoCEoCen的同一結合部位,尤其是存在XPC的色氨酸殘基與apoC-EoCen間的疏水作用。因此,CPZ與apoC-EoCen-XPC的結合可看作配體的置換反應,CPZ將蛋白質結合的XPC置換。由此,可根據(jù)apoCEoCen-XPC的結合常數(shù)計算得到CPZ與apoC-EoCen間的結合常數(shù)為5.52×104L·mol-1(Supporting information),與其它方法所得數(shù)據(jù)吻合。

    2.2.5 CPZ對apoC-EoCen磷酸化的抑制

    蛋白質磷酸化是重要的生物化學反應過程,通過蛋白激酶的催化將ATP上的γ-磷酰基轉移到蛋白質底物的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)殘基上來實現(xiàn)中心蛋白的磷酸化[34]。根據(jù)我們實驗室之前的研究,蛋白激酶A(PKA)在apoC-EoCen上的磷酸化位點是Ser-166(KQTS)[35]。CPZ作為鈣調蛋白抑制劑,通過聚丙烯凝膠電泳實驗可以研究其是否對磷酸化蛋白質有影響。如圖11所示,apoC-EoCen終濃度為 100 μmol·L-1,1~6號泳道加 apoC-EoCen,2~6號泳道加磷酸化溶液混合物(Mg2+與ATP及PKA),3~6號泳道加不同濃度的CPZ,cCPZ/capoC-EoCen=5、10、30、50。蛋白質經(jīng)過磷酸化后條帶下移,當加入5倍和10倍的CPZ時,P-apoC-EoCen條帶沒有發(fā)生明顯變化,當加入30倍CPZ時,P-apoC-EoCen完全轉化為apoC-EoCen。說明CPZ的結合抑制了磷酸化蛋白質的形成,阻礙了蛋白質的磷酸化。

    圖11 CPZ對apoC-EoCen磷酸化影響的聚丙烯凝膠電泳圖Fig.11 Polypropylene gel electrophoresis diagram for effect of CPZ on apoC-Eocen phosphorylation

    3 結 論

    通過光譜分析、電泳、等溫量熱滴定、Tb3+熒光探針和分子對接等方法,在pH=7.4、10 mmol·L-1Hepes條件下,研究了鈣調蛋白抑制劑CPZ與apoCEoCen的相互作用。結果表明,CPZ與apoC-EoCen以1∶1結合比與apoC-EoCen的4個α-螺旋間的疏水區(qū)結合而形成復合物,條件結合常數(shù)約為104L·mol-1;apoC-EoCen具有類核酸酶活性,可將pBR322 DNA切割為切口型(Ⅱ)、線型(Ⅲ)DNA,而CPZ抑制了apoC-EoCen的類核酸酶活性;CPZ與apoC-EoCen的結合導致蛋白質第Ⅳ結構域的金屬離子結合能力喪失,進而抑制金屬離子結合誘導的聚集;CPZ通過疏水作用占據(jù)apoC-EoCen的靶肽結合部位而抑制其與XPC的結合;CPZ還抑制PKA對apoC-EoCen的磷酸化。多種實驗手段證明,CPZ是一種良好的中心蛋白生物功能阻斷劑,在以后的醫(yī)學研究中有著良好的應用前景。

    Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

    猜你喜歡
    凝膠電泳殘基復合物
    “PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定”實驗改進與優(yōu)化
    中學生物學(2024年4期)2024-01-01 00:00:00
    基于各向異性網(wǎng)絡模型研究δ阿片受體的動力學與關鍵殘基*
    BeXY、MgXY(X、Y=F、Cl、Br)與ClF3和ClOF3形成復合物的理論研究
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構體中的應用
    柚皮素磷脂復合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    黃芩苷-小檗堿復合物的形成規(guī)律
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:18
    蛋白質二級結構序列與殘基種類間關聯(lián)的分析
    擠壓添加耐高溫α—淀粉酶高粱輔料麥汁的蛋白質組分分析
    基于支持向量機的蛋白質相互作用界面熱點殘基預測
    4種核酸染料在實驗教學中的應用研究
    国产又黄又爽又无遮挡在线| av视频在线观看入口| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜a级毛片| 精品久久久久久久久av| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品久久电影中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲国产色片| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av在线亚洲专区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 高清毛片免费观看视频网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 黄色日韩在线| avwww免费| 日本爱情动作片www.在线观看 | 日韩精品中文字幕看吧| 日本色播在线视频| 日韩av在线大香蕉| 校园春色视频在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| eeuss影院久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美最黄视频在线播放免费| 我要搜黄色片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美潮喷喷水| 午夜福利在线在线| 亚洲av一区综合| 在线看三级毛片| 波多野结衣巨乳人妻| 91久久精品电影网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内精品宾馆在线| 久久久久国内视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精华一区二区三区| 亚洲av熟女| 一个人观看的视频www高清免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 嫩草影院精品99| a级毛色黄片| 18+在线观看网站| 久久久午夜欧美精品| 久久久精品94久久精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲精品国产成人久久av| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲性久久影院| 色在线成人网| 午夜亚洲福利在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 精品福利观看| 亚洲av美国av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人精品一区二区免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 黄色日韩在线| АⅤ资源中文在线天堂| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 尾随美女入室| 一区福利在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 日韩一区二区视频免费看| 久久热精品热| 精品免费久久久久久久清纯| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久久久久电影| 丰满乱子伦码专区| 中出人妻视频一区二区| 日本成人三级电影网站| 有码 亚洲区| 国产美女午夜福利| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲成人中文字幕在线播放| 在线观看午夜福利视频| 国产精品野战在线观看| 美女免费视频网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产 一区 欧美 日韩| 国产极品精品免费视频能看的| 长腿黑丝高跟| 秋霞在线观看毛片| 亚洲成av人片在线播放无| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 嫩草影院入口| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品宾馆在线| 久久精品国产亚洲网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 国语自产精品视频在线第100页| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产一区二区三区av在线 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲欧美清纯卡通| 一级av片app| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人亚洲欧美一区二区av| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 夜夜爽天天搞| 午夜福利成人在线免费观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 一级av片app| 欧美最新免费一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 欧美极品一区二区三区四区| 日本黄大片高清| 成年女人永久免费观看视频| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产伦在线观看视频一区| 美女免费视频网站| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜视频国产福利| 99久久精品热视频| 一级黄片播放器| 免费看光身美女| 国产成人91sexporn| 禁无遮挡网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品99久久久久久久久| 日韩三级伦理在线观看| 久久人人爽人人片av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看一区二区三区| 1024手机看黄色片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品国产清高在天天线| 韩国av在线不卡| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲内射少妇av| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品福利观看| 亚洲最大成人av| 一级av片app| 小说图片视频综合网站| 欧美色视频一区免费| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线 | 天堂影院成人在线观看| av在线观看视频网站免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲三级黄色毛片| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品人妻少妇| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| a级一级毛片免费在线观看| 美女大奶头视频| 亚洲欧美清纯卡通| 天天一区二区日本电影三级| 国产一区二区在线av高清观看| 韩国av在线不卡| 网址你懂的国产日韩在线| 天堂动漫精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人久久性| 综合色丁香网| 天堂网av新在线| 亚洲真实伦在线观看| 免费搜索国产男女视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 黑人高潮一二区| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 变态另类丝袜制服| 国产av一区在线观看免费| 男女啪啪激烈高潮av片| 在线观看午夜福利视频| 免费看光身美女| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利18| 免费观看的影片在线观看| 91在线观看av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲美女搞黄在线观看 | 91精品国产九色| 日本成人三级电影网站| а√天堂www在线а√下载| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本与韩国留学比较| 午夜老司机福利剧场| 在线国产一区二区在线| 天堂动漫精品| 99热这里只有精品一区| 亚洲av中文av极速乱| 性插视频无遮挡在线免费观看| 成人欧美大片| 国产精品免费一区二区三区在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| av在线播放精品| 中文字幕久久专区| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲人成网站高清观看| 美女免费视频网站| 久久久久性生活片| 91久久精品电影网| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av二区三区四区| 九九热线精品视视频播放| 级片在线观看| 午夜a级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 女同久久另类99精品国产91| 欧美激情在线99| 99久久精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 我的老师免费观看完整版| 69av精品久久久久久| 赤兔流量卡办理| 久久久成人免费电影| 国产视频内射| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品久久久久久久末码| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 99久国产av精品国产电影| 久久久久国产网址| 久久综合国产亚洲精品| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产精品不卡视频一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费观看的影片在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美性感艳星| 久久久久久久久中文| 亚洲av美国av| 乱码一卡2卡4卡精品| 精华霜和精华液先用哪个| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久亚洲国产成人精品v| 五月玫瑰六月丁香| 老女人水多毛片| 少妇丰满av| 久99久视频精品免费| av福利片在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩一区二区视频免费看| www.色视频.com| 91精品国产九色| 波多野结衣高清无吗| 久久九九热精品免费| 网址你懂的国产日韩在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品一及| 色av中文字幕| 色在线成人网| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜爱爱视频在线播放| 91久久精品电影网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美成人a在线观看| 国产免费男女视频| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美高清成人免费视频www| 国产欧美日韩精品亚洲av| 在线播放国产精品三级| 亚洲美女视频黄频| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 美女 人体艺术 gogo| 身体一侧抽搐| 日韩亚洲欧美综合| 1000部很黄的大片| 日本一二三区视频观看| 全区人妻精品视频| 日本一二三区视频观看| 免费观看在线日韩| 亚洲四区av| 亚洲成人av在线免费| 岛国在线免费视频观看| 亚洲最大成人中文| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产高清有码在线观看视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品,欧美在线| 成人av在线播放网站| 国产精品福利在线免费观看| 久久人人爽人人片av| 在线观看av片永久免费下载| 欧美xxxx性猛交bbbb| 12—13女人毛片做爰片一| 免费观看的影片在线观看| 亚洲成人av在线免费| 嫩草影院入口| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品久久久久久久末码| 小说图片视频综合网站| 俺也久久电影网| 一级黄色大片毛片| 丝袜美腿在线中文| 黄色一级大片看看| 丝袜美腿在线中文| 波野结衣二区三区在线| 日韩高清综合在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 午夜福利在线观看吧| 日韩精品中文字幕看吧| 欧美成人a在线观看| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩乱码在线| 亚洲性久久影院| 麻豆国产97在线/欧美| 中文字幕久久专区| 97在线视频观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品三级大全| 看片在线看免费视频| 精品久久久久久久久av| 亚洲中文日韩欧美视频| 深爱激情五月婷婷| 伊人久久精品亚洲午夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| 国产老妇女一区| 一级毛片我不卡| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 春色校园在线视频观看| 国产精品一区二区性色av| 久久午夜亚洲精品久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产乱人视频| 在线看三级毛片| 免费看a级黄色片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 久久99热6这里只有精品| 免费看a级黄色片| 成年免费大片在线观看| 久久国产乱子免费精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩中字成人| 直男gayav资源| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色尼玛亚洲综合影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产乱人偷精品视频| 国产精品一及| 联通29元200g的流量卡| 久久久精品94久久精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 成年版毛片免费区| 久久久久九九精品影院| 免费在线观看影片大全网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一级黄片播放器| 日本与韩国留学比较| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费黄网站久久成人精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 久久久精品94久久精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美在线一区亚洲| 国产熟女欧美一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| av天堂在线播放| 女人被狂操c到高潮| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品国产精品| 国产成年人精品一区二区| 国内精品久久久久精免费| 国产av不卡久久| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 熟女电影av网| 国产人妻一区二区三区在| 男女啪啪激烈高潮av片| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩制服骚丝袜av| 久久久精品大字幕| 中文字幕熟女人妻在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美三级亚洲精品| 亚洲成人久久爱视频| av在线观看视频网站免费| 国产精品久久久久久久久免| 香蕉av资源在线| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久久久午夜电影| 不卡视频在线观看欧美| 99riav亚洲国产免费| 1000部很黄的大片| 色视频www国产| 少妇丰满av| 老女人水多毛片| 床上黄色一级片| 中文资源天堂在线| av卡一久久| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜激情欧美在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 免费高清视频大片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 毛片一级片免费看久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲av美国av| 日韩欧美在线乱码| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文亚洲av片在线观看爽| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本五十路高清| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品一及| 日韩一区二区视频免费看| 深爱激情五月婷婷| 免费无遮挡裸体视频| 国产亚洲精品久久久com| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久99热6这里只有精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日日撸夜夜添| 国产av麻豆久久久久久久| 黄色视频,在线免费观看| 黄色配什么色好看| 午夜免费激情av| 日韩人妻高清精品专区| 嫩草影院入口| 九九在线视频观看精品| 51国产日韩欧美| 久久国产乱子免费精品| 国产高清三级在线| 激情 狠狠 欧美| 少妇高潮的动态图| 亚洲最大成人手机在线| 国产av在哪里看| 九九爱精品视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 欧美日本视频| 亚洲五月天丁香| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品456在线播放app| 免费av毛片视频| 日韩一区二区视频免费看| 天美传媒精品一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久精品夜色国产| 日韩精品有码人妻一区| 成人一区二区视频在线观看| av在线播放精品| 成年女人看的毛片在线观看| 少妇熟女欧美另类| www.色视频.com| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 两个人视频免费观看高清| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产中年淑女户外野战色| 成人国产麻豆网| 国产探花在线观看一区二区| а√天堂www在线а√下载| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av熟女| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品伦人一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 国产免费男女视频| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品无大码| 久久人妻av系列| 99九九线精品视频在线观看视频| 精品不卡国产一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 久久久成人免费电影| 波多野结衣巨乳人妻| 男女视频在线观看网站免费| 日韩av不卡免费在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 有码 亚洲区| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人aa在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日本一本二区三区精品| 超碰av人人做人人爽久久| 全区人妻精品视频| 欧美3d第一页| 黑人高潮一二区| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 久久久久国内视频| av在线观看视频网站免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 香蕉av资源在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 69人妻影院| 国产高潮美女av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成年女人永久免费观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 我的女老师完整版在线观看| 久久久久久久久久成人| 99在线视频只有这里精品首页| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线观看视频网站免费| av在线老鸭窝| 亚洲七黄色美女视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲美女搞黄在线观看 | 三级经典国产精品| 99热6这里只有精品| 亚洲综合色惰| 尾随美女入室| 国产精华一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜精品一区二区三区免费看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品一区二区性色av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 色综合站精品国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 色视频www国产| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲色图av天堂| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品色激情综合| 日本熟妇午夜| 国产麻豆成人av免费视频| 99热网站在线观看| 特级一级黄色大片| 麻豆成人午夜福利视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一本一本综合久久| 成人国产麻豆网| 欧美日本视频| 最近在线观看免费完整版| 最新中文字幕久久久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 色噜噜av男人的天堂激情| 18+在线观看网站| 国内精品宾馆在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲精品av在线| 禁无遮挡网站| avwww免费| 中文资源天堂在线| 最近在线观看免费完整版| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人性生交大片免费视频hd| 日日撸夜夜添| 少妇熟女aⅴ在线视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 深夜精品福利| 看十八女毛片水多多多| 色视频www国产| 麻豆国产97在线/欧美| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av电影不卡..在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产免费一级a男人的天堂|