苗藥定痛湯治療偏頭痛網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

黃 湲，吳遠華，蔡 靜，張東蘭，丁 維，劉時喜，董紅彥

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050200)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥理學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合，構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”網(wǎng)絡(luò)模型分析闡述藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)作用機制。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多途徑的特點，可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的研究方法，從生物分子層面多角度地對其作用機制進行探討。

苗藥定痛湯由大血藤(那嘎青)、川芎(銳猛擺)、白芷(加丟呦)、苕葉細(xì)辛(龔稅苕)、炙甘草、全蝎、蜈蚣(崗叩)7味藥組成，是我科邵勇主任基于苗醫(yī)理論創(chuàng)立的治療偏頭痛的方劑，臨床應(yīng)用多年、療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有抑炎、抗氧化功效，但是對于苗藥定痛湯主要的活性成分及其作用機制仍不明確。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度，對苗藥定痛湯治療偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制進行探索及研究，以期為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苗藥定痛湯活性成分收集 分別以大血藤、川芎、白芷、苕葉細(xì)辛、炙甘草、全蝎、蜈蚣為檢索詞，從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis，TCMSP)對上述藥物所有成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進行篩選和構(gòu)建。篩選條件：OB (%)≥30，DL≥0.18；搜索TCMIP數(shù)據(jù)庫獲得并整合藥物潛在活性成分和相應(yīng)靶標(biāo)信息，獲得苗藥定痛湯活性成分-靶點數(shù)據(jù)。

1.2 偏頭痛相關(guān)靶點 利用疾病在線數(shù)據(jù)庫TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://omim.org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)，以關(guān)鍵詞“migraine”進行檢索，獲取偏頭痛相關(guān)的基因。將TCMSP和以上3個疾病數(shù)據(jù)庫中所檢索到的靶點名與Uniprot在線資源數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進行聯(lián)合，采用R語言檢索分析，矯正靶點名稱，獲取優(yōu)選匹配度高者的相應(yīng)的基因。將矯正后苗藥定痛湯和偏頭痛基因進行整合，選取交集基因，即苗藥定痛湯潛在的治療靶點。

1.3 可視化藥材-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò) 將得到的苗藥定痛湯活性成分-作用靶點-偏頭痛治療靶點整合，導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中對干預(yù)網(wǎng)絡(luò)可視化，并且應(yīng)用Analyzer工具對網(wǎng)絡(luò)進行分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用在線數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)，以人為物種限定，篩選條件：相互作用閾值>0.9，導(dǎo)入苗藥定痛湯治療偏頭痛的交集基因，建立“苗藥定痛湯-migraine”靶標(biāo)間的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，保存PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)tsv文件并將其導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中，運用Analyzer工具進行優(yōu)化。

1.5 基因富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對潛在靶點進行GO功能分析。以P≤0.01為限定條件，運用Cytoscape_v3.8.0軟件中ClueGO插件進行KEGG通路富集分析，從基因生物功能和信號通路的角度進一步明確苗藥定痛湯對偏頭痛的作用機制，并為后續(xù)藥理學(xué)驗證提供參考。

2 結(jié) 果

2.1 苗藥定痛湯組方活性成分篩選 通過TCMSP檢索苗藥定痛湯5味藥物(大血藤、白芷、細(xì)辛、川芎、甘草)所有化學(xué)成分，大血藤5個，白芷22個，川芎7個，細(xì)辛8個，甘草92個。根據(jù)限定閾值OB≥30%、 DL≥0.18進行篩選，剔除重復(fù)后共得到107個活性成分，大血藤3個，白芷13個，川芎3個，甘草88個。

2.2 苗藥定痛湯治療偏頭痛直接作用靶點的篩選 將篩選的苗藥定痛湯活性成分作用靶點和3個數(shù)據(jù)庫中得到的2712個偏頭痛靶點進行交集分析，選取交集基因共69個，即表示為直接作用于偏頭痛的靶點。

2.3 苗藥定痛湯活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò) 整合苗藥定痛湯藥材、活性成分、疾病靶點，于Cytoscape_v3.8.0 中構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有176個節(jié)點，其中活性成分節(jié)點107個，靶點節(jié)點69個，綠色節(jié)點表示藥物活性成分，紅色節(jié)點代表藥物作用靶點。利用Cytoscape_v3.8.0中Network Analyzer插件計算網(wǎng)絡(luò)度值，根據(jù)Degree值排名最高的前五位中，以槲皮素(Quercetin)具有最多的潛在靶標(biāo)，其次是柚皮素(Naringenin)，山奈酚(Kaempferol)，異鼠李素(Isorhamnetin)，β-谷甾醇(Beta-sitosterol)，度值較高的藥物活性成分可能是苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛的活性組分，提示苗藥定痛湯多成分、多靶點的作用特點(圖1)。

圖1 苗藥定痛湯活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建和分析苗藥定痛湯與偏頭痛的PPI 為進一步探索定痛湯干預(yù)偏頭痛的潛在藥理機制，將69個定痛湯作用靶點和偏頭痛疾病相關(guān)靶點的交集基因?qū)朐诰€數(shù)據(jù)庫STRING中分析，以閾值>0.9為篩選條件，隱藏游離基因，得到一張包含56個節(jié)點，118條邊的PPI圖及相應(yīng)tsv文件。將得到的文件導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0 中對PPI網(wǎng)絡(luò)進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，其中SIRT1與FOXO3、NFKB、IL-6均存在相關(guān)性。統(tǒng)計顯示關(guān)聯(lián)度最高的前30個靶點(EGFR、RELA、ESR1、FOS、CCND1、IL6、NR3C1、MYC、CASP8、NOS3、PRKCA、SIRT1、APOB、AR、VEGFA、CYP1A1、ERBB2、GSK3B、IKBKB、CHRM2、FOXO3、HIF1A、ICAM1、IRF1、NFKBIA、PGR、RASA1、BCL2、CAV1、ESR2)。

2.5 GO功能富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫中對差異基因進行功能富集，分別富集到生物學(xué)過程582個條目、分子功能60個條目，細(xì)胞組分64個條目。以FDR值為依據(jù)，分別篩選整合富集度排名前20條目進行分析。以1～10個為組1，11～20個為組2，運用在線工具imageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html)對結(jié)果進行可視化，其中X軸表示富集因子，Y軸為富集到的GO條目，氣泡顏色表示FDR值顯著性，顏色越紅值越小，氣泡大小表示富集在該條目中的差異基因數(shù)目。

生物學(xué)過程主要涉及有機物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控，細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、類固醇激素刺激、防御反應(yīng)、內(nèi)源性刺激反應(yīng)、對抗應(yīng)激反應(yīng)、分子功能的正調(diào)控、細(xì)胞因子刺激反應(yīng)等(圖2)。分子功能主要涉及類固醇結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白二聚化、特定DNA序列結(jié)合、雌激素受體活性、NF-κB結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、表皮生長因子受體活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合等(圖3)；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞分子、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞外空間等 (圖4)。

圖2 GO功能分析(BP)氣泡圖

圖3 GO功能分析(MF)氣泡圖

圖4 GO功能分析(CC)氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape_v3.8.0軟件中的ClueGO插件對苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛差異基因進行功能富集，以P<0.01為閾值，共富集到73條通路，其中相互作用關(guān)系有316個通路。選取P值最小的20個通路，運用imageGP對結(jié)果進行可視化(圖5)，其中X軸表示富集因子，Y軸為富集到的通路，氣泡顏色表示P值顯著性，顏色越紅值越小，氣泡大小表示富集在該通路中的差異基因數(shù)目。提示可能通過干預(yù)這些信號通路起到治療偏頭痛的作用。

3 討 論

本研究以篩選苗藥定痛湯潛在藥效成分為切入點，構(gòu)建“苗藥定痛湯-作用靶點-偏頭痛治療靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得69個苗藥定痛湯治療偏頭痛的潛在藥物靶點，73條樞紐信號通路，不僅顯示出苗藥定痛湯多成分、多靶點的作用特征，還反映出該方對偏頭痛多途徑的藥理作用。

苗藥定痛湯中大血藤入血分，養(yǎng)血活血、祛風(fēng)止痛，輔以辛香之川芎、白芷、全蝎、蜈蚣、細(xì)辛助脈氣通行，甘草緩急止痛，共奏通氣散血止痛之功，可用于治療瘀血阻絡(luò)型偏頭痛。本研究構(gòu)建的多維網(wǎng)絡(luò)中，其中槲皮素有最多的相互作用關(guān)系。研究表明，槲皮素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，抑制雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中Toll樣受體4和NF-κB p65蛋白表達及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis factor，TNF-a)、IL-1β、IL-6、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA表達，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和炎癥損傷[1]。槲皮素還能通過激活PI3K/Akt通路并抑制ERK1/2信號通路從而減弱神經(jīng)元細(xì)胞的自噬和凋亡，達到改善神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能的作用[2]。柚皮素具有顯著的抗炎、抗氧化作用[3]。在體外糖氧剝奪(OGD)離體腦缺血模型和大腦中動脈栓塞(MCAO)模型中，柚皮素干預(yù)后核因子E2相關(guān)因2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2)基因的表達及抗氧化酶(SOD、NQO1)等水平上調(diào)，阻止線粒體去極化，凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3/9)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)水平下降，具有保護線粒體功能，能有效對抗缺血缺氧病理過程中神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷[4]。柚皮素可能通過激活PI3K/Akt/SIRT1信號通路有關(guān)，對心臟驟停-心肺復(fù)蘇大鼠心功能具有良好保護作用[5]。異鼠李素可通過激活Sirt1/PGC-1α信號途徑，減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護作用[6]。山奈酚可通過抑制神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)起到減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，起到腦保護作用，其抗炎機制可能與抑制NF-κB通路的激活有關(guān)[7]。β-谷甾醇因具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等廣泛的藥理活性[8-10]。這些成分在網(wǎng)絡(luò)中Degree值較高，可知苗藥定痛湯中化合物可以從多方面發(fā)揮治療作用。

在通路富集分析中發(fā)現(xiàn)20條關(guān)鍵通路，其中Pathways in cancer是極為復(fù)雜的代謝通路，內(nèi)含環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、P13K/Akt、NF-κB、IL-6等多條通路，其中，P13K/Akt通路同樣位于富集分析排名中的前20。在交集基因中有29個富集在該通路中，且P值排在前20中也多參與這些通路。NF-κB和MAPK是偏頭痛進程中的重要通路，與上調(diào)下游炎性介質(zhì)的釋放、介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥相關(guān)[11-12]。PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因中的SIRT1不僅對血管性癡呆大鼠炎性通路NF-κB通路具有明顯的負(fù)向調(diào)控作用[13]，還可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路降低高糖刺激心肌 H9c2 細(xì)胞的凋亡率和氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]，調(diào)控 MAPK 信號通路改善脂毒性誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[15]。另外，SIRT1可通過去乙?；诵幕蛑械腇OXO3a對抗氧化應(yīng)激損傷[16]。這提示苗藥定痛湯可能通過干預(yù)上述通路和靶點發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對苗藥定痛湯治療偏頭痛可能的分子機制進行探索分析。共篩選出苗藥定痛湯129個潛在活性成分和69個潛在治療靶點；GO分析包含生物學(xué)過程582個條目、分子功能60個條目，細(xì)胞組分64個條目。KEGG通路富集篩選出73條樞紐通路，發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與P13K/Akt、MAPK、NF-κB、SIRT1等多條信號通路相關(guān)。提示苗藥定痛湯治療偏頭痛可能通過干預(yù)上述通路發(fā)揮作用，其中SIRT1與以上通路均存在密切聯(lián)系，我們將在后續(xù)研究中以SIRT1通路作為切入點，對苗藥定痛湯干預(yù)偏頭痛的藥效作用機制進行探索研究。