扶正祛邪湯對肝癌模型大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境的作用研究

王 軍，徐建良，杜燕紅

(湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

肝癌分為原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性兩大類，患有肝癌的患者會出現(xiàn)消瘦、納差、肝區(qū)疼痛、乏力、腹脹等癥狀[1]。轉(zhuǎn)移性肝癌指的是原發(fā)于其他器官的惡性腫瘤侵犯到肝臟，一般比較常見的多在膽道、胃、卵巢、肺、結(jié)直腸等人體器官的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟[2]?，F(xiàn)有的治療肝癌的方法有手術(shù)切除、消融、TACE、放射治療、靶向治療、免疫治療等綜合性的治療方法。肝癌的危害性極大，可以并發(fā)上消化道出血，肝癌破裂出血、肝衰竭等。肝癌的腫瘤分期、分型、預(yù)后都與基礎(chǔ)疾病、肝癌累及范圍都有著密不可分的關(guān)系，原發(fā)性肝癌與長期吸煙、酗酒、病毒性肝炎、寄生蟲、飲水污染、遺傳、毒物等多種因素有關(guān)。目前使用西醫(yī)治療雖然有很好的治療效果，手術(shù)后可以看到明顯的恢復(fù)，但是西醫(yī)治療不適當(dāng)?shù)膽?yīng)用可能會加重患者的肝臟損傷，同時肝癌具有較高的轉(zhuǎn)移率以及復(fù)發(fā)率，會導(dǎo)致術(shù)后遠期療效不佳[3]。手術(shù)切除治療原發(fā)性肝癌會有一定的局限性，手術(shù)切除率較低，對臨床狀況較差或合并肝外轉(zhuǎn)移的中、晚期肝癌、彌漫型肝癌和術(shù)后肝內(nèi)廣泛復(fù)發(fā)仍無能為力。中醫(yī)可以治療疾病的根本，治療時間雖然長，但是可以減少疾病的復(fù)發(fā)率，中醫(yī)治療還可以提高機體的自愈能力，幫助身體恢復(fù)。中醫(yī)治療主要是通過調(diào)節(jié)正氣為主，因此預(yù)防小肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)是中醫(yī)的優(yōu)勢，同時中醫(yī)治療與西醫(yī)治療肝癌相比，中醫(yī)治療在抗復(fù)發(fā)或者抗轉(zhuǎn)移上有著絕對的優(yōu)勢[4]?；谏鲜鲅芯浚诒疚闹杏^察扶正祛邪湯應(yīng)用于肝癌模型大鼠的干預(yù)治療，分析其對肝功能恢復(fù)的作用，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料 研究動物：選取96只SPF級SD大鼠，購于河南天致藥業(yè)有限公司[動物許可證號：syxk(豫)2020-0008]，在相對濕度30.15%～35.21%、溫度為(31.04±2.40)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠168 h，平均每天光照12 h。

主要試劑：兔抗大鼠TLR4抗體(南京賽泓瑞生物科技有限公司)，貨號：SCA753Mu02；兔抗大鼠NF-κB抗體(上海雅吉生物科技有限公司)，貨號：YS04244B。

扶正祛邪湯：甘草、烏梅各20 g，當(dāng)歸30 g，茵陳蒿、赤芍各18 g，威靈仙15 g，姜黃、柴胡、僵蠶各10 g，山慈菇9 g，郁金8 g，黃連5 g，白花蛇舌草7 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及給藥:隨機選取96只中32只大鼠作為正常組，其余64只大鼠參照賈鸝等[5]建立大鼠肝癌模型，腹腔注射0.2%二乙基亞硝胺大鼠(20 mg/kg)，7 d一共給藥3次，連續(xù)進行28 d，結(jié)束后停藥14 d，第49天開始給大鼠灌胃0.01% DEN，第98天后結(jié)束喂養(yǎng)，隨機選取2只大鼠切除瘤組織進行病理組織學(xué)檢查是否建模成功。將建模成功的64只肝癌模型大鼠隨機分為模型組、給藥組各32只。給藥組大鼠采用350 mg/kg的扶正祛邪湯灌胃， 2次/d，連續(xù)灌胃29 d；模型組、正常組采用相同劑量的生理鹽水對大鼠進行灌胃處理。在29 d后觀察大鼠肝損傷情況。

1.2.2 病理組織學(xué)觀察:從大鼠體內(nèi)取出肝組織然后進行沖洗，接著在乙醇溶液中進行脫水處理，脫水完成后將肝組織放在二甲苯中透明處理后進行石蠟包埋，切60 μm的組織切片，將切片以61 ℃進行烘焙，烘焙完成后使用乙醇、二甲苯脫蠟進行脫水處理，然后對切片進行染色，染色時使用蘇木素染液，染色時間為5 min，然后經(jīng)過透明、封片、脫水處理后，將切片放在光鏡下觀察肝組織病理學(xué)的變化情況。

1.2.3 腸道菌群微生態(tài)環(huán)境檢測:采用糞便檢測法檢測腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，在大鼠接受治療前24～48 h和治療后72～120 h后分別留取大鼠糞便1～2 g做為樣本，樣本放在-80 ℃的冰箱內(nèi)保存。取出0.26 g的糞便樣品放在功率管中，然后加入含有十二烷基橫酸鈉溶液61 μl后上下均勻，且無沉淀，將功率管固定在渦旋儀適配器上，震蕩10 min，進行室溫10000 g離心處理30 s，重復(fù)至過濾完全部上清液后得出腸道菌群微生態(tài)環(huán)境。

1.2.4 AFP、CA19-9、ALT水平檢測:抽取三組大鼠的空腹靜脈血2 ml，離心半徑5 cm，平均轉(zhuǎn)速3000 r/32 s進行離心處理8 min，分離上層血清，在-60 ℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中AFP、CA19-9、ALT水平，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取試劑盒，以2∶3的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔中加入已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，在35.28 ℃的恒溫孵育箱中濕育2 h；用洗滌液將反應(yīng)板洗3次，加入1∶100倍稀釋后的抗體工作液100 μl/孔，放于35.28 ℃恒溫孵育箱中濕育48.23 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，置于35.28 ℃恒溫孵育箱中48.23 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在450 nm波長測定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與AFP、CA19-9、ALT水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AFP、CA19-9、ALT水平。

1.2.5 TLR4/NF-κB信號通路檢測:采用Western blot法檢測三組大鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路TLR4、NF-κB的表達量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。將采集到的瘤組織以500 g進行離心處理8.5 min，提取上清液，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在85 ℃的環(huán)境中加熱6 min，在4.27 ℃的環(huán)境下，在6%的脫脂牛奶中固定進行封閉處理，時間為63 min，將一抗使用0.05%～0.1%封閉液給予TLR4、NF-κB 1∶500進行稀釋，在5 ℃的孵育進行過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗2次膜，每次洗膜時間為7 min，二抗被0.05%～0.1% TBST 1∶500進行稀釋，搖動孵育時間為63 min，再次采用TBST連續(xù)洗2次膜，處理時間為7 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況，內(nèi)參蛋白設(shè)置為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用F值進行多組間比較檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠病理組織學(xué)觀察 正常組大鼠肝臟健全，肝功能無受損現(xiàn)象；模型組大鼠肝臟嚴(yán)重受損，且有癌細胞；給藥組大鼠肝臟受損傷程度逐漸減輕，肝組織炎癥性細胞減少，肝臟結(jié)構(gòu)較完整(圖1)。

圖1 三組大鼠肝組織病理變化觀察(HE染色，×400)

2.2 三組大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境比較 見表1。模型組、給藥組大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；給藥組大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境低于模型組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 三組大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境比較(MPN/g)

2.3 三組大鼠AFP、CA19-9、ALT表達水平比較 見表2。模型組、給藥組大鼠AFP、CA19-9、ALT高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；給藥組大鼠AFP、CA19-9、ALT低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 三組大鼠CA19-9、AFP、ALT表達水平比較

2.4 三組大鼠TLR4/NF-κB信號通路因子比較 見表3。模型組、給藥組大鼠TLR4/NF-κB水平高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；給藥組大鼠TLR4/NF-κB水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 三組大鼠TLR4/NF-κB信號通路因子比較(%)

圖2 TLR4/NF-κB信號通路因子免疫蛋白印跡圖

3 討 論

肝癌是在世界上發(fā)病率和病死率較高的腫瘤，一般男性的發(fā)病率要大于女性，這與男性的日常生活習(xí)慣、長期抽煙、酗酒、作息不規(guī)律有著極大的關(guān)系[6]。在前期時會感覺乏力、食欲不振等，到后期會出現(xiàn)面色暗黃、腹水、嘔血、昏厥的癥狀[7]。肝癌是一種惡性腫瘤，平時患病最多的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌，除了原發(fā)性肝癌外還有一種指的是繼發(fā)性肝癌[8]。繼發(fā)性肝癌指的是因除了肝臟外其他器官所導(dǎo)致的惡性腫瘤，一般侵犯的途徑是通過血液淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到肝臟的[9]。原發(fā)性肝癌主要發(fā)生的原因就是因慢性肝癌病毒感染有關(guān)的，除此之外也與一些致癌藥物、食物、飲酒、吸煙有關(guān)，長期的脂肪肝和有家族病史的也會因此患有肝癌的風(fēng)險。日常一定要注意健康的飲食，也要定期去體檢，早發(fā)現(xiàn)，早治療。一般肝癌患者的體內(nèi)瘤塊較小治療的效果就會越好，甚至還有些患者可以自愈，不過惡性腫瘤也有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的情況，在接受手術(shù)治療后也要定期復(fù)查，現(xiàn)有的治療肝癌的方法有：手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、生物治療和中藥治療，早期的肝癌患者在接受了治療后，在術(shù)后存活的幾率還是比較大的[10]。目前臨床中還是缺乏有效的治療肝癌的手段，為了早日研究出針對性治療的藥物具有重要的意義。

扶正祛邪湯可以起到一定的延緩腫瘤發(fā)展的作用，還可以穩(wěn)定瘤體，調(diào)節(jié)并穩(wěn)定肝功能的作用，可以有效的改善并提高患者生活質(zhì)量、臨床癥狀[11]。扶正祛邪湯取自《本草綱目》，扶正祛邪湯中含有甘草、威靈仙、赤芍、姜黃、郁金、柴胡、黃連、山慈菇、白花蛇舌草、茵陳蒿、烏梅、僵蠶、當(dāng)歸[12]。其中黃連、山慈菇、白花蛇舌草、茵陳蒿可以利濕退黃，清熱解毒。甘草有清熱解毒、補脾益氣、緩急止痛的功效，可以抗腫瘤、保護肝臟、抗病毒、增強免疫力[13]。威靈仙有著抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、利膽和促進造血的作用[14]。山慈菇可以化瘀散結(jié)、清熱解毒、抗菌、抗腫瘤。郁金可以利膽退黃，行氣解郁、保護肝臟、抗炎、抗腫瘤[15]。此結(jié)論提示著，使用扶正祛邪湯可改善患者機體炎癥反應(yīng)，有效的治療肝癌所導(dǎo)致的肝功能受損。

腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，指的是腸道微生態(tài)，微生態(tài)系統(tǒng)包括皮膚、泌尿、胃腸道、口腔四個，其中腸道微生態(tài)系統(tǒng)是最復(fù)雜的，是由腸道正常菌群及所生活的環(huán)境共同構(gòu)成的，腸道正常菌群也是微生態(tài)系統(tǒng)中最核心的部分，占人體總微生物量的78%[16]。微生態(tài)可以穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境，維持人體功能，還可以起到保護作用、營養(yǎng)作用、參與機體物質(zhì)代謝、促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、菌群屏障作用、防癌抑癌作用[17]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)扶正祛邪湯干預(yù)后，肝癌大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境顯著改善，此結(jié)果提示著，扶正祛邪湯可改變肝損傷，抑制疾病進展。

甲胎蛋白又稱甲種胎兒球蛋白，可以用作肝癌的檢測與診斷，甲胎蛋白水平的高低可以檢測是否患有肝癌，可以作為早期肝癌的診斷，甲胎蛋白是一種糖蛋白，屬于蛋白家族，具有很多重要的生理功能，包括免疫抑制、雙向調(diào)節(jié)等[18]。與多種腫瘤以及肝癌的發(fā)展有著密切相關(guān)的關(guān)系，可以作為腫瘤陽性檢測的指標(biāo)，是一種原發(fā)性肝癌的標(biāo)志物。腫瘤標(biāo)志物(CA19-9)是一種腫瘤細胞的代謝產(chǎn)物、分化紊亂的細胞基因產(chǎn)物、腫瘤細胞壞死崩解釋放進入血液循環(huán)的物質(zhì)、腫瘤宿主細胞的細胞反應(yīng)性產(chǎn)物[19]?？梢杂米髂[瘤早期發(fā)現(xiàn)、腫瘤患者化療、手術(shù)、放療療效的檢測、腫瘤的診斷、腫瘤的分期、復(fù)發(fā)、預(yù)后以及尋找不知來源的轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)灶。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在人體的心臟、肝臟組織的細胞中，是一種敏感的標(biāo)志。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)扶正祛邪湯干預(yù)后，肝癌大鼠CA19-9、AFP、ALT水平改變顯著改善，此結(jié)果提示著，扶正祛邪湯可改變CA19-9、AFP、ALT水平，有效的治療肝癌。

TLR4/NF-κB信號通路，TLR4與肝癌的發(fā)展有著密切的關(guān)系，在感染肝癌的大鼠體內(nèi)TLR4的水平屬于異常表達，TLR4可以作為肝癌腫瘤的研究方向，肝癌大鼠的血清可以通過激活TLR4信號通路來誘導(dǎo)分泌[20]。TLR4信號通路是涉及免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的，以TLR4作為靶點，激活樹突狀細胞以及殺傷性T細胞也可以有效的抑制癌細胞的生長。TLR4可以作為跨膜蛋白，識別細菌和真菌的細胞壁成分，發(fā)揮天然免疫識別作用，通過TLR4的介導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活天然免疫的細胞，從而導(dǎo)致免疫炎癥的反應(yīng)。刺激TLR4信號通路導(dǎo)致肝癌炎癥狀態(tài)，由此說明TLR4是被認(rèn)為參與肝癌序列的參與者的[21-22]。NF-κB不正確的調(diào)節(jié)與癌、自身免疫疾病、炎癥、感染性休克、免疫發(fā)育、病毒感染都有關(guān)，NF-κB家族中有五位成員，核因子是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可以參與肝癌的炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答，還可以調(diào)節(jié)肝癌的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)細胞的凋亡，可以通過藥物來抑制核因子-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，會成為一種重要的治療手段，NF-κB調(diào)節(jié)的靶蛋白包括：促血管生長因子、促轉(zhuǎn)移因子、黏附因子、生長因子、細胞周期控制因子、促凋亡因子[23-25]。以上論述說明，肝癌可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，抑制肝癌導(dǎo)致的肝功能損傷。

雖然本文認(rèn)為扶正祛邪湯作用于TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮其作用，但本試驗樣本量較少，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時可能存在一定的偏倚，且目前并未有研究發(fā)現(xiàn)扶正祛邪湯與TLR4/NF-κB信號通路之間的關(guān)系，因此本文研究結(jié)果還需后續(xù)試驗進一步研究證實。

綜上所述，扶正祛邪湯作用于TLR4/NF-κB信號通路，調(diào)控通路因子以及腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，改善肝癌引起的肝損傷，進而恢復(fù)肝功能。