參芪排毒湯對宮頸癌組織人乳頭瘤病毒E6/E7、P53和PRb基因蛋白表達的影響

郝志曄，張 晶，錢 偉，盧雯平

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053；2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518103)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中的一種常見的惡性腫瘤，是一種嚴重危害女性健康及生命安全的惡性病變[1-3]。其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第二位，僅次于乳腺癌。目前認為宮頸癌的發(fā)生與長期宮頸炎性浸潤、內(nèi)分泌紊亂、不良性生活、遺傳等因素相關(guān)[4-6]。我國宮頸癌的發(fā)生率呈現(xiàn)出上升趨勢，且有發(fā)病年齡逐漸年輕化走向。我們每年的宮頸癌新發(fā)病例約13萬左右，每年約有5.3萬例患者因?qū)m頸癌死亡[7-8]。雖然早期宮頸癌通過手術(shù)治療多可獲得理想預(yù)后，但術(shù)后復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率較高，且因本病早期多無典型表現(xiàn)，而導(dǎo)致確診時已經(jīng)失去最佳手術(shù)時間。隨著新輔助化療技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，更多的宮頸癌患者獲得了手術(shù)治療機會。新輔助化療能夠在術(shù)前有效縮小病灶體積、抑制腫瘤細胞活性、控制腫瘤細胞過度生長。但新輔助化療仍具有一定的不良反應(yīng)，部分患者難以耐受而影響了臨床療效。同時化療亦可使患者的免疫功能受到一定干擾，對化療療效與術(shù)后恢復(fù)均有不良影響。為此本次采用中藥聯(lián)合應(yīng)用于新輔助化療當中，以提高化療效果。為深入了解參芪排毒湯對宮頸癌組織的作用機制，本院特對宮頸癌組織中的HPV E6/E7、P53、PRb表達水平進行了研究分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2014年1月至2017年6月在本院接受治療的宮頸癌患者中選擇112例進入研究，按隨機數(shù)字表劃分成對照組與治療組。診斷標準：《婦產(chǎn)科學(xué)》中的相關(guān)標準[9]。臨床分期依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標準[10]。病例納入標準：①經(jīng)本院醫(yī)學(xué)影像學(xué)、病理學(xué)檢查后符合上文診斷標準確診為宮頸癌的患者；②FIGO標準屬于Ⅰb～Ⅱa期；③此前無放化療史，本院首診者；④患方自愿參與，且簽署知情同意書。本項研究經(jīng)本院倫理委員會批準。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②不符合前文中的診斷、分期標準；③經(jīng)評估無法耐受新輔助化療；④有腹腔鏡手術(shù)禁忌證；⑤無法配合術(shù)后復(fù)發(fā)及隨訪。對照組56例患者年齡為34～62歲，平均(46.81±6.37)歲；病灶最大直徑為2.6～6.7 cm，平均(4.47±0.35)cm；病理分型：腺癌4例，鱗癌52例；臨床分期：Ⅰb期26例，Ⅱa 期30例。治療組56例患者年齡為33～65歲，平均(47.12±6.54)歲；病灶最大直徑為2.7～6.9 cm，平均(4.51±0.37)cm；病理分型：腺癌3例，鱗癌53例；臨床分期：Ⅰb期24例，Ⅱa 期32例。統(tǒng)計學(xué)分析兩組以上資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 治療方法

1.2.1 對照組：兩組均于術(shù)前行新輔助化療，首次化療前行紫杉醇靜脈藥敏實驗，化療前1 d及紫杉醇首次用藥前30 min，行地塞米松脫敏；給予體征監(jiān)護?；熤芷诘?天，給予紫杉醇注射液(國藥準字H20053001)135～175 mg/m2，加入至0.9%氯化鈉注射液(國藥準字H20043271)中，靜脈滴注3 h；休息1 h后，給予順鉑注射液(國藥準字H20040812)70 mg/m2中，靜脈滴注。化療后休息21 d為1個化療周期，共治療2個化療周期。新輔助化療后行腹腔鏡宮頸癌根治術(shù)。

1.2.2 治療組：在對照組上述治療的同時于第1個化療周期第1 d起開始服用參芪排毒湯，方劑組成：生黃芪30 g，川牛膝、白花蛇舌草各24 g，昆布15 g，赤芍12 g，生曬參、蒼術(shù)、黃柏、牡丹皮、地龍、炙甘草各10 g。加減：下腹疼痛加白芍30 g，威靈仙12 g，沒藥6 g；少腹寒涼加肉桂10 g，吳茱萸6 g；食欲不振加雞內(nèi)金15 g，陳皮10 g；帶下氣味大、量多有血加炒薏米、蘆根各30 g，側(cè)柏炭15 g；便秘加火麻仁12 g，生大黃10 g。諸藥以水煎法煎制兩次，共取汁約480 ml，分別于每日早晚溫?zé)岷罂诜?，每?劑，連續(xù)服用至新輔助化療完成。

1.3 測定方法

1.3.1 HPV E6/E7 mRNA表達測定方法：術(shù)中留取病理組織，使用默瑞(上海)生物科技有限公司生產(chǎn)的HPV E6/ E7 mRNA檢測試劑盒，檢測原理為支鏈DNA雜交技術(shù)，能夠檢出HPV16、18、31、33、35、39、45、 51、52、56、58、59、66和68，共計14種高危型HPV的E6/E7 mRNA。實驗步驟嚴格遵照說明書進行。

1.3.2 P53、PRb蛋白表達測定方法：術(shù)中留取病理組織，采用免疫蛋白印跡(WB)實驗測定P53、PRb蛋白表達。主要步驟：采用北京索萊寶公司生產(chǎn)的全蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度，配置為1 μg/μl的蛋白溶液。以10 μl為電泳濃度進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，先行預(yù)電泳1 h，再行蛋白電泳 80 min，電泳后采用電轉(zhuǎn)印裝置將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，以便于抗體孵育。孵育前5%的脫脂牛奶封閉非特異性蛋白的結(jié)合位點，加入一抗，4 ℃孵育過夜，一抗孵育后二抗孵育，37 ℃孵育90 min，ECL試劑熒光顯像，暗室膠片顯影。采用Image J軟件分析顯影灰度，P53蛋白表達量= P53灰度/內(nèi)參灰度，PRb蛋白表達量= PRb灰度/內(nèi)參灰度，內(nèi)參為GAPDH。

1.3.3 預(yù)后評估方法：術(shù)后隨訪時間最少3年，術(shù)后2年內(nèi)每3個月到院復(fù)查1次，術(shù)后3～5年每6個月到院復(fù)查1次，于復(fù)查時記錄患者有無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、及死亡，繪制生存曲線和無進展生存曲線，以分析患者預(yù)后。

1.4 療效標準 療效評估方法：術(shù)前1 d，依據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的實體瘤療效評價標準評估[11]。病灶完全消失且維持1個月及以上為完全緩解；病灶體積縮小50%及以上且維持1個月及以上為部分緩解；病灶體積縮小不足50%，或有增大但未達25%維持1個月及以上為穩(wěn)定；病灶體積增大達25%及以上為進展，緩解包括完全緩解與部分緩解。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。等級資料以秩和檢驗，計數(shù)資料以[例(%)]表示，采用卡方檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗；生存時間以Kaplan-Meier分析，繪制生存曲線圖，比較以Log-Rank檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床療效比較 見表1。治療組緩解率為83.93%，對照組為62.50%，治療組緩解率高于對照組(χ2=6.556，P<0.05)，治療組臨床療效優(yōu)于對照組(Z=-2.273，P<0.05)。

表1 兩組臨床療效比較[例(%)]

2.2 兩組不良反應(yīng)發(fā)生比較 見表2。治療組不良反應(yīng)發(fā)生率為12.50%，對照組為17.86%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩組不良反應(yīng)發(fā)生比較[例(%)]

2.3 兩組組織樣本中HPV E6/E7 mRNA、P53、PRb表達水平比較 見表3。化療后兩組患者癌旁組織中HPV E6/E7比值經(jīng)分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，病理組織中HPV E6/E7表達高于治療組(P<0.05)，兩組癌旁與病理組織中P53、PRb比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 兩組組織樣本中HPV E6/E7 mRNA、P53、PRb表達水平比較

2.4 兩組患者生存函數(shù)分析 見表4。對照組隨訪時間為25.87～71.52個月，治療組為30.29～71.53個月；治療組患者PFS、OS均長于對照組(均P<0.05)。

表4 兩組患者生存函數(shù)分析(月)

3 討 論

新輔助化療是一種術(shù)前應(yīng)用的化療方式，也稱早期化療、先期化療。其主要目的在于降低腫瘤細胞的活性、縮小腫瘤病灶的體積，擴大手術(shù)治療的適應(yīng)范圍[12-13]。宮頸癌由于早期多無典型表現(xiàn)，而使部分患者錯失最佳手術(shù)時機，通過新輔助化療能夠使其獲得手術(shù)治療的機會，對于延長患者生存時間、提高預(yù)后生存質(zhì)量具有重要意義[14-15]。新輔助化療多于瘤體的血管床未被破壞時開始，可使化療藥物發(fā)揮最佳療效并可降低脈管浸潤風(fēng)險，輔助提高手術(shù)療效。新輔助化療在減少術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面具有明確功效。宮頸癌的手術(shù)治療屬于有創(chuàng)性治療，且創(chuàng)傷范圍較大，因此術(shù)后患者的免疫功能有所降低，在機體恢復(fù)時期易給腫瘤造成復(fù)發(fā)機會，因此在術(shù)前進行化療不僅可增加手術(shù)機會、降低手術(shù)難度，同時還因患者機體尚未受到創(chuàng)傷、免疫功能相對較理想而使化療效果得到更好的保障，提升患者對化療的耐受度。宮頸癌患者在疾病作用下多出現(xiàn)諸多不適與免疫功能紊亂，因此新輔助化療仍面臨部分患者耐受度低的問題。為了進一步提高新輔助化療的效果，臨床上關(guān)于中西醫(yī)聯(lián)合的研究逐漸增多，中醫(yī)學(xué)在宮頸癌治療方面具有豐富經(jīng)驗與獨特優(yōu)勢。中醫(yī)治療通過辨證施治，在整體改善患者健康基礎(chǔ)，增強患者術(shù)前免疫功能方面療效確切。

中醫(yī)理論認為宮頸癌屬于“癥瘕、陰瘡、積聚”等范疇，認為本次屬于正虛邪實之癥[16-17]?；熜纬傻牟贿m在中醫(yī)理論認為屬外邪入體。因此治療應(yīng)以清毒逐瘀、去腐生新、補氣和中為要。本院參芪排毒湯中，生曬參屬補氣類中藥，性平、味甘、微苦，歸心、脾、肺經(jīng)，有復(fù)脈固脫、大補元氣、補益脾肺、止渴生津、安神益智功效，主治陽虛宮冷、肢冷脈微、體虛欲脫、津傷口渴、久病虛羸等病癥。生黃芪為補氣圣藥，其味甘、性微溫，入肺、脾經(jīng)，有益衛(wèi)固表、托毒生肌、補氣升陽、利水消腫功效；黃芪擅長于治療食少便溏、氣虛乏力、中氣下陷、臟器下垂、氣虛水腫、陰疽漫腫等病癥。蒼術(shù)性溫、味辛、苦，歸脾經(jīng)，蒼術(shù)有燥濕健脾，散寒祛風(fēng)功效，蒼術(shù)、黃柏、川牛膝三味藥為三妙丸，治療濕熱下注引起的婦科帶下、盆腔炎、宮頸疾病有較好的療效。牡丹皮味苦、辛，性微寒，歸心、肝、腎、心經(jīng)，具有涼血、活血、清熱化瘀功效；主治溫毒血熱吐衄，陰虛發(fā)熱、無汗骨蒸，癰腫瘡毒等癥。丹皮苦寒善清營血實熱，其辛開苦泄，方具有活血祛瘀之功。赤芍性微寒、味苦，歸肝經(jīng)。赤芍有清熱祛瘀、涼血止痛功效。白花蛇舌草味苦、甘，性寒，歸心、肝、脾、大腸經(jīng)，有清熱解毒、消癰利濕作用，主治咽喉腫痛、肺熱咳喘、癤腫瘡瘍、腸癰、癌腫等癥。地龍性寒、味咸，歸肝、脾經(jīng)、膀胱經(jīng)，有清熱熄風(fēng)、通絡(luò)平喘、利水消腫功效；現(xiàn)代藥理研究顯示地龍可以調(diào)節(jié)機體免疫功能、有抗腫瘤、溶解血栓作用。昆布味咸、性寒，入肝、腎經(jīng)，具有軟堅消痰，利水消腫功效，主治瘰疬、癭瘤，睪丸腫痛，水腫、痰飲水腫；現(xiàn)代藥理研究昆布對存在于體外的人體癌細胞和腫瘤有顯著的抑制作用，能提高人體的體液免疫，促進細胞免疫。炙甘草可補氣和中、健脾養(yǎng)胃、調(diào)和諸藥。

本次研究結(jié)果表明，在新輔助化療的同時應(yīng)用參芪排毒湯能夠提高化療功效。P53為腫瘤抑制基因之一，能夠抑制腫瘤增殖。HPV E6/E7>1為陽性標準，是宮頸癌形成的一項獨立危險因素[18]。宮頸癌細胞內(nèi)的HPVE6基因能夠主動整合至細胞基因組當中，使HPVE6癌蛋白與P53發(fā)生結(jié)合，形成硫醇酯復(fù)合物而促進泛素活化，致使P53被蛋白酶降解，從而使P53在宮頸癌細胞中的含量異常下降，削弱了P53的抑癌能力。PRb是一種腫瘤抑制蛋白，HPV E7基因編碼類的蛋白能夠主動結(jié)合PRb，導(dǎo)致其磷酸化失活，釋放核轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而促使感染實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄、惡性增殖。因此PRb在宮頸癌細胞中可見低于正常組織的過低表達。本次研究結(jié)果表明，經(jīng)治療治療組患者的宮頸癌組織HPV E6/E7、P53、PRb表達水平均優(yōu)于對照組；提示參芪排毒湯具有改善宮頸癌組織中HPV E6/E7、P53、PRb表達水平的作用，這可能是參芪排毒湯在輔助宮頸癌化療中發(fā)揮良好作用的一項重要機制。經(jīng)3年隨訪得知，治療組患者PFS、OS均長于對照組；提示參芪排毒湯的聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮了降低復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等病情進展的風(fēng)險，因此可有效延長患者生存時間。經(jīng)ROC分析可知，在參芪排毒湯聯(lián)合新輔助化療完成后，宮頸癌組織中的HPV E6/E7、P53、PRb表達水平對于患者預(yù)后病情進展及預(yù)后生存時間具有較高預(yù)測價值。當患者宮頸癌組織中的HPV E6/E7≥0.895、PRb≥0.455、P53≥0.515時均可提示預(yù)后3年內(nèi)發(fā)生病情進展，當HPV E6/E7≥0.925、PRb≥0.435、P53≥0.485時則可提示患者預(yù)后3年死亡。因此術(shù)中留存病理樣本進行HPV E6/E7、P53、PRb檢測，可為宮頸癌預(yù)后評估提供重要參考。

綜上所述，參芪排毒湯能夠提高新輔助化療的臨床療效，為后續(xù)手術(shù)治療提供更好的保障。參芪排毒湯能夠有效改善宮頸癌組織中HPV E6/E7、P53、PRb的表達水平，鑒于這三項指標對于預(yù)測患者預(yù)后具有重要的參考價值，可推斷聯(lián)合應(yīng)用于參芪排毒湯能夠輔助宮頸癌患者獲得理想預(yù)后。