防己黃芪湯對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231抑制作用研究

楊俊鋒，郝艷方，王?？?，裴曉華

(北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院外科，北京 102400)

三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)主要是指癌組織經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均為陰性的一種乳腺癌[1-2]。TNBC因其腫瘤體積較大，異質(zhì)性較高，分化低，同時(shí)C-KIT、 P53及EGFR多表達(dá)為陽(yáng)性，增殖、擴(kuò)散速度較快，所以使其具有很高的侵襲性[3]。TNBC具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、易死亡且預(yù)后差等特點(diǎn)，其中，轉(zhuǎn)移多發(fā)生于內(nèi)臟及軟組織，如肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移，但骨轉(zhuǎn)移發(fā)生相對(duì)較少[4]。有研究發(fā)現(xiàn)非三陰性乳腺癌患者的5年生存率為80%，而TNBC患者的5年生存率僅為70%[5-7]。防己黃芪湯出自《金匱要略》，由防己、黃芪、白術(shù)、炙甘草4味藥組成，用法中加入了生姜、大棗。臨床上我們也常用防己黃芪湯加減方治療乳腺癌患者術(shù)后綜合治療期的病癥，該方在改善術(shù)后上肢水腫、緩解患者疲勞程度、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及降低腫瘤標(biāo)志物等方面均具有一定的療效[8-11]。另外不少研究也證實(shí)防己黃芪湯中黃芪、防己、白術(shù)中有效成分具有明確的抗腫瘤作用[12-15]。中醫(yī)藥治療乳腺癌相關(guān)文獻(xiàn)證治用藥規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)：高頻次藥物統(tǒng)計(jì)結(jié)果中黃芪、甘草、白術(shù)分別位列第1、5、7位[16-17]。因此，防己黃芪湯中大部分組成藥物為治療乳腺癌的常用藥物。綜上，本研究選擇三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231為對(duì)象，觀察防己黃芪湯對(duì)其抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MB-MDA-231，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司，產(chǎn)品批號(hào)：11875093；胎牛血清，中國(guó)ExCell公司，產(chǎn)品編號(hào)：FND500；磷酸鹽緩沖液(PBS)，中國(guó)凱基公司；0.25% EDTA胰蛋白酶，美國(guó)Invitrogen公司；青鏈霉素，美國(guó)Invitrogen公司；MTT(四甲基偶氮唑鹽)，中國(guó)Genebio公司；二甲基亞砜(DMSO)，美國(guó)Ameresco公司；Annexin VFITC Apoptosis Detection Kit I，美國(guó)BD公司；Transwell板，美國(guó)Corning公司。實(shí)驗(yàn)用藥防己黃芪湯(防己、黃芪、炙甘草、白術(shù)、生姜、大棗)由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房負(fù)責(zé)提供。

1.2.2 儀器：超凈工作臺(tái)(中國(guó)月壇牌)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo HERAcell240 i，美國(guó))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，CKX53，日本)；低速離心機(jī)(京立LD5-2B，中國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))高壓消毒鍋(TOMY SX-500，日本)；-80 ℃冰箱(Themo，美國(guó))；冰箱(海爾，中國(guó))；微量移液器(Eppendorf，德國(guó))；96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、EP管、凍存管等(Corning，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231置于含有10%胎牛血清、1%青/鏈霉素溶液的1640培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每天通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及是否污染，隔日換液一次，每 2～3 d 進(jìn)行消化、傳代。

1.3.2 防己黃芪湯制備：按處方組成及比例(防己12 g，黃芪15 g，炙甘草6 g，白術(shù)9 g，生姜4片，大棗1枚)，稱(chēng)取十劑處方量，經(jīng)過(guò)煎煮、過(guò)濾、濃縮，制成干燥固體顆粒，-20 ℃冰箱中密封保存。按照所需濃度準(zhǔn)確稱(chēng)取防己黃芪湯浸膏至于PBS溶液中，超聲處理，再水浴鍋中孵育，離心，取上清液采用0.22 μm濾器過(guò)濾，制備為母液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。使用時(shí)，采用1640培養(yǎng)基按比例稀釋。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的MB-MDA-231細(xì)胞，用0.25% EDTA胰蛋白酶消化離心后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，配制細(xì)胞懸液濃度為5×104個(gè)/ml，充分混勻，接種于96孔板中，每孔分別為200 μl，每種藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔觀察，周?chē)追謩e加入200 μl PBS封邊，防止液體蒸損耗。放置于37 ℃，5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，等到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好后，實(shí)驗(yàn)組分別加入防己黃芪湯梯度濃度溶液(4、8、16、32、64 mg/ml)200 μl/孔，空白對(duì)照組加入1640溶液200 μl/孔。繼續(xù)放置于37 ℃，5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)時(shí)分別進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)前4 h，向待測(cè)孔的每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后中止，將各孔中的液體吸棄干凈，每孔繼續(xù)加入150 μl DMSO，室溫下震蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD值(波長(zhǎng)490 mm)，根據(jù)各組OD值計(jì)算細(xì)胞抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。計(jì)算細(xì)胞抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞抑制率=(1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值)×100%[18]。

1.3.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡作用影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的MB-MDA-231細(xì)胞，接種于6孔板，放置于37 ℃，5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，按照分組分別將不同濃度的藥物加入各孔，繼續(xù)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，1500 r/min，離心5 min，棄上清，加入4 ℃ PBS，輕輕震蕩，清洗2次，1500 r/min，離心5 min，棄上清，將細(xì)胞懸于0.1 ml Binding Buffer，調(diào)整濃度為1×105個(gè)。各管中加入5 μl PI和5 μl AnnxinV，避光，室溫下靜置15 min后，再向各管中加入0.4 ml Binding Buffer，通過(guò)500 mm濾網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)軟件處理后，得出各細(xì)胞的周期及凋亡細(xì)胞百分比。

1.3.5 Transwell檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞體外侵襲力影響：將所有吸頭、小管及培養(yǎng)液提前預(yù)冷，將Matrigel膠按照1∶8的比例用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)僮骶诒猩线M(jìn)行，以避免Matrigel室溫條件下成膠。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MB-MDA-231細(xì)胞，配制不同濃度的細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/ml，備用。將稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室上室，使液體均勻分布于小室底面，放置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，取出小室，吸棄小室內(nèi)殘留液體。Matrigel基質(zhì)層再次水化，完成后，將全部小室移至新的24孔板中，小心吸棄上室中的培養(yǎng)基。而后在上室每孔中加入細(xì)胞懸液500 μl，下室每孔中加入含有30%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液750 μl。放入37 ℃，5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，倒扣小室，吸棄培養(yǎng)液，用PBS清洗小室上室，用棉拭子輕輕擦去上室內(nèi)非侵襲細(xì)胞，加入甲醛，固定10 min。隨后加入用PBS稀釋后的DAPI染色液10 μg/ml，對(duì)其避光染色30 min。在熒光倒置顯微鏡(×400)下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)小室選取上中下左右5個(gè)視野，對(duì)其進(jìn)行穿膜細(xì)胞的計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，并分別在×100，×200，×400視野下觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 防己黃芪湯可體外抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231增殖 見(jiàn)表1。不同濃度的防己黃芪湯(4、8、16、32、64 mg/ml)作用于MB-MDA-231細(xì)胞24、48、72 h后，抑制率在一定濃度范圍內(nèi)和作用時(shí)間呈正相關(guān)性。防己黃芪湯濃度在32 mg/ml和64 mg/ml條件下，作用48 h和72 h后，對(duì)細(xì)胞抑制率沒(méi)有明顯增加(P>0.05)。在相同時(shí)間條件下，不同濃度的防己黃芪湯隨著濃度的提升，對(duì)細(xì)胞的抑制率也成上升狀態(tài)，且各濃度之間比較，具有明顯差異(P<0.05)。防己黃芪湯在24、48、72 h對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞IC50濃度分別為：7.35、6.50、5.28 mg/ml?？紤]到高濃度藥物對(duì)細(xì)胞滲透性影響，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的防己黃芪湯濃度為4 mg/ml(低濃度組)、8 mg/ml(中濃度組)和16 mg/ml(高濃度組)，觀察時(shí)點(diǎn)為24 h。

表1 不同濃度防己黃芪湯對(duì)MB-MDA-231細(xì)胞抑制率(%)

2.2 防己黃芪湯可明顯改變?nèi)巳幮匀橄侔┘?xì)胞MB-MDA-231形態(tài) 對(duì)照組MB-MDA-231 細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)良好，呈長(zhǎng)梭形，或多邊形，細(xì)胞個(gè)體飽滿(mǎn)，胞質(zhì)豐富，輪廓清晰，呈簇狀聚集。防己黃芪湯高濃度組可見(jiàn)到培養(yǎng)基顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變黃，且高倍(×200) 倒置顯微鏡下僅可見(jiàn)很少的貼壁細(xì)胞，多散在排列，部分細(xì)胞體積改變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，裂解成碎片(圖 1)。

A:對(duì)照組；B:防己黃芪湯高濃度組

2.3 防己黃芪湯可誘導(dǎo)人三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231凋亡 防己黃芪湯濃度低、中、高濃度作用于人乳腺癌MB-MDA-231 細(xì)胞24 h后，總凋亡率分別為(38.78±3.78)%、(48.37±4.29)%和(77.21±3.89)%，對(duì)照組總凋亡率為(9.78±2.37)%，防己黃芪湯組明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。防己黃芪湯低、中、高濃度作用24 h后引起MB-MDA-231細(xì)胞早期凋亡率分別為(29.62±2.56)%、(27.50±3.76)%和(46.38±2.67)%，與對(duì)照組(3.32±1.22)%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，但低濃度和中濃度組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)于MB-MDA-231 細(xì)胞晚期凋亡率影響方面，防己黃芪湯低、中、高濃度組分別為(8.76±1.02)%、(23.21±2.01)%和(30.78±2.38)%，與對(duì)照組(6.25±1.24)%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。防己黃芪湯作用24 h能夠提高M(jìn)B-MDA-231細(xì)胞的總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率，其中提高早期凋亡率更為明顯(圖2)。

A:對(duì)照組；B:防己黃芪湯低濃度組；C:防己黃芪湯中濃度組；D:防己黃芪湯高濃度組

2.4 防己黃芪湯可體外抑制MB-MDA-231侵襲力 選取400倍鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果，防己黃芪湯低、中、高濃度處理24 h后，MB-MDA-231，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(28.22±3.00)個(gè)、(20.78±3.10)個(gè)和(12.67±3.78)個(gè)，與對(duì)照組(36.67±4.45)個(gè)相比明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。防己黃芪湯對(duì)MB-MDA-231侵襲力抑制力隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)(圖3)。

A:對(duì)照組；B:防己黃芪湯低濃度組；C:防己黃芪湯中濃度組；D:防己黃芪湯高濃度組

3 討 論

TNBC是乳腺癌中的一種特殊亞型，因其具有復(fù)發(fā)率高、侵襲力強(qiáng)及預(yù)后差的特點(diǎn)，如何能提高療效仍然是現(xiàn)在臨床面臨的瓶頸問(wèn)題，雖然近年來(lái)在生物學(xué)和臨床試驗(yàn)研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍然沒(méi)有找到針對(duì)性強(qiáng)，效果顯著的治療方案[19]。因此，臨床上仍然亟需探索出好的治療思路和有效的藥物。中醫(yī)中藥發(fā)展歷史悠久、理論基礎(chǔ)深厚、干預(yù)方法多樣，這將可能為解決此臨床難題提供新的思路和切入點(diǎn)。通過(guò)合理地辨證使用中醫(yī)藥能夠改善乳腺癌患者的生存質(zhì)量，減輕放、化療的毒副作用，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的帶瘤生存期[20]。乳腺癌屬于中醫(yī)學(xué)“乳巖”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺癌發(fā)生的本質(zhì)是本虛標(biāo)實(shí)，正氣虛衰為本，氣滯、痰凝、血瘀、邪毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)，乳腺癌的發(fā)生是因虛致實(shí)，因?qū)嵍?，虛?shí)夾雜的復(fù)雜病理過(guò)程。防己黃芪湯從方義分析上似乎與乳腺癌的病因病機(jī)并不能一一對(duì)應(yīng)，但是正如前文中所提及其藥方組成藥物都具有一定抗腫瘤特性，加之中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制”的特點(diǎn)[21]。因此，選擇對(duì)中藥復(fù)方的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行研究，可能會(huì)成為治療腫瘤的新希望。本課題組也一直致力于中醫(yī)藥防治乳腺癌的研究，多年研究也發(fā)現(xiàn)防己中有效成分粉防己堿在體外對(duì)乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞及HCC1937細(xì)胞的增殖及侵襲力具有明顯的抑制作用，并可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2、Bax、Bid、caspase-3等相關(guān)。

本研究已初步證實(shí)了防己黃芪湯能體外抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且對(duì)其侵襲力也具有一定抑制作用，為中醫(yī)藥治療TNBC提供了一定數(shù)據(jù)支持。但是對(duì)于細(xì)胞抑制作用中的具體分子機(jī)制和分子靶點(diǎn)的理論機(jī)制還需要進(jìn)一步探索和研究。