止麻消痰活血湯治療大鼠無復流心肌梗死實驗研究

劉 琪，宋溫婷,賈運時，李武衛(wèi)

(石家莊市中醫(yī)院心病二科，河北 石家莊 050000)

隨著我國社會老齡化程度加重、居民生活水平的提高及日常飲食習慣的改變，急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，且具有較高的病死率[1-2]。臨床上對AMI的治療以疏通閉塞的冠狀動脈為目的，抗血栓、抗缺血治療及手術介入治療，使得AMI的病死率大大下降，但在AMI冠脈再通后，心肌組織仍會出現(xiàn)低灌注或無灌注的狀態(tài)，稱之為無復流(No-reflow,NR)現(xiàn)象[3-4]。NR會增加AMI患者圍手術期的病死率，影響患者恢復期的心室重塑，增加心血管不良事件的風險[5]。本研究通過對心肌梗死NR大鼠給予止麻消痰活血湯干預治療，研究其對于NR的治療效果，探討其改善NR的作用機制，在發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢的基礎上，為NR的防治尋找新的治療方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料:選用2個月齡雄性健康大鼠60只，動物批準號：SCXK(京)2018-0007。均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于清潔級實驗室中在(22±2)°C室溫下，保持敷料干燥，自由攝食飲水攝食，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。NF-κB p65及phospho-NF-κB p65抗體均購于北京奧維亞生物技術有限公司、IL-6、CRP及TNF-α劑盒試劑盒均由北京美迪科生物技術有限公司提供，Western blot及凝膠電泳試劑均購于南京凱基生物有限公司。

1.1.2 儀器：臺式離心機(型號：5424r，美國Eppendorf公司)、切片機(型號：OPJ-1B，廠家：天津天利航空機電有限公司)、全自動酶標儀(型號：Read Max 1900Plus，上海閃譜生物科技有限公司)、顯微鏡(型號：Olympus IX71，日本OLYMPUS)、PCR 儀(型號：Step One Plus Real-Time,美國Applied Biosystems公司)、電泳儀(型號：Bio-RaD，美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、模型制備及干預：將60只大鼠隨機分為對照組、模型組和止麻消痰活血湯組，各20只。將大鼠采取俯臥位進行固定，按照1.5 ml/kg標準，進行3%戊巴比妥鈉注射麻醉，然后將其進行仰臥位固定，胸骨左緣2～4肋間，行橫切口(約1.5 cm)，充分暴露心包，對冠狀動脈左前降支采用縫合線進行結扎，結扎90 min后，松解結扎線，然后縫合切口，而對照組只穿線，不結扎，正?？p合切口即可。造模成功后，所有組大鼠禁食但不禁水12 h后，止麻消痰活血湯組給予200 μg /(kg·d)劑量的止麻消痰活血湯灌胃，止麻消痰活血湯方組成：黃芪、雞血藤各20 g，當歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、陳皮、半夏、烏梢蛇各10 g，丹參、膽南星各12 g，全蝎6 g，桑枝15 g。止麻消痰活血湯方中的所有藥物來源及制備均來自石家莊市中醫(yī)院中藥房。對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，均連續(xù)4周。

1.2.2 心肌組織形態(tài)學情況觀察：實驗4周后，采用4 mg/kg的10%的水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉處理，取心肌組織作為標本，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小標本兩塊，0.3%戊二醛和1%的四氧化鋨進行固定，梯度丙酮脫水進行石蠟包埋，切片機切成厚度5 μm的切片，進行HE染色，鏡下觀察染色情況及組織輪廓。

1.2.3 超聲心動圖檢測：實驗4周后，采用4 mg/kg的10%的水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉處理，大鼠胸部皮毛處理采用8%的Na2S進行處理。采用超聲心動圖儀(17.5 MHz探頭；Visual Sonics Vevo770)對左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)以及左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)水平進行測定。

1.2.4 IL-6、CRP、TNF-α檢測：實驗成功4周后，各組大鼠4%水合氯醛進行麻醉，心臟穿刺取血，離心機(3000 r/min)離心10 min，取上清，-20 ℃?zhèn)浯?。采用ELISA法對IL-6、CRP及TNF-α水平進行測定，按照相關試劑盒說明書進行操作，波長450 nm下酶標儀讀取OD值，計算出IL-6、CRP及TNF-α的濃度。

1.2.5 Western blotting測NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白表達：采用Western blot法檢測心肌組織NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表達：采用改良異硫氰酸胍法提取總蛋白，-80 ℃下凍存，將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白，然后轉印到PVDF膜上，置入封閉液中搖動1 h,加入一抗(NF-κB p65及phospho-NF-κB p65均為1∶500稀釋)孵育，4 ℃下過夜。二抗孵育(1∶2000稀釋)2 h，免疫熒光增強法顯色，NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表達量與β-actin的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，不同組間比較采用F檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 三組大鼠心肌組織形態(tài)學情況 實驗4周后，對照組大鼠心肌細胞完整、排列均勻，形態(tài)正常；模型組大鼠心肌組織排列紊亂、心肌細胞間隙增寬，大量纖維組織生成；止麻消痰活血湯組心肌組織排列較為有序，纖維組織較少(圖1)。

2.2 三組大鼠心功能情況比較 見表1。實驗4周后，與對照組大鼠相比，模型組和止麻消痰活血湯組，LVESd及LVEDd明顯增加，LVEF及LVFS明顯降低，且模型組比對照組更明顯(P<0.05)。

表1 三組大鼠心功能情況比較

2.3 三組大鼠血清炎癥因子水平情況比較 見表2。實驗4周后，模型組和止麻消痰活血湯組IL-6、CRP、TNF-α水平高于對照組，且模型組高于止麻消痰活血湯組(P<0.05)。

表2 三組大鼠血清炎癥因子水平情況比較

2.4 三組大鼠心肌組織NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平表達情況比較 見表3(圖2)。實驗4周后，三組大鼠心肌組織NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白水平表達情況：對照組<止麻消痰活血湯組<模型組(P<0.05)。

表3 三組大鼠心肌組織相關蛋白表達情況比較

A:對照組；B:模型組；C:止麻消痰活血湯組

1～2為對照組，3～4為模型組，5～6為止麻消痰活血湯組

3 討 論

AMI的發(fā)病因素較復雜，主要由冠狀動脈粥樣硬化引起，導致心臟供血不足或中斷，從而對心肌組織產(chǎn)生損傷[6]。目前臨床上對AMI的治療以疏通閉塞的冠狀動脈為目的，抗血栓(抗凝、抗血小板藥物)、抗缺血治療(β受體阻滯劑、抗心肌缺血藥物、鈣離子阻滯劑)及手術介入治療，其中經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)是治療AMI的主要手段，其血管再通率較高。但PCI術后，患者仍會存在心肌再灌注不完全的現(xiàn)象，即NR[7-8]。NR的發(fā)生機制目前尚未完全明確，通常認為AMI患者在經(jīng)過治療后，血小板栓子、血脈粥樣硬化碎片及血凝塊隨著恢復正常的血流進入循環(huán)系統(tǒng)，會導致微栓塞，從而引發(fā)NR[9-10]。臨床上西醫(yī)對NR常采用血管擴張劑、抗血栓及他汀類藥物進行防治，但其給藥劑量較大，且部分藥物價格昂貴，術中術后對患者血壓心率等影響較大，有一定的副作用，易導致心血管不良事件的發(fā)生，且不能完全阻止NR現(xiàn)象[11]。因此尋找安全有效、便捷且價廉的中醫(yī)藥治療手段十分重要。

相關研究證實，發(fā)生NR時，機體的微循環(huán)水平血流仍未完全恢復，一定程度增加心肌的僵硬程度，引發(fā)心臟重塑，表現(xiàn)為進行性左心室腔擴大，心功能異常[12-13]。中醫(yī)理論認為，瘀血阻絡、心絡受阻、瘀血內(nèi)阻等為NR的病機特點，因此活血化瘀通絡為治療NR的主要原則[14]。止麻消痰活血湯是由邢月朋名老中醫(yī)所創(chuàng)的經(jīng)驗方，藥方中的黃芪具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；當歸、川芎、赤芍、丹參及雞血藤具有活血祛瘀、補血活血的功效；桃仁可活血祛痰，半夏、陳皮及膽南星具有清熱化痰，理氣健脾的功效；全蝎、烏梢蛇具有祛濕通絡，止痙止痛的功效；紅花可起到活血通經(jīng)、散瘀止痛的作用；桑枝可生津利水、祛濕通絡、祛風養(yǎng)血，諸藥共用可達到活血通脈、益氣化濁的功效。 本研究結果顯示，止麻消痰活血湯組大鼠心肌纖維化減輕，LVESd及LVEDd比模型組明顯降低，LVEF及LVFS明顯增加，這說明了止麻消痰活血湯可有效緩解心肌纖維化的發(fā)生，改善心肌纖維化；改善心肌能量組織代謝，促增加冠脈的灌注量，減輕左心室負荷，減少心肌耗氧量和做功量，從而改善左心室功能。

缺血再灌注可導致機體產(chǎn)生大量氧自由基生成，心肌產(chǎn)生氧化應激損傷，大量中性粒細胞在心肌內(nèi)黏附和浸潤，引發(fā)炎癥反應，使毛細血管通透性增加，微循環(huán)阻塞，促成NR發(fā)生[15-16]。CRP是臨床常用的反應炎癥反應水平的指標[17]。TNF-α是炎癥的啟動因子，在炎癥的發(fā)生及發(fā)展過程中起到核心作用[18]。IL-6是一種炎癥反應因子，在機體免疫應答中起到多樣性作用。以上諸炎癥因子與心肌缺血及再灌注有著密切的關系，可介導微循環(huán)和內(nèi)皮細胞的損傷，導致NR的發(fā)生。現(xiàn)代藥理學認為，雞血藤具有一定的抗炎作用，桃仁有具有抗炎抗菌的功效。本研究結果顯示，實驗4周后，模型組IL-6、CRP、TNF-α水平高于止麻消痰活血湯組，本研究表明止麻消痰活血湯具有抑制炎癥因子的合成和分泌，可調(diào)控機體炎癥反應，改善心肌供血障礙，改善心肌再灌注損傷，對心肌組織起到保護作用。

NF-κB是一種存在于體細胞中的核轉錄因子，可與多種基因上游的啟動子結合，促進轉錄翻譯的發(fā)生，對機體炎癥、細胞生長及免疫應答起到重要作用。NF-κB是由p50和p65亞基形成的異源二聚體，機體發(fā)生缺血性損傷時，在級聯(lián)放大反應的作用下被激活，并對炎癥反應起到促進和加劇的作用。本研究結果顯示，實驗4周后，止麻消痰活血湯組大鼠心肌組織NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于模型組。這是因為通過止麻消痰活血湯治療，可下調(diào)NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表達，對心肌組織細胞核內(nèi)外活化的NF-κB起到滅殺作用，從而終止炎癥介質轉錄，限制炎癥反應，改善心肌組織再灌注后NR的現(xiàn)象。

綜上所述，止麻消痰活血湯可通過調(diào)控NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平，進而調(diào)控炎性因子水平，改善NR現(xiàn)象，并可抑制心臟重塑，改善心功能，具有一定的臨床參考價值。