藥材和飲片非法染色物檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展*

宋德芳，李 恒

（武漢藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，湖北 武漢 430075）

摻偽染色是中藥材和飲片存在的主要質(zhì)量問(wèn)題之一。不法生產(chǎn)企業(yè)為了提高藥材的品相，以次充好，以假充真，常對(duì)藥材進(jìn)行非法染色，以獲取暴利。藥材和飲片非法染色劑多為人工合成色素，其中偶氮類人工合成色素具有致癌、致突變毒性。因此，非法染色的假劣藥材（飲片）或由其投料生產(chǎn)的中成藥可能存在安全隱患。紅花、西紅花、朱砂、五味子、血竭、蒲黃等易染色品種及由其投料生產(chǎn)的中成藥多見中藥非法染色，其檢測(cè)方法主要有光譜法、色譜法、質(zhì)譜法及各種聯(lián)用技術(shù)，光譜法主要適用于快速檢測(cè)，色譜法、質(zhì)譜法主要適用于實(shí)驗(yàn)室定性及定量檢測(cè)。在此，綜述了近年來(lái)常見中藥非法染色品種、非法染色劑及非法染色檢測(cè)方法，為高通量、強(qiáng)專屬性、普適性染色檢測(cè)方法的研究提供依據(jù)。

1 常見染色品種及染色劑

非法染色研究主要集中在紅花[1-4]、西紅花[4-6]、朱砂[4-7]、血竭[4，6]、五味子[8]、丹參[3，8-9]、大黃[3，8]、蒲黃[3-4，10]、延胡索[3-4，6，11]、關(guān)黃柏[12]、黃連[4]、菟絲子[13]、烏梅[3-4，14]、何首烏[3]、人工牛黃[15]等易染色品種及由其投料生產(chǎn)的中成藥，如千金止帶丸[2]、跌打丸[16]、蛤蚧定喘丸[17]、天王補(bǔ)心丸[18]等。常用染色劑有黃色系（金胺O、檸檬黃、日落黃、皂黃、金橙Ⅱ等）、紅色系（酸性紅73，胭脂紅，偶氮玉紅，赤蘚紅，莧菜紅，808猩紅，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，新品紅等）等合成色素。中藥常見染色品種及其常見染色劑見表1。

2 非法染色檢測(cè)方法

2.1 光譜法

2.1.1 拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)（SERS）在色素快檢技術(shù)領(lǐng)域有較多的應(yīng)用。中藥染色檢測(cè)多采用表面噴有銀溶膠的薄層板或用浸泡法制備的銀膠紙作為SERS的基底，將乙醇或乙醇-水溶液濕潤(rùn)的藥材（飲片）按壓或擦拭在表面噴有銀溶膠的薄層板上或銀膠紙上，對(duì)按壓或擦拭區(qū)域進(jìn)行SERS檢測(cè)，此方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏、無(wú)損，可滿足現(xiàn)場(chǎng)快檢的需求。張彬彬等[19]利用薄層色譜-SERS成功檢測(cè)經(jīng)金胺O、新品紅、檸檬黃和胭脂紅4種常見染料染色的西紅花藥材。李丹等[20]利用紙基-SERS成功檢測(cè)經(jīng)甲基紅、堿性品紅、金胺O和對(duì)氨基偶氮苯4種常見染料染色的紅花藥材。張國(guó)慶等[21]采用紙基-SERS成功檢測(cè)經(jīng)低濃度酸性紅、赤蘚紅染色的南五味子。

表1 中藥常見染色品種及常見染色劑Tab.1 Synthetic pigments and its varieties frequently used in herbal medicines

SERS法為染色中藥材的鑒別及中藥材質(zhì)量監(jiān)督提供了一種新的快速、可靠的分析方法。潤(rùn)濕劑的濃度、銀溶膠的噴灑時(shí)間和噴灑量是薄層色譜-SERS需考察優(yōu)化的重點(diǎn)；銀溶膠的濃縮倍數(shù)、銀膠紙的SERS增強(qiáng)效果及穩(wěn)定性是紙基-SERS需考察的因素。

另外，顯微聚焦拉曼技術(shù)也用于中藥染色檢測(cè)，如李慶等[22]利用顯微拉曼技術(shù)快速、無(wú)損傷鑒別區(qū)分丹參表面染色物，但尚不能確定為哪種染色物質(zhì)。顯微聚焦拉曼技術(shù)具有快速、不損傷樣品、環(huán)境友好的特點(diǎn)，可為中藥材特別是貴細(xì)中藥材染色物的快速、無(wú)損傷判斷提供參考。

2.1.2 近紅外光譜法

近紅外光譜（NIRS）技術(shù)是近年來(lái)用于中藥鑒定的光譜分析技術(shù)之一，除具有無(wú)損、快速的優(yōu)點(diǎn)外，還可用于定量檢測(cè)。NIRS技術(shù)多與主成分分析、偏最小二乘回歸等分析方法聯(lián)合使用，以實(shí)現(xiàn)非法染色的快速檢測(cè)。劉攀顏等[1]的研究顯示，NIRS法鑒別紅花與染色紅花的結(jié)果與性狀鑒別和高效液相色譜法鑒別的結(jié)果一致，建立的NIRS方法可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出染色紅花，且能測(cè)定染料的含量；77份染色紅花中均檢出檸檬黃、胭脂紅、日落黃，表明購(gòu)于成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)的染色紅花主要添加了上述染料。

2.2 色譜法

2.2.1 薄層色譜（TLC）法

TLC法操作簡(jiǎn)單、快速、成本低，適用于非法染色的快速篩查。中藥非法染色薄層色譜篩查，多根據(jù)色素的溶解性質(zhì)采用不同的展開體系。李啟艷等[23]采用TLC法快速篩查中藥中的29種非法添加色素，以石油醚（60～90℃）-丙酮 -乙酸乙酯（100∶3∶4，V/V/V）為展開劑展開脂溶性色素，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水 -水（1∶3∶3∶1∶1，V/V/V/V/V）為展開劑展開水溶性色素，在可見光下檢視，各色素分離效果較好，Rf值均在理想范圍內(nèi)。

對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜、需進(jìn)行多組分篩查的樣品，可采用二次展開，使各個(gè)目標(biāo)色素達(dá)到較好的分離。如于亞男等[9]采用TLC法二次展開的同時(shí)鑒別丹參中非法添加的9種黃色合成色素，結(jié)果10批丹參樣品中有1批檢出金橙Ⅱ，2批樣品檢出金胺O。對(duì)于常規(guī)染色定性篩查，TLC法不失為一種經(jīng)典實(shí)用的初篩方法。

2.2.2 液相色譜法

液相色譜法在中藥非法染色檢測(cè)中應(yīng)用較普遍，通過(guò)比較樣品和對(duì)照品的保留時(shí)間、紫外可見吸收光譜的一致性進(jìn)行判斷。樣品提取溶劑根據(jù)色素的極性和酸堿性而異，提取溶劑多采用低濃度或高濃度乙醇、70%甲醇或甲醇、乙腈-甲醇混合溶液、含酸或含堿的甲醇（乙醇或乙腈）溶液，流動(dòng)相多采用甲醇/乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液。

李啟艷等[5]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）法同時(shí)測(cè)定-中藥材中非法添加的20種常用紅色及橙色系人工合成色素，于市售西紅花、朱砂樣品中檢出酸性橙Ⅱ及808猩紅。

胡立立等[24]建立了同時(shí)測(cè)定丹參中9種黃色合成色素的HPLC法，10批丹參藥材中1批檢出檸檬黃和日落黃，1批檢出金胺O。

任榮軍等[25]建立了陰離子交換固相萃取-高效液相色譜法快速測(cè)定中成藥中10種合成色素的方法，樣品用70%乙醇超聲提取，經(jīng)陰離子交換固相萃取去除大部分基質(zhì)干擾，可用于中成藥中莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、赤蘚紅、酸性紅73、新品紅、羅丹明B、蘇丹紅Ⅰ、808猩紅、蘇丹紅Ⅳ10種合成色素的檢測(cè)。

此外，超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-DAD）技術(shù)的引入，極大地縮短了分析時(shí)間，提高了分離效能。羅鐳等[11]采用UPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定延胡索和紅花中28種人工合成色素，2批延胡索檢出金胺O。與常規(guī)HPLC法相比，UPLC法分離效率更高，分析時(shí)間更短，溶劑用量更少，且峰型尖銳，理論板數(shù)高。

2.2.3 其他

康帥等[15]將中藥傳統(tǒng)性狀鑒定與體式顯微和光學(xué)顯微技術(shù)相結(jié)合，鑒定并報(bào)道了一種新發(fā)現(xiàn)的牛黃偽品，采用HPLC-DAD法和高效液相色譜 -質(zhì)譜（HPLC-MS）法進(jìn)行確證。結(jié)果表明，牛黃與該偽品在層紋的斷面特征及顆粒狀團(tuán)塊的顯微特征2個(gè)方面均有差異。偽品主要以淀粉和色素混合制作而成，摻有金胺O、皂黃、金橙Ⅱ、檸檬黃、胭脂紅5種染色物。

2.3 質(zhì)譜法及聯(lián)用技術(shù)

2.3.1 基于選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)

該方法將UPLC的高速、高分離度與串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度相結(jié)合，具有通用性強(qiáng)、選擇性好、靈敏度高、便捷、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。

朱日然等[6]建立了UPLC-MS/MS法，同時(shí)測(cè)定中藥材及飲片中可能添加的29種合成著色劑；采用SRM模式用于定量分析，測(cè)定30批市售紅花、血竭、朱砂、延胡索等樣品，結(jié)果血竭中檢出蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅳ，朱砂中檢出蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅱ、胭脂紅、堿性橙21，藏紅花中檢出胭脂紅、日落黃、橙黃G，延胡索中檢出金胺O。

鄧欣等[26]采用基于MRM的正、負(fù)離子切換采集模式檢測(cè)30種人工色素及其中的3對(duì)同分異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)了理想的分離和定性定量分析。

徐昱婷等[27]采用UPLC-電噴霧電離（ESI）-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了在4 min內(nèi)快速篩選并確證中藥材（飲片）中非法添加的6種水溶性紅色素（日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、新品紅、酸性紅73）的通用方法。

此外，藥用輔料的非法染色也有報(bào)道。趙海云等[28]建立了藥用明膠空心膠囊樣品中22種合成色素的超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜定量分析方法，146批次樣品中，檸檬黃與亮藍(lán)檢出率均較高，有15批次樣品檢出禁用的合成色素堅(jiān)牢綠。雖然明膠空心膠囊作為藥用輔料可加入著色劑，但目前尚無(wú)藥用級(jí)著色劑的品種、限量要求和相關(guān)法定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)引起重視。

2.3.2 基于一級(jí)、二級(jí)掃描模式的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

目標(biāo)化合物的定性鑒定，基于與對(duì)照品保留時(shí)間窗口（RTW）、特征離子的精確質(zhì)量和二級(jí)碎片（MS2）離子等信息進(jìn)行比對(duì)，該方法高效、準(zhǔn)確，適用于一般中藥材的非法染色色素快速篩查定性。

胡青等[29]基于快速液相-四級(jí)桿串聯(lián)高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-QTOF）技術(shù)，建立了中藥非法染色的50種色素高通量定性檢測(cè)方法。脂溶性色素和堿性色素為正離子采集模式，酸性色素為負(fù)離子采集模式。宜采用空白基質(zhì)加標(biāo)進(jìn)行平行對(duì)照，以避免假陰性。

茍琰等[4]對(duì)胭脂紅等38種已有或可能的染色摻假物質(zhì)分別依次進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）、QTOF分析，結(jié)合MassHunterPCDL軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，建立了通過(guò)軟件自動(dòng)篩選出可疑染色摻假物質(zhì)的非法染色篩查方法，快速篩查驗(yàn)證了200余批紅花、西紅花、血竭等20種中藥材及飲片的摻假物質(zhì)，對(duì)于各種藥材及飲片基本實(shí)現(xiàn)通用，有效識(shí)別了補(bǔ)充檢驗(yàn)方法未收載的染色摻假物質(zhì)，驗(yàn)證了快速篩查方法的可行性。該質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)有開放性的特點(diǎn)，可不斷更新和完善，以應(yīng)對(duì)未來(lái)更加復(fù)雜的染色行為。

2.3.3 電噴霧高效離子遷移譜法及聯(lián)用技術(shù)

電噴霧高效離子遷移譜法（ESI-HPIMS）通過(guò)比較樣品與對(duì)照品遷移時(shí)間的一致性，判斷樣品中是否有色素的非法染色。李拓等[30]采用固相萃取-電噴霧高效離子遷移譜法，建立了快速檢測(cè)紅花中檸檬黃、日落黃、金橙Ⅱ、誘惑紅并進(jìn)行定量測(cè)定的方法。焦建東等[31]采用離子遷移譜技術(shù)，建立中藥材中金胺O、莧菜紅、日落黃非法染色的快速檢測(cè)方法。

3 小結(jié)

中藥非法染色色素品種在不斷變化，現(xiàn)有補(bǔ)充檢驗(yàn)方法已不能完全滿足日常監(jiān)督檢驗(yàn)的需求。中藥非法染色問(wèn)題日益突出，主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方向：1）染色中藥品種的多樣性。中藥材、中藥飲片及由其投料生產(chǎn)的中成藥都可能成為非法染色的對(duì)象。2）染色劑種類的多樣性。市面上中藥非法染色劑的種類繁多、成分復(fù)雜，主要為黃色系、紅色系、黑色系等人工合成色素，尤以黃色系、紅色系染色劑最常見。3）非法染色手段的復(fù)雜性。新的染色劑種類和手段層出不窮，繼國(guó)家相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)公布后，中藥非法染色出現(xiàn)了新的變化，出現(xiàn)規(guī)避標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定色素品種、多種色素配色染色等趨勢(shì)，給市場(chǎng)監(jiān)管及日常監(jiān)督檢驗(yàn)帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。

為了應(yīng)對(duì)復(fù)雜的中藥非法染色檢測(cè)需求，建立普適性、高通量、靈敏、準(zhǔn)確的中藥非法染色檢測(cè)方法非常必要。由于色素極性、酸堿性的不同，難以在一個(gè)體系完成分離分析。有專家建議結(jié)合近年來(lái)染色研究實(shí)際經(jīng)驗(yàn)和大數(shù)據(jù)，整合、優(yōu)化資源，建立染色色素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)按可能添加色素的色系進(jìn)行分組，建立以TLC法、HPLC法和液質(zhì)聯(lián)用法相結(jié)合的通用檢測(cè)方法[2]。既可提高檢測(cè)效率，又可避免重復(fù)研究造成的資源浪費(fèi)；同時(shí)該數(shù)據(jù)庫(kù)可不斷更新完善，及時(shí)添加新發(fā)現(xiàn)的色素，能更好地應(yīng)對(duì)復(fù)雜的非法染色手段，為有效打擊染色摻偽行為，加強(qiáng)服務(wù)監(jiān)管和保障民生用藥安全提供技術(shù)支持。